Summary
Formålet med denne protokol er at vurdere, om forskellige kunstige tåreformuleringer kan beskytte humane hornhinde epitelceller mod udtørring ved hjælp af en in vitro-model. Efter udsættelse for kunstige tåreformuleringer og udtørring vurderes humane hornhinde epitelceller for metabolisk aktivitet.
Abstract
Kunstig lipid-holdige tåre formuleringer er udviklet til at reducere tåre fordampning ved restaurering af en mangelfuld tåre lipid lag. Kunstige tåreformuleringer, der forhindrer celleaftørring, vil resultere i okulær overfladebeskyttelse og vedligeholdelse af cellemetabolisk aktivitet. Under dehydrering gennemgår celler processen med tab af metabolisk aktivitet og efterfølgende celledød. Dette arbejde beskriver en metode til vurdering af effekten af kunstige tåreformuleringer. Det metaboliske farvestof (dvs. alamarBlue) skifter fra et lavt fluorescerende molekyle resazurin til et fluorescerende molekyle resorufin i levedygtige celler. Den biologiske ydeevne af en kunstig tåre formulering måles som evnen til formuleringen til (a) opretholde celle levedygtighed og (b) give cellebeskyttelse mod udtørring. Vækstmedier og saltvand bruges som styringer til celledygtigheds-/udtørringstestene. Celler inkuberes med testopløsninger i 30 minutter og udtørres derefter i 0 eller 5 min ved 37 °C og 45% relativ luftfugtighed. Cellemetabolisk aktivitet efter første eksponering og efter celleaftørring bestemmes derefter. Resultaterne viser de komparative virkninger af øjendråbeformuleringer på cellemetabolisk aktivitet og udtørringsbeskyttelse. Denne metode kan bruges til at teste tørre øjenformuleringer, der er designet til at behandle personer med fordampningstørt øje.
Introduction
Mange forskellige ingredienser i fleredosis oftalmiske opløsninger er nødvendige for at opretholde stabilitet, pH, osmolaritet og effektivitet. Nogle kemikalier såsom konserveringsmidler eller overfladeaktive stoffer i okulære opløsninger kan dog forårsage skade på hornhindeepitelet1,2. Celle levedygtighed test ved hjælp af humane hornhinde epitelceller (HCEC) kan udføres for at vurdere de potentielle skader forårsaget af disse forskellige ingredienser i oftalmiske formuleringer. En af de in vitro-assays, der er særligt nyttige til vurdering af celleskader, er alamarBlue-analysen3. I denne analyse indeholder det metaboliske farvestof (dvs. alamarBlue) resazurin, der fungerer som en celles levedygtighedsindikator. Under cellulært åndedræt reduceres resazurin til resorufin ved at acceptere elektroner4. Reduktionen af resorufin forårsager en ændring fra et ikke-fluorescerende molekyle til et fluorescerende molekyle, der kan påvises ved hjælp af et spektrofluorometer5.
Denne undersøgelse bruger to forskellige behandlinger af hornhinde epitelceller til at bestemme, hvordan tørre øjne produkter kan udføre i en in vitro model. I den første evaluering behandles cellerne med disse produkter i 30 minutter. Efter behandling evalueres cellerne derefter for metabolisk aktivitet umiddelbart efter eksponering for tørre øjenprodukter og efter et restitutionstidsinterval. Denne vurdering bestemmer virkningen af disse produkter på celler før udtørring i et fugtighedskammer. Opløsningsbeskyttelsesmidler, overfladeaktive stoffer eller buffere i disse opløsninger kan have nogle cytotoksiske virkninger på cellerne, der kan påvises ved hjælp af det metaboliske farvestof.
Den anden evaluering bestemmer cellernes metaboliske aktivitet efter eksponering for tørre øjenprodukter og udtørring. Hvis produktbehandlingen i denne vurdering yder cellerne beskyttelse mod udtørringsskader, vil cellernes metaboliske aktivitet blive opretholdt. Cellebeskyttelse mod de skadelige virkninger af udtørring kan forekomme, hvis tørøjeproduktet kan belægge cellerne med lipider, eller produktet kan absorbere væske fra omgivelserne, der tilføjer fugt til cellerne.
