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Medicine

Desiccation के संपर्क में आने के बाद मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि पर कृत्रिम आंसू योगों का प्रभाव

Published: May 2, 2020 doi: 10.3791/60812
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 2, 2
1Alcon Vision, LLC, 2Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह मूल्यांकन करना है कि क्या विभिन्न कृत्रिम आंसू योगों से मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं को इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके विलवणीकरण से बचाया जा सकता है। कृत्रिम आंसू योगों और desiccation के संपर्क में आने के बाद, मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं को मेटाबोलिक गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जाता है।

Abstract

कृत्रिम लिपिड युक्त आंसू योगों एक कमी आंसू लिपिड परत की बहाली से आंसू वाष्पीकरण को कम करने के लिए विकसित कर रहे हैं । कृत्रिम आंसू योगों कि सेल desiccation को रोकने के नेत्र सतह संरक्षण और सेल मेटाबोलिक गतिविधि के रखरखाव में परिणाम होगा । निर्जलीकरण के दौरान, कोशिकाओं को मेटाबोलिक गतिविधि के नुकसान और बाद में सेल मृत्यु की प्रक्रिया से गुजरना पड़ता है। यह काम कृत्रिम आंसू योगों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। मेटाबोलिक डाई (यानी, अलामारब्लू) कम फ्लोरोसेंट अणु रेसज़ुरिन से व्यवहार्य कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट अणु रिसोरुफिन में बदलता है। कृत्रिम आंसू निर्माण के जैविक प्रदर्शन को (क) कोशिका व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए निर्माण की क्षमता के रूप में मापा जाता है और (ख) विलवणीकरण से कोशिका सुरक्षा प्रदान करता है। विकास मीडिया और खारा सेल व्यवहार्यता/desiccation परीक्षणों के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए परीक्षण समाधान के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है और फिर 37 डिग्री सेल्सियस और 45% सापेक्ष आर्द्रता पर 0 या 5 मिनट के लिए कम किया जाता है। प्रारंभिक एक्सपोजर के बाद और सेल के बाद सेल क्षारीयता फिर निर्धारित की जाती है। परिणाम कोशिका मेटाबोलिक गतिविधि और विलवणता संरक्षण पर आई ड्रॉप योगों के तुलनात्मक प्रभाव दिखाते हैं। इस विधि का उपयोग शुष्क आंखों के योगों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो वाष्पीकरण शुष्क आंखों वाले व्यक्तियों के इलाज के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।

Introduction

स्थिरता, पीएच, ऑस्मोलैरिटी और प्रभावकारिता को बनाए रखने के लिए कई-खुराक नेत्र समाधानों में कई अलग-अलग अवयवों की आवश्यकता होती है। हालांकि, ऑक्यूलर सॉल्यूशंस में प्रिजर्वेटिव या सर्फेक्टेंट जैसे कुछ रसायन कॉर्नियल एपिथेलियम1,2को नुकसान पहुंचा सकते हैं । नेत्र योगों में इन विभिन्न अवयवों के कारण संभावित क्षति का आकलन करने के लिए मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं (एचसीईसी) का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता परीक्षण किए जा सकते हैं। सेल क्षति का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी इन विट्रो परख में से एक है अलाआमब्लू परख3। इस परख में मेटाबॉलिक डाई (यानी आलमारब्लू) में रेसाजुरिन होता है, जो सेल फिजिबिलिटी इंडिकेटर के रूप में काम करता है। सेलुलर श्वसन के दौरान, रिसाज़ुरिन को इलेक्ट्रॉन 4 स्वीकार करके रिसोरुफिन में कम कर दियाजाताहै। रिसोरुफिन की कमी से एक गैर-फ्लोरोसेंट अणु से फ्लोरोसेंट अणु में परिवर्तन होता है जिसका पता स्पेक्ट्रोफ्लोरोरोमीटर5का उपयोग करके लगाया जा सकता है।

यह जांच कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं के दो अलग-अलग उपचारों का उपयोग करती है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि इन विट्रो मॉडल में शुष्क आंख उत्पाद कैसे प्रदर्शन कर सकते हैं। पहले मूल्यांकन में, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए इन उत्पादों के साथ इलाज कर रहे हैं । उपचार के बाद, कोशिकाओं को सूखी आंखों के उत्पादों के संपर्क में आने के तुरंत बाद और वसूली समय अंतराल के तुरंत बाद मेटाबोलिक गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जाता है। यह आकलन आर्द्रता कक्ष में विलवणीकरण से पहले कोशिकाओं पर इन उत्पादों के प्रभाव को निर्धारित करता है। इन समाधानों में समाधान संरक्षक, सर्फेक्टेंट या बफ़र्स कोशिकाओं पर कुछ साइटोटॉक्सिक प्रभाव हो सकते हैं जिन्हें मेटाबोलिक डाई का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है।

दूसरा मूल्यांकन शुष्क नेत्र उत्पादों और सुखाने के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि निर्धारित करता है। इस आकलन में, यदि उत्पाद उपचार कोशिकाओं को ह्रास क्षति से सुरक्षा प्रदान करता है, तो कोशिकाओं की मेटाबॉलिक गतिविधि को बनाए रखा जाएगा। यदि शुष्क नेत्र उत्पाद लिपिड के साथ कोशिकाओं को कोट कर सकता है या उत्पाद कोशिकाओं को नमी जोड़ने के आसपास से तरल को अवशोषित कर सकता है तो सुखाने के हानिकारक प्रभावों से कोशिका सुरक्षा हो सकती है।

यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं पर पर्यावरणीय तनाव की गंभीर स्थितियों का अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। अन्य अध्ययनों ने इस बाहरी तनाव को बनाने के लिए विभिन्न मॉडलों का उपयोग किया है। कुछ अध्ययनों से लेमिनार प्रवाहहुड 6, 7,8में कोशिकाओं को सुखा दिया गया है , जबकि अन्य ने कमरे के तापमान और विभिन्न सापेक्ष आर्द्रता (आरएच)मूल्यों काउपयोग किया है 9 ,10,11. आंखों की सूखी स्थितियों का अनुकरण करने की एक विधि इनक्यूबेटिंग समाधान12,13की ऑस्मोलारिटिटी कोबढ़ानाहै । प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों का अनुकरण करने के लिए एक और इन विट्रो विधि यह है कि सूखी आंखों के रोगियों के आंसू तरल पदार्थ का अनुकरण करने के लिए सेल मीडिया में साइटोकिन्स जोड़ें14 हालांकि इन परीक्षणों दिलचस्प मॉडल है कि मूल्यांकन कर सकते है कैसे रसायनों ओस्मोटिक तनाव को कम करने या प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रोत्साहित कर रहे हैं, इन मॉडलों को सीधे कैसे रासायनिक योगों desiccation तनाव से कोशिकाओं की रक्षा कर सकते है नहीं दिखा रहे हैं ।

सीसीेशन मॉडल में तापमान/आर्द्रता कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस और 45 प्रतिशत आरएच का उपयोग किया गया है। यह पर्यावरणीय स्थितियों का अनुकरण करता है जो नेत्र सतह से वाष्पीकरण का कारण बन सकता है। सर्दियों के महीनों के दौरान हवाई जहाज के केबिन15 या इनडोर वातावरण में पाए जाने वाले कम आर्द्रता जैसे अन्य चरम पर्यावरणीय स्थितियों के सिमुलेशनभी इस विधि का उपयोग करके किए जा सकते हैं।

सेल कल्चर मॉडलिंग का उपयोग मानव कॉर्निया पर विलवणता तनाव के प्रभाव का अनुकरण करने के लिए किया जाता है। सेल तनाव का पता लगाने के लिए, सेल स्वास्थ्य पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए सेल व्यवहार्यता परीक्षण किया जाता है। कोशिकाओं पर कई अलग - अलग शारीरिक परीक्षण किए जा सकते हैं ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या उन्हें17पर बल दिया गया है । इस परीक्षण प्रक्रिया में किए गए विश्लेषण में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मेटाबोलिक डाई(सामग्री की तालिका) काउपयोग किया गया है। यह कई अन्य सेल तनाव परीक्षणों पर लाभ है कि यह गैर विषाक्त है, विकास मीडिया में घुलनशील और सेल निर्धारण18के बिना कोशिकाओं का मूल्यांकन कर सकते हैं । इस प्रक्रिया में कोशिकाओं को प्रत्येक उपचार के तुरंत बाद मेटाबोलिक गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है और कोशिकाओं के दूसरे सेट को विकास मीडिया में वापस रखा जाता है और 18 घंटे की वसूली के बाद मूल्यांकन किया जाता है। तुरंत और फिर एक वसूली अवधि के बाद परीक्षण के लिए कारण सेल क्षति है कि चयापचय गतिविधि और सेल क्षति है कि देरी प्रभाव का कारण बनता है पर तत्काल प्रभाव का कारण बनता है की पहचान करने के लिए है । इसके अलावा, यह अल्पकालिक बनाम दीर्घकालिक क्षति पर इन योगों के प्रभाव का मूल्यांकन करने और प्रारंभिक अपमान से उबरने/उबरने की क्षमता का अवसर प्रदान करता है ।

इस जांच का उपयोग एचसीईसी मेटाबोलिक गतिविधि पर उनके प्रभाव के लिए विभिन्न लिपिड युक्त शुष्क आंख उत्पादों की तुलना करने के लिए किया जाता है। परीक्षण की गई शुष्क नेत्र उत्पादों में सामग्री का वर्णन सामग्री की तालिका में किया जाता है। समाधान #1 में सामग्री कार्बॉक्सिमेथाइलसेलुलोस सोडियम (0.5%), ग्लिसरीन (1%), और पॉलीसोर्बेट 80 (0.5%), समाधान में हैं #2 वे हल्के खनिज तेल (1.0%) और खनिज तेल (4.5%), और लिपिड #3 समाधान में खनिज तेल और प्रोपलीन ग्लाइकोल डिमॉन्टेंट है। ये लिपिड निर्माण घटक हैं जो एचसीईसी को विलवणीकरण से सुरक्षा प्रदान करने की उम्मीद करते हैं।

Protocol

1. मानव कॉर्नियल एपिथेलियल सेल संस्कृति

  1. कोलेजन में अमर एचसीईसी19-लेपित ७५ सेमी2 फ्लैक्स के साथ दुल्बेको के संशोधित ईगल मीडियम/पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (डीएमईएम/एफ12) के 20 एमएल के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमीसिन 5% CO2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: मिलाते हुए आवश्यक नहीं है।
  2. हर 2−3 दिन में मीडिया बदलें।

2. परीक्षण के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. कोशिकाओं के बाद लगभग कॉन्फ्लेंट संस्कृति मीडिया को हटा रहे हैं।
  2. प्रत्येक 75 सेमी2 फ्लास्क में सेल असंबद्धता समाधान का 4−6 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं (लगभग 20−30 मिनट), माइक्रोस्कोप के नीचे समय-समय पर जांच करें।
  3. प्रत्येक 75 सेमी 2 फ्लास्क में 10% एफबीएस युक्त डीएमईएम/एफ12 का2−6 एमएल जोड़ें।
  4. फ्लास्क की सामग्री को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 5 मिनट के लिए 450−500 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट को बाहर निकालें और कोशिकाओं को पूर्व-गर्म मीडिया में फिर से खर्च करें।
  6. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। मीडिया की मात्रा की गणना करें जिसमें कुल 1 x 105 कोशिकाएं शामिल हैं।
  7. एक 48 अच्छी तरह से कोलेजन-1 लेपित संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 x 105 कोशिकाओं को जोड़ें। अच्छी तरह से पर्याप्त मीडिया जोड़ें ताकि अच्छी तरह से मीडिया की अंतिम मात्रा 10% FBS के साथ संस्कृति DMEM/F12 के ०.५ मिलीएल है ।
    नोट: एक कृत्रिम आंसू निर्माण साइटोटॉक्सिकिटी का कारण बन सकता है जिसे एचसीईसी की मेटाबोलिक गतिविधि में कमी से मापा जा सकता है। डेटा की निरंतरता सीडिंग करते समय प्रत्येक अच्छी तरह से एचसीईसी की एक ही संख्या जोड़ने पर निर्भर है। 48 अच्छी प्लेटों के लिए जो संस्कृति एकाग्रता की सिफारिश की जाती है वह 1 x 105है । चूंकि स्तनधारी कोशिकाएं पुनर्व्यवसर्णित होने के बाद अपकेंद्रित्र ट्यूब में व्यवस्थित हो सकती हैं, इसलिए कोशिकाओं के साथ प्लेटों को सीडिंग करते समय अक्सर आंदोलन द्वारा कोशिकाओं को फिर से खर्च करने की सिफारिश की जाती है ताकि कोशिका निलंबन को एचसीईसी समान रूप से वितरित किया जा सके।
  8. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करें।

3. कोई विलवणीकरण प्रोटोकॉल

  1. नियंत्रण प्रक्रिया
    1. 24 घंटे के बाद इनक्यूबेशन संस्कृति मीडिया को थाली से हटा दें।
    2. तुरंत एक परीक्षण निर्माण और मीडिया नियंत्रण समाधान के 150 μL के साथ इलाज करें।
    3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. कोशिकाओं से परीक्षण समाधान निकालें।
    5. मेटाबॉलिक एक्टिविटी के लिए टेस्ट करने के लिए 10% मेटाबॉलिक डाई सॉल्यूशन का 0.5 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. 4 घंटे इनक्यूबेशन अवधि के बाद, प्रत्येक कुएं से मेटाबोलिक डाई समाधान के 100 माइक्रोन निकालें और प्रत्येक 100 माइक्रोन को 96 अच्छी प्लेट के कुएं में रखें।
    7. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरेसेंसको मापें। 540 एनएम पर उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 590 एनएम पर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें।
  2. कोई ह्रास प्रोटोकॉल (वसूली प्रक्रिया)
    1. स्टेप्स 3.1.1−3.1.4 दोहराएं।
    2. प्रत्येक कुएं में डीएमईएम/एफ12 मीडिया का 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 18 घंटे के लिए संस्कृतियों का एक सेट इनक्यूबेट ।
    4. मीडिया को हटा दें और 10% मेटाबोलिक डाई समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें। चरण 3.1.6 और 3.1.7 दोहराएं।

4. डेसिकेशन प्रोटोकॉल

  1. नियंत्रण प्रक्रिया
    1. 24 घंटे इनक्यूबेशन (चरण 2.8) के बाद, संस्कृति मीडिया को प्लेट से हटा दें।
    2. तुरंत एक परीक्षण निर्माण और मीडिया नियंत्रण समाधान के 150 μL के साथ इलाज करें।
    3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. कोशिकाओं से परीक्षण समाधान निकालें।
    5. कोशिकाओं को स्थापित करने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 45% आरएच चैंबर में कोशिकाओं को रखें।
    6. मेटाबोलिक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए 10% मेटाबोलिक डाई समाधान का 0.5 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 4 घंटे इनक्यूबेशन अवधि के बाद, प्रत्येक कुएं से मेटाबोलिक डाई समाधान के 100 माइक्रोन निकालें और प्रत्येक 100 माइक्रोन को 96 अच्छी प्लेट के कुएं में रखें।
    8. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरेसेंस को मापें। 540 एनएम पर उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 590 एनएम पर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें।
  2. वसूली प्रक्रिया
    1. दोहराएं कदम 4.1.1-4.1.5।
    2. प्रत्येक कुएं में डीएमईएम/एफ12 मीडिया का 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 18 घंटे के लिए संस्कृतियों का एक सेट इनक्यूबेट ।
    4. मीडिया को हटा दें और 10% मेटाबोलिक डाई समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें। चरण 4.1.7 और 4.1.8 दोहराएं।

5. डेटा विश्लेषण

  1. मीडिया नियंत्रण के औसत फ्लोरेसेंस की गणना करें। अनुवर्ती सूत्र का उपयोग करके नमूने की प्रतिशत व्यवहार्यता की गणना करें:
    नमूना की प्रतिशत व्यवहार्यता = परीक्षण नमूना फ्लोरेसेंस/मीडिया नियंत्रण फ्लोरेसेंस x 100
    नोट: मीडिया नियंत्रण औसत 100% व्यवहार्यता है। मेटाबॉलिक डाई अपने आप में इसके साथ जुड़े फ्लोरेसेंस की एक छोटी राशि है। मेटाबोलिक डाई रिएजेंट के फ्लोरेसेंस को मीडिया नियंत्रण में परीक्षण नमूनों की % व्यवहार्यता की गणना करने से पहले नियंत्रण और परीक्षण नमूना फ्लोरेसेंस से घटाया जा सकता है।
  2. नियंत्रण और परीक्षण नमूनों पर समान भिन्नता के लिए एक सामान्य परीक्षण और परीक्षण करें।
  3. यदि सामान्य परीक्षण गुजरता है और विचरण बराबर हैं तो एक तरह से ANOVA प्रदर्शन करते हैं। विशिष्ट समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों की पहचान करने के लिए एक जोड़ीवार तुलना पोस्ट हॉक परीक्षण (यानी, Tukey या डननेट के कई तुलना परीक्षण) करते हैं ।
  4. यदि सामान्य परीक्षण गुजरता है और विचरण अलग हैं तो वेल्च के ANOVA प्रदर्शन करते हैं। विशिष्ट समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों की पहचान करने के लिए एक जोड़ीवार तुलना पोस्ट हॉक परीक्षण (यानी, डुनेट या गेम्स-हॉवेल कई तुलना परीक्षण) करते हैं।
  5. यदि सामान्य परीक्षण विफल रहता है तो एक नॉनपैरमेट्रिक टेस्ट (यानी, क्रुस्कल-वालिस टेस्ट) का उपयोग करें। विशिष्ट समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों की पहचान करने के लिए एक जोड़ीवार तुलना पोस्ट हॉक परीक्षण (यानी, डन का परीक्षण) प्रदर्शन करते हैं ।

Representative Results

तीन शुष्क नेत्र योगों की तुलना में अध्ययन के परिणाम चित्र 1में दिखाए गए हैं । इस आंकड़े से पता चलता है कि प्रभाव में अंतर है तीन उत्पादों, समाधान #1, समाधान #2 और समाधान #3(सामग्री की मेज)HCEC की व्यवहार्यता पर है । समाधान #1 और समाधान #2 का चयन से पहले एचसीईसी की मेटाबोलिक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा। इसका मतलब यह है कि इन उत्पादों में निर्माण घटक हैं जो एचसीईसी की मेटाबॉलिक गतिविधि को बाधित कर सकते हैं। कोशिका मेटाबोलिक गतिविधि में अतिरिक्त गिरावट है कि समाधान #1 के संपर्क में कोशिकाओं की 18 घंटे वसूली के बाद हुई पता चलता है कि HCEC शुरू में घायल हो गए थे और 18 घंटे के बाद चोट की मरंमत नहीं की गई थी । इसकी तुलना में, समाधान #3 एचसीईसी की मेटाबॉलिक गतिविधि पर केवल हल्का प्रभाव पड़ा।

चित्रा 2 कोशिका संरक्षण पर इन लिपिड युक्त शुष्क आंखों के योगों का प्रभाव दिखाता है। 18 घंटे वसूली अंतराल पर लगभग 