JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Измерение эритроцитов дополнение рецептор ато 1 Использование потока цитометрии

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Целью данного метода является определение плотности CR1 в эритроцитах любого предмета путем сравнения с тремя предметами, плотность которых известна плотность эритроцита CR1. Метод использует цитометрию потока после иммуностоцинирования эритроцитов испытуемых моноклональным антителом, в сочетании с усиленной системой с использованием фикоэритрина (ПЭ).

Abstract

CR1 (CD35, Дополнение Рецептор типа 1 для C3b/C4b) представляет собой большой молекулярный вес мембраны гликопротеин около 200 kDa, который контролирует дополнение активации, транспортирует иммунные комплексы, и участвует в гуморальных и клеточных иммунных реакций. CR1 присутствует на поверхности многих типов клеток, в том числе эритроцитов, и экспонаты полиморфизмов в длину, структуру (Knops, или KN, группа крови), и плотность. Средняя плотность CR1 на эритроцит (CR1/E) составляет 500 молекул на эритроцит. Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Мы представляем здесь надежный метод цитометрии потока для измерения плотности CR1/E, в том числе в субъектах, выражающих низкую плотность, с помощью усиливающейся системы иммуностоинга. Этот метод позволил нам показать снижение экспрессии ЭРитроцита CR1 при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера (АД), системная волчанка эритематоза (СКВ), СПИД или малярия.

Introduction

CR1 (дополнение рецептора типа 1, CD35) является 200 kDa трансмембранного гликопротеина присутствует на поверхности многих типов клеток, таких как эритроциты1, B лимфоцитов2, моноцитные клетки, некоторые Т-клетки, фолликулярные дендритные клетки3, фетальные астроциты4, и glomerular podocytes5. CR1 вмешиваясь в его лиганды C3b, C4b, C3bi6,,7,,8,9, подразделение первого компонента дополнения, C1q10 и MBL (манна-связывающий лектин)11 подавляет активацию дополнения и участвует в гуморальном и клеточном иммунном ответе.

У приматов, в том числе людей, эритроцит CR1 участвует в транспортировке иммунных комплексов в печень и селезенку, очищает кровь и предотвращает их накопление в уязвимых тканях, таких как кожа или почки12,13,14. Это явление иммунной адгезии между иммунными комплексами и эритроцитами зависит от количества молекул CR115. У человека средняя плотность CR1/E составляет всего 500 (т.е. 500 молекул CR1 на эритроцит). Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Некоторые лица “нулевой” фенотип выразить менее 20 CR1/E16.

Плотность CR1/E регулируется двумя содоминирующими аутосомными аллелями, связанными с точечной мутацией в интронном 27 кодирования гена для CR1’117,18. Эта мутация создает дополнительный узел ограничения для фермента HindIII. Фрагменты ограничения, полученные после пищеварения с HindIII в данном случае 7,4 кб для аллеля, связанного с сильным выражением CR1 (H: high allele) и 6,9 кб для аллеля, связанного с низким выражением CR1 (L: низкий аллель). Эта связь встречается у кавказцев и азиатов, но не у людей африканского происхождения19.

Уровень экспрессии эритроцита CR1 также коррелирует с наличием точечных нуклеотидных мутаций в экзоне 13 кодирования SCR 10 (I643T) и в экзоне 19 кодирования SCR16 (981H). Он высок в гомозиготных 643I/981 “и низкий в гомозиготных 643T/981H лиц20. Таким образом, “низкие” лица выражают около 150 CR1/E, “средние” лица выражают около 500 CR1/E, а “высокие” лица выражают около 1000 CR1/E.

В дополнение к этому полиморфизму плотности эритроцита, CR1 характеризуется полиморфизмом длины, соответствующим четырем аллотипам разных размеров: CR1’1 (190 kDa), CR1’2 (220 kDa), CR1’3 (160 kDa) и CR1’4 (250 kDa)21 и антигенийский антигенныйантигенистый антигенный антигенный антиген.

Мы представляем наш метод, основанный на цитометрии потока, чтобы определить плотность CR1/E. Используя три предмета, плотность которых известна как CR1/E, выражая низкий уровень плотности (180 CR1/E), средний уровень плотности (646 CR1/E), и высокий уровень плотности (966 CR1/E), легко измерить среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) их эритроцитов или красных кровяных телец (РБК) Затем можно построить стандартную линию, представляющую МФО в зависимости от плотности CR1/E. Измеряя МФО субъектов, плотность CR1/E не известна, и сравнивая ее с этой стандартной линией, можно определить плотность CR1/E. Этот метод был использован в течение многих лет в лаборатории, и позволило нам обнаружить снижение экспрессии эритроцитов CR1 во многих патологиях, таких как системная волчанка эритематоза (СКВ)23, Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)24, малярия25, и недавно болезнь Альцгеймера (AD)26,27. Разработка препаратов, нацеленных на CR1 в паре с эритроцитами, как и в случае антитромботических препаратов28 требует оценки плотности CR1/E, а также наличия надежной техники количественной оценки CR1.

Представленный протокол проходит в singlicate. Он адаптируется для определения плотности CR1/E на многих людей, использующих конкретные коммерчески доступные 96 пластин скважин (см. Таблицу Материалов). С этой целью, это легко адаптировать наш метод к любой 96 хорошо пластины. Для каждого образца на один колодец распределяется клеточная суспензия эритроцитов (0,5 х 106-1 х 106 эритроцитов). Для каждого колодца сначала добавляются первичные анти-CR1 антитела, затем стрептавидин ПЭ, вторичное антиорганизмы против стрептавидина, и снова стрептавидиновые ПЭ, использующие те же разбавления, что и наш метод, но путем адаптации объемов и соблюдения пропорциональности.

Образцы крови, взятые у субъектов диапазона и от предметов, которые должны быть количественно оценены для CR1, должны быть взяты в то же время, храниться в холодильнике при 4 градусах Цельсия и обрабатываться при 4 градусах Цельсия (на льду и/или в холодильнике).

Protocol

Протокол по сбору и обработке крови человека был рассмотрен и утвержден региональным комитетом по этике (CPP Est II), а протоколномер 2011-A00594-37. Поскольку в следующем протоколе описывается обработка человеческой крови, должны соблюдаться институциональные руководящие принципы по утилизаци…

Representative Results

Эритроциты трех субъектов, плотность которых CR1 известна (“низкий” предмет (180 CR1/E), “средний” предмет No646 CR1/E и “высокий” предмет No 966 CR1/E), а также двух субъектов, плотность CR1 которых должна была быть определена иммунопрепаратами, примыкающих к флюторной системе. В начале плотность CR1 испытуе…

Discussion

Несколько методов доступны для определения плотности эритроцита CR1 (CR1/E). Первыми методами были агглютинация красных кровяных телец анти-CR1 антител31 и образование розетов в присутствии эритроцитов, покрытых C3b32. Эти рудиментарные методы были быстро заменены им…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим всех членов URCACyt, тет-цитометрии технической платформы, сотрудников кафедры иммунологии, а также сотрудников кафедры внутренней медицины и гериатрии, которые внесли свой вклад в оптимизацию и проверку протокола. Эта работа финансировалась больницами Университета Реймса (грант AOL11UF9156).

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer’s Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

ErythrocyteComplement Receptor 1Flow CytometryCell Receptor DensityImmunostainingBiotinylated AntibodyStreptavidin Phycoerythrin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image