Denne protokol er designet til at simulere alvorlige tilstande af miljøbelastning på celler. Andre undersøgelser har brugt forskellige modeller til at skabe denne eksterne stress. Nogle undersøgelser har tørret cellerne i laminar flow emhætter6,7,8, mens andre har brugt stuetemperatur og forskellige relative fugtighed (RH) værdier9,10,11. En metode til simulering af tørre øjenlidelser er at øge osmolariteten af inkubationsopløsningen12,13. En anden in vitro-metode til simulering af ugunstige miljøforhold er at tilføje cytokiner til cellemediet for at simulere tårevæsken hos patienter med tørre øjne14. Selvom disse tests er interessante modeller, der kan evaluere, hvordan kemikalier reducerer osmotisk stress eller stimulerer immunsystemet, viser disse modeller ikke direkte, hvordan kemiske formuleringer kan beskytte celler mod udtørringsstress.
Udtørringsmodellen bruger et temperatur-/fugtighedskammer 37 °C og 45% RH. Det simulerer miljøforhold, der kan forårsage fordampning fra okulær overflade. Simuleringer af andre ekstreme miljøforhold såsom lav luftfugtighed findes i flykabiner15 eller i indendørs miljøer i vintermånederne16 kan også udføres ved hjælp af denne metode.
Cellekultur modellering bruges til at simulere effekten af udtørring stress på den menneskelige hornhinde. For at detektere cellestress udføres der celledygtighedstest for at bestemme indvirkningen på cellesundheden. Flere forskellige fysiologiske tests kan udføres på celler for at afgøre, om de er stressede17. Den analyse, der udføres i denne testprocedure, anvender det kommercielt tilgængelige metaboliske farvestof (Tabel over materialer). Det har den fordel i forhold til mange andre celle stresstest i, at det er ikke-giftige, opløselige i vækst medier og kan evaluere celler uden celle fiksering18. I denne procedure testes cellerne for metabolisk aktivitet umiddelbart efter hver behandling, og et andet sæt celler placeres tilbage i vækstmedier og evalueres efter 18 timers genopretning. Årsagen til test straks og derefter efter en genopretningsperiode er at identificere celleskader, der forårsager øjeblikkelige virkninger på metabolisk aktivitet og celleskader, der forårsager forsinkede virkninger. Det giver også mulighed for at evaluere virkningen af disse formuleringer på kortsigtede versus langsigtede skader og formuleringernes evne til at komme sig / ikke komme sig efter den første fornærmelse.
Denne undersøgelse anvendes til at sammenligne forskellige lipidholdige tørre øjenprodukter for deres virkning på HCEC's metaboliske aktivitet med og uden udtørring. Ingredienserne i de testede tørøjeprodukter er beskrevet i Materialeoversigten. Ingredienserne i opløsning #1 er carboxymethylcellulose natrium (0,5%), glycerin (1%) og polysorbat 80 (0,5%), i opløsning, #2 de er let mineralsk olie (1,0%) og mineralsk olie (4,5%), og i opløsning #3 lipid er mineralsk olie og propylenglycol er demulcent. Disse lipider er de formuleringskomponenter, der forventes at yde beskyttelse af HCEC mod udtørring.
Protocol
1. Human hornhinde epitelcellekultur
- Der dyrkes udødeliggjort HCEC19 i kollagenbelagte 75 cm2 kolber med 20 ml Dulbeccos modificerede Eagle medium/næringsstofblanding F-12 (DMEM/F12), der indeholder 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: Rystelser er ikke påkrævet. - Skift mediet hver 2–3. dag.
2. Forberedelse af celler til testning
- Efter cellerne er næsten sammenflydende fjerne kultur medier.
- Der tilsættes 4,6 ml celleafledningsopløsning til hver 75 cm2 kolber. Cellerne inkuberes ved 37 °C, indtil cellerne løsnes (ca. 20−30 min.), og der kontrolleres periodisk under mikroskopet.
- Der tilsættes 2,6 mL DMEM/F12, der indeholder 10% FBS, til hver 75 cm2 kolbe.
- Kolbens indhold overføres til et centrifugerør på 50 mL.
- Centrifuge cellerne ved 450−500 x g i 5 min. Pipet supernatanten ud og genbrug cellerne i forvarmede medier.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Beregn den medievolumen, der indeholder i alt 1 x 105 celler.
- Tilføj 1 x 105 celler til hver brønd af en 48 godt kollagen-1 belagt kultur plade. Tilføj nok medier til brønden, så den endelige mængde medier i brønden er 0,5 mL kultur DMEM/F12 med 10% FBS.
BEMÆRK: En kunstig tåreformulering kan forårsage cytotoksicitet, der kan måles ved et fald i HCEC's metaboliske aktivitet. Dataenes konsistens afhænger af, at der tilsættes det samme antal HCEC til hver brønd ved såning. Den kulturkoncentration, der anbefales til 48 brøndplader, er 1 x 105. Da pattedyrsceller kan bosætte sig i centrifugerøret efter genbrug, anbefales det at genbruge cellerne ved agitation ofte, mens pladerne sås med celler, så celleaffjedringen har HCEC ligeligt fordelt. - Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
3. Ingen tørringsprotokol
- Kontrolprocedure
- Efter inkubationen på 24 timer fjernes dyrkningsmediet fra pladen.
- Straks behandles med 150 μL af en testformulering og mediestyringsopløsning.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 30 min.
- Fjern testopløsningerne fra cellerne.
- Tilsæt 0,5 ml 10% metabolisk farvestofopløsning for at teste for metabolisk aktivitet. Cellerne inkuberes i yderligere 4 timer ved 37 °C og 5% CO2.
- Efter inkubationsperioden på 4 timer fjernes 100 μL metabolisk farvestofopløsning fra hver brønd, og hver 100 μL anbringes i en brønd på en 96 brøndplade.
- Fluorescensen af hver brønd ved hjælp af en lysstofrørslæser(Materialetabel). Excitationsbølgelængden indstilles til 540 nm og emissionsbølgelængden til 590 nm.
- Ingen udtørringsprotokol (genoprettelsesprocedure)
- Gentag trin 3.1.1−3.1.4.
- Tilføj 0,5 mL DMEM/F12 medier til hver brønd.
- Et sæt kulturer inkuberes i 18 timer ved 37 °C og 5% CO2.
- Fjern mediet og tilsæt 0,5 ml 10% metabolisk farvestofopløsning. Gentag trin 3.1.6 og 3.1.7.
4. Protokol om tørring
- Kontrolprocedure
- Efter inkubationen på 24 timer (trin 2.8) fjernes dyrkningsmediet fra pladen.
- Straks behandles med 150 μL af en testformulering og mediestyringsopløsning.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 30 min.
- Fjern testopløsningerne fra cellerne.
- Cellerne anbringes i et 37 °C- og 45% RH-kammer i 5 minutter for at udtørre cellerne.
- Tilsæt 0,5 ml 10% metabolisk farvestofopløsning for at teste metabolisk aktivitet. Cellerne inkuberes i yderligere 4 timer ved 37 °C og 5% CO2.
- Efter inkubationsperioden på 4 timer fjernes 100 μL metabolisk farvestofopløsning fra hver brønd, og hver 100 μL anbringes i en brønd på en 96 brøndplade.
- Mål fluorescensen af hver brønd ved hjælp af en lysstofrørslæser. Excitationsbølgelængden indstilles til 540 nm og emissionsbølgelængden til 590 nm.
- Inddrivelsesprocedure
- Gentag trin 4.1.1-4.1.5.
- Tilføj 0,5 mL DMEM/F12 medier til hver brønd.
- Et sæt kulturer inkuberes i 18 timer ved 37 °C og 5% CO2.
- Fjern mediet og tilsæt 0,5 ml 10% metabolisk farvestofopløsning. Gentag trin 4.1.7 og 4.1.8.
5. Dataanalyse
- Beregn mediekontrolelementets gennemsnitlige fluorescens. Beregn stikprøvens procentvise levedygtighed ved hjælp af følgende formel:
Prøvens levedygtighed i procent = prøvens fluorescens/mediekontrol fluorescens x 100
BEMÆRK: Mediekontrolgennemsnittet er 100% levedygtigt. Det metaboliske farvestof i sig selv har en lille mængde fluorescens forbundet med det. Fluorescensen af det metaboliske farvestofreagens kan trækkes fra kontrol- og testprøvens fluorescens, inden testprøvernes levedygtighed beregnes, til mediekontrollen. - Udfør en normalitetstest og en test for lige varianser på kontrol- og testprøverne.
- Hvis normalitetstesten består, og afvigelserne er ens, skal du udføre en envejs ANOVA. For at identificere væsentlige forskelle mellem specifikke grupper skal du foretage en parvis sammenligning efter hoc-test (dvs. Tukey- eller Dunnetts flere sammenligningstest).
- Hvis normalitetstesten består, og afvigelserne er forskellige, skal du udføre Welch's ANOVA. For at identificere væsentlige forskelle mellem specifikke grupper udføres en parvis sammenligning efter hoc-test (dvs. Dunnetts eller Games-Howells test af flere sammenligninger).
- Hvis normalitetstesten ikke består, skal du bruge en ikke-parametertest (dvs. Kruskal-Wallis-testen). For at identificere væsentlige forskelle mellem specifikke grupper udfører en parvis sammenligning efter hoc-test (dvs. Dunns test).
Representative Results
Resultaterne af en undersøgelse, der sammenligner tre formuleringer af tørre øjne, er vist i figur 1. Dette tal viser, at der er forskelle i den virkning, som de tre produkter, løsnings- #1, løsning #2 og opløsning #3 (Tabel over materialer) har på HCEC's levedygtighed. Opløsning #1 og opløsning #2 haft en betydelig effekt på HCEC's metaboliske aktivitet før udtørring. Det betyder, at der er formuleringskomponenter i disse produkter, der kan forstyrre HCEC's metaboliske aktivitet. Det yderligere fald i cellemetabolisk aktivitet, der opstod efter 18 timers genvinding af celler, der blev udsat for opløsning, viser #1, at HCEC blev skadet i starten, og efter 18 timer blev skaden ikke repareret. Til sammenligning havde opløsning #3 kun en mild virkning på HCEC's metaboliske aktivitet.
Figur 2 viser effekten af disse lipidholdige tørre øjenformuleringer på cellebeskyttelse. Med en næsten 0% HCEC metabolisk aktivitet ved 18 timers restitutionsinterval, #1 opløsning og opløsning #2 ikke beskytte celler mod udtørring stress. Løsning #3, dog tilbudt en vis beskyttelse mod udtørring stress.
Figur 1: Effekten af forbedrede produkter med tørt øjelæbe på cellernes levedygtighed. Relativ levedygtighed målt ved HCEC metabolisk aktivitet efter behandling med lipidholdige tørre øjenprodukter. * = statistisk signifikans (p < 0,05) i forhold til opløsning #3, Δ = statistisk signifikans (p < 0,05) i forhold til mediekontrollen i den relevante genopretningsperiode. Højden på søjlen repræsenterer middelværdien, og fejllinjerne er SD. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Figur 2: Effekt af forbedrede produkter med tør øjenlæbe på udtørringsbeskyttelse. Effekt af lipidholdige tørre øjenformuleringer på cellebeskyttelse. Løsning #1 og opløsning #2 beskyttede ikke celler mod udtørringsstress, og de kom sig ikke efter udtørringseffekter over tid. I modsætning hertil #3 løsning tilbudt en vis beskyttelse mod udtørringsstress. * = p < 0,05 i forhold til opløsning #3, og Δ = p < 0,05 i forhold til ubehandlede (kontrol) medier for den relevante restitutionstid. Højden på søjlen repræsenterer middelværdien, og fejllinjerne er SD. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol er designet til at bestemme de beskyttende virkninger af kunstige tåreopløsninger mod celleaftørring. I første omgang udsættes cellerne for de tørre øjendråber for at belægge cellerne. Dernæst tørres cellerne, og den metaboliske aktivitet overvåges for at vurdere, om formuleringerne kan afbøde de skadelige virkninger af udtørringsstress. Disse trin er afgørende for at forstå den samlede indvirkning, som de tørre øjenformuleringer kan have på den samlede levedygtighed af hornhinde epitelceller.
Efter at de fleste af de tørre øjenformuleringer er fjernet fra kulturbrøndene, vil kemien i de resterende molekyler, der er i kontakt med cellerne, påvirke celleafledningen. Nogle produkter indeholder mikroemulsioner af olier, der minimerer cellefordampning20. En undersøgelse, der evaluerede friktionsanalyse efter skylning, viste opretholdelse af lav friktion for nogle tørre øjenformuleringer, som kan være en indikator for den forbedrede opholdstid for de tørre øjenformuleringer21. En af begrænsningerne ved denne analyse er, at selv om udtørringsbeskyttelse kan evalueres i forhold til andre øjendråbeformuleringer, kan varigheden af denne beskyttelse ikke bestemmes på grund af den korte tørretid, der vurderes. Længere tørretider i denne in vitro-analyse kan kræve brug af flerlagskulturer, der generelt har mere fugtindhold end en cellemonomer.
Det kan være nødvendigt at justere de specifikke inkubationstider for formuleringerne på cellerne og varigheden af tørretiden, hvis temperatur- og fugtighedsværdierne ændres. Valg af temperatur, RH og luftstrøm til simulering af miljøbelastningsforhold, der kan bidrage til tørre øjne, kan være svært, da de sæsonbestemte og lokale miljøforhold er ret variable21. Moderne miljøkamre til humane undersøgelser kan variere temperaturen mellem 5 °C og 35 °C og RH mellem 5% og 95%22. Ved hjælp af et evaporimeter og tæt monterede beskyttelsesbriller blev det fastslået, at fordampningshastigheden fra hornhinden ved RH på 40-45% var 0,037 μL/cm2/min.og ved RH på 20−25% var fordampningshastigheden 0,065 μL/cm2/min.23. Hvis in vitro-modellen ser på den beskyttende virkning af formuleringer under ekstremt lave RH-forhold som i fly15, ørkener eller tørre indendørs miljøer16, kan inkubationstider være nødvendigt at reducere for at imødekomme de forbedrede fordampningshastigheder fra cellerne. I den menneskelige tårevæske er en række lipider afledt af meibomian og andre kirtler til stede, der beskytter tårerne mod fordampning. Disse lipider har forskellige smeltepunkter24. Temperaturændringer kan påvirke tårevæskens fluiditet, så test, der udføres ved omgivelsestemperatur, kan have betydeligt forskellige fordampningshastigheder end test udført ved 37 °C. Da det gennemsnitlige okulære overfladetemperaturområde er fra 32,9 til 36 °C25, anbefales det at udføre testen i nærheden af dette temperaturområde.
Ud over det metaboliske farvestof (alamarBlue), der anvendes i denne protokol, er der andre kemiske reagenser, der kan bruges til at vurdere produktformuleringers virkninger på cellemetabolisk aktivitet. Tetrazoliumsalte (MTT, XTT, MTS, WST) er alternative kemikalier, der kan anvendes. Forskellen i tetrazoliumsalte er, at MTT er et positivt ladet molekyle, så det kan komme ind i cytoplasmaet af levende celler26. MTT bliver uopløselig efter dens reduktion med NAD(P)H27. Det skal opløses, før der aflæses absorbans på en pladelæser. De øvrige tetrazoliumsalte er negativt ladede28. De skal reduceres med sekundære molekyler uden for den levende celle, fordi de ikke kan komme ind i cellen og interagere direkte med intracellulære molekyler29. For XTT-, MTS- og WST-1-assays kan tilsætningen af et elektronkoblingsmiddel 1-methoxy phenazine methosulfat (PMS) forbedre assays30. I modsætning til de metaboliske assays, der bruger tetrazoliumsalte, kræver alamarBlue ikke yderligere opløselige eller elektronkoblingsmidler. I modsætning til XTT, MTS eller WST-1 trænger alamarBlue også ind i cellemembraner og kan reduceres direkte af cellulære enzymer27,29. Direkte sammenligning af alamarBlue med tetrazoliumsalte har vist , at alamarBlue er mere følsom over for vurdering af metabolisk aktivitet af forskellige cellelinjer , herunder HCEC3,27,31,32.
Andre biokemiske endpoints kan også overvejes til evaluering af beskyttelsen af humane hornhinde epitelceller ved udtørring. Fluorescerende farvestoffer kan anvendes til at detektere cellemembranpermeabilitet og celleesteraseaktivitet1. Apoptose kan også påvises ved farvning for apptotiske markører på celleoverfladen eller ved måling for caspase aktivitet1,33. Andre analysepunkter har bestemt virkningerne af oftalmiske produkter på HCEC-snævre kryds34. Disse analyser kunne indarbejdes i fremtidige vurderinger ved hjælp af de udtørringsprocedurer, der er beskrevet i denne artikel.
Der er mange årsager til tørre øjne. Tørre øjne kan være forårsaget af nedsat udskillelse af tårer, øget okulær overfladebetændelse eller øget dehydrering på okulær overflade. For de personer, der har fordampningsfri tørt øje brug af en tør øjendråbe, der forhindrer deres celler i at tørre under udtørring betingelser kan lindre symptomerne på tørre øjne. Et af problemerne i nogle tørre øjenformuleringer er tilstedeværelsen af konserveringsmidler, der kan skade okulær overflade. Skadeceller er ikke nyttigt at tørre øjenpatienter, da det kan forårsage flere celler til at dø som sårede celler er mere modtagelige for udtørring stress35.
En nylig gennemgang artikel af Garrigue et al.36 giver en vurdering af den nuværende viden om, hvordan lipid-baserede produkter handle for at afhjælpe fordampnings-tørre øjne. Tilføjelse lipider til lipid mangelfuld tårer kan forhindre fordampning, og dermed beskytte cellerne fra udtørring. Derudover er humectants molekyler, der tiltrækker og bevarer vand på okulær overflade37. Både glycerin i opløsning #1 og propylenglycol i opløsning #3 er humectants. Opløsning #3 viste en større beskyttende virkning af HCEC, der kan have været på grund af lipid og humectant egenskaber formuleringen ingredienser.
Denne protokol er designet til at evaluere HCEC's metaboliske aktivitet efter udsættelse for de tørre øjenformuleringer og for udtørringsstress. Ved at bruge de metoder, der er beskrevet i denne artikel, kan nye nonirriterende og beskyttende øjendråber udvikles til mennesker, der lider af fordampningstørt øje.
Disclosures
Tre forfattere (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) er ansatte i Alcon. Alcon er den eneste kilde til finansiering og sponsor af dette projekt. Lyndon W. Jones, i løbet af de sidste 3 år, har modtaget forskning støtte eller foredrag honoraria fra følgende selskaber: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J &J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass og Visioneering. Lyndon Jones er også konsulent og/eller sidder i et advisory board for Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis og Ophtecs. Følgende liste over forfattere har intet at afsløre: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.
Acknowledgments
Forfatterne takker Alcon for at yde økonomisk støtte til disse undersøgelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
- Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
- Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
- Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
- Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
- Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
- Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
- Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
- Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
- Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
- Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
- Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
- van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
- Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
- Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
- Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
- Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
- McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
- Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
- Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
- Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
- Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
- Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).
