Målet med denne metoden er å bestemme CR1 tetthet i erytrocytter av ethvert emne ved å sammenligne med tre hvis erytrocytt CR1 tetthet er kjent. Metoden bruker flow cytometri etter immunfarging av forsøkspersonenes erytrocytter av et anti-CR1 monoklonalt antistoff koblet til et forsterket system ved hjelp av phycoerythrin (PE).
CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) er en høy molekylvekt membran glykoprotein på ca 200 kDa som styrer komplement aktivering, transporterer immunkomplekser, og deltar i humoral og cellulær immunresponser. CR1 er til stede på overflaten av mange celletyper, inkludert erytrocytter, og viser polymorfismer i lengde, struktur (Knops, eller KN, blodgruppe) og tetthet. Den gjennomsnittlige tettheten av CR1 per erytrocytt (CR1/E) er 500 molekyler per erytrocytt. Denne tettheten varierer fra ett individ til en annen (100–1200 CR1/E) og fra en erytrocytt til en annen i samme person. Vi presenterer her en robust flytcytometrimetode for å måle tettheten av CR1/E, inkludert hos personer som uttrykker lav tetthet, ved hjelp av et forsterkende immunfargingssystem. Denne metoden har gjort oss i stand til å vise senking av CR1 erytrocytt uttrykk i sykdommer som Alzheimers sykdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), AIDS, eller malaria.
CR1 (komplement reseptor type 1, CD35) er en 200 kDa transmembrane glykoprotein tilstede på overflaten av mange celletyper, for eksempel erytrocytter1, B lymfocytter2, monocytiske celler, noen T-celler, follikulære dendrittiske celler3, fosterastrocytter4, og glomerulære podocytes5. CR1 forstyrrer sin ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, en underenhet av den første komplementkomponenten, C1q10 og MBL (mannanbindende lectin)11 hemmer aktiveringen av komplement og er involvert i humoral og cellulær immunrespons.
I primater, inkludert mennesker, erytrocytt CR1 involvert i transport av immunkomplekser til lever en og milt, for å rense blodet og forhindre akkumulering i sårbare vev som hud eller nyrer12,13,14. Dette fenomenet immunvedhesjon mellom immunkomplekser og erytrocytter avhenger av antall CR1 molekyler15. Hos mennesker er gjennomsnittlig tetthet av CR1/E bare 500 (dvs. 500 molekyler av CR1 per erytrocytt). Denne tettheten varierer fra ett individ til en annen (100–1200 CR1/E) og fra en erytrocytt til en annen i samme person. Noen individer av “null” fenotype uttrykker færre enn 20 CR1/E16.
Tettheten av CR1/E reguleres av to co-dominerende autosomale alleler knyttet til en punktmutasjon i intron 27 av genkodingen for CR1 * 117,18. Denne mutasjonen gir et ekstra restriksjonssted for HindIII-enzymet. Begrensningsfragmentene oppnådd etter fordøyelsen med HindIII i dette tilfellet er 7,4 kb for allelen knyttet til et sterkt uttrykk for CR1 (H: høy allele) og 6,9 kb for allelen knyttet til lavt CR1-uttrykk (L: lav allele). Denne linken finnes i kaukasiere og asiater, men ikke hos personer av afrikansk avstamning19.
Uttrykket av erytrocytt CR1 er også korrelert med tilstedeværelsen av punkt nukleotid mutasjoner i exon 13 koding SCR 10 (I643T) og i exon 19 koding SCR16 (Q981H). Det er høyt i homozygot 643I/981Q og lav i homozygot 643T/981H individer20. Dermed uttrykker “lave” individer rundt 150 CR1 / E, “medium” individer uttrykker rundt 500 CR1 / E, og “høye” individer uttrykker rundt 1000 CR1 / E.
I tillegg til denne erytrocytttettheten polymorfisme, er CR1 preget av en lengde polymorfisme som tilsvarer fire allotyper av forskjellige størrelser: CR1* 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), og CR1 * 4 (250 kDa)21 og en antigen polymorfisme tilsvarende blodgruppen KN22.
Vi presenterer vår metode basert på flow cytometri for å bestemme tettheten av CR1 /E. Ved hjelp av tre med CR1/E tetthet er kjent, uttrykker et lavt tetthetsnivå (180 CR1/E), et middels tetthetsnivå (646 CR1/E) og et høyt tetthetsnivå (966 CR1/E), er det lett å måle gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av deres erytrocytter eller røde blodlegemer (RBC), eller RBC MFI, etter anti-CR1 immunfarging ved hjelp av et strømningscytometer. Man kan deretter tegne en standardlinje som representerer MFI som en funksjon av CR1/E-tetthet. Måling av MFI av personer med CR1/E tetthet ikke er kjent og sammenligne den med denne standardlinjen, er det mulig å bestemme individets CR1/E tetthet. Denne teknikken har blitt brukt i mange år i laboratoriet, og har gjort oss i stand til å oppdage en reduksjon i uttrykket av erytrocytt CR1 i mange patologier som systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Ervervet immunsvikt syndrom (AIDS)24, malaria25, og nylig Alzheimers sykdom (AD)26,27. Utviklingen av legemidler rettet mot CR1 til par med erytrocytter, som i tilfelle av antitrombotiske legemidler28 krever evaluering av CR1 / E tetthet, og tilgjengeligheten av en robust teknikk for å kvantifisere CR1.
Protokollen som presenteres går i singlicate. Det kan tilpasses til å bestemme tettheten av CR1/E på mange personer som bruker spesifikke kommersielt tilgjengelige 96 brønnplater (se Materialtabellen). For dette formål er det lett å tilpasse vår metode til en hvilken som helst 96 brønnplate. For hver prøve fordeles en cellesuspensjon av erytrocytter (0,5 x 106–1 x 106 erytrocytter) per brønn. For hver brønn, først den primære anti-CR1 antistoff legges til, deretter streptavidin PE, sekundær anti-streptavidin antistoff, og igjen streptavidin PE, ved hjelp av de samme fortynninger som de av vår metode, men ved å tilpasse volumer og respektere proporsjonalitet.
Blodprøvene fra personer i området og fra forsøkspersoner som skal kvantifiseres for CR1 skal trekkes samtidig, oppbevares i kjøleskapet ved 4 °C, og håndteres ved 4 °C (på is og/eller i kjøleskapet).
Flere teknikker er tilgjengelige for å bestemme tettheten av erytrocytt CR1 (CR1/E). De første teknikkene som ble brukt var agglutinering av røde blodlegemer ved anti-CR1 antistoffer31 og dannelsen av rosetter i nærvær av erytrocytter belagt med C3b32. Disse rudimentære teknikkene ble raskt erstattet av immunflekker metoder ved hjelp av radiomerkede anti-CR1 antistoffer1,33. Det er også mulig å måle konsent…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmene av URCACyt, flow cytometri teknisk plattform, de ansatte ved Department of Immunology, og de ansatte ved Institutt for indremedisin og geriatriske, som bidro til å optimalisere og validere protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av Reims Universitetssykehus (stipendnummer AOL11UF9156).
1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
Blouse | protection | ||
Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |