Medición del receptor de complemento de eritrocitos 1 mediante citometría de flujo
Summary
El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Receptor De complemento tipo 1 para C3b/C4b) es una glicoproteína de membrana de alto peso molecular de unos 200 kDa que controla la activación de complemento, transporta complejos inmunológicos y participa en respuestas inmunitarias humorales y celulares. CR1 está presente en la superficie de muchos tipos de células, incluyendo eritrocitos, y exhibe polimorfismos en longitud, estructura (Knops, o KN, grupo sanguíneo), y densidad. La densidad media de CR1 por eritrocitos (CR1/E) es de 500 moléculas por eritrocitos. Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Presentamos aquí un método de citometría de flujo robusto para medir la densidad de CR1/E, incluso en sujetos que expresan una baja densidad, con la ayuda de un sistema de inmunomancha amplificante. Este método nos ha permitido mostrar la disminución de la expresión de eritrocitos CR1 en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer (AD), el lupus eritematoso sistémico (LES), el SIDA o la malaria.
Introduction
CR1 (receptor de complemento tipo 1, CD35) es una glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente en la superficie de muchos tipos de células, tales como eritrocitos1, linfocitos B2, células monocíticas, algunas células T, células dendríticas foliculares3, astrocitos fetales4,y podocitos glomerulares5. CR1 interfiriendo con sus ligandos C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una subunidad del primer componente de complemento, C1q10 y MBL (lectina de unión al mannan)11 inhibe la activación del complemento y participa en la respuesta inmune humoral y celular.
En primates, incluidos los humanos, eritrocitos CR1 participa en el transporte de complejos inmunes al hígado y al bazo, para purificar la sangre y prevenir su acumulación en tejidos vulnerables como la piel o los riñones12,,13,,14. Este fenómeno de adhesión inmune entre complejos inmunes y eritrocitos depende del número de moléculas CR115. En los seres humanos, la densidad media de CR1/E es de sólo 500 (es decir, 500 moléculas de CR1 por eritrocitos). Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Algunos individuos de fenotipo “nulo” expresan menos de 20 CR1/E16.
La densidad de CR1/E está regulada por dos alelos autosómicos codominantes vinculados a una mutación puntual en el intrón 27 de la codificación genética para CR1*117,,18. Esta mutación produce un sitio de restricción adicional para la enzima HindIII. Los fragmentos de restricción obtenidos después de la digestión con HindIII en este caso son 7,4 kb para el alelo vinculado a una fuerte expresión de CR1 (H: alelo alto) y 6,9 kb para el alelo vinculado a la expresión baja de CR1 (L: alelo bajo). Este enlace se encuentra en los caucásicos y asiáticos, pero no en las personas de ascendencia africana19.
El nivel de expresión de eritrocitos CR1 también está correlacionado con la presencia de mutaciones de nucleótidos puntuales en el exón 13 codificando SCR 10 (I643T) y en el exón 19 codificando SCR16 (Q981H). Es alto en individuos homocigotos 643I/981Q y bajos en individuos homocigotos 643T/981H20. Por lo tanto, los individuos “bajos” expresan alrededor de 150 CR1/E, los individuos “medios” expresan alrededor de 500 individuos CR1/E, y los individuos “altos” expresan alrededor de 1,000 CR1/E.
Además de este polimorfismo de densidad de eritrocitos, CR1 se caracteriza por un polimorfismo de longitud correspondiente a cuatro alotipos de diferentes tamaños: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) y CR1*4 (250 kDa)21 y un polimorfismo antigénico correspondiente al grupo sanguíneo KN22.
Presentamos nuestro método basado en la citometría de flujo para determinar la densidad de CR1/E. Utilizando tres sujetos cuya densidad CR1/E se conoce, expresando un nivel de baja densidad (180 CR1/E), un nivel de densidad media (646 CR1/E) y un nivel de densidad alto (966 CR1/E), es fácil medir la intensidad media de fluorescencia (MFI) de sus eritrocitos o glóbulos rojos (RBC), o RBC MFI, después de la inmunomancha anti-CR1 utilizando un citómetro de flujo. A continuación, se puede trazar una línea estándar que representa la IMF en función de la densidad CR1/E. La medición de la IMF de sujetos cuya densidad CR1/E no se conoce y compararla con esta línea estándar, es posible determinar la densidad CR1/E de los individuos. Esta técnica se ha utilizado durante muchos años en el laboratorio, y nos ha permitido detectar una reducción en la expresión de eritrocitos CR1 en muchas patologías como el lupus eritematoso sistémico (LES)23, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)24, malaria25,y recientemente la enfermedad de Alzheimer (AD)26,27. El desarrollo de fármacos dirigidos a CR1 a la pareja de eritrocitos, como en el caso de los fármacos antitrombóticos28 requiere la evaluación de la densidad CR1/E, y la disponibilidad de una técnica robusta para cuantificar CR1.
El protocolo presentado se ejecuta en singlicado. Es adaptable para determinar la densidad de CR1/E en muchas personas utilizando 96 placas de pozo disponibles comercialmente específicas (ver Tabla de Materiales). Para ello, es fácil adaptar nuestro método a cualquier placa de pozo 96. Para cada muestra, se distribuye una suspensión celular de eritrocitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrocitos) por pocto. Para cada pozo, primero se añade el anticuerpo primario anti-CR1, luego la estreptavidina PE, el anticuerpo secundario anti-estreptavidina, y de nuevo la estreptavidina PE, utilizando las mismas diluciones que las de nuestro método, pero adaptando los volúmenes y respetando la proporcionalidad.
Las muestras de sangre de los sujetos de la gama y de los sujetos que deben cuantificarse para CR1 deben extraerse al mismo tiempo, almacenarse en el frigorífico a 4 oC y manipularse a 4 oC (sobre hielo y/o en el frigorífico).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varias técnicas disponibles para determinar la densidad del eritrocito CR1 (CR1/E). Las primeras técnicas utilizadas fueron la aglutinación de glóbulos rojos por anticuerpos anti-CR131 y la formación de rosetas en presencia de eritrocitos recubiertos con C3b32. Estas técnicas rudimentarias fueron rápidamente reemplazadas por métodos de inmunomancha utilizando anticuerpos radiomarcados anti-CR11,33. Tambi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros de la URCACyt, plataforma técnica de citometría de flujo, el personal del Departamento de Inmunología, y el personal del Departamento de Medicina Interna y Geriatría, que contribuyeron a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue financiado por los hospitales universitarios de Reims (número de subvención AOL11UF9156).
Materials
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
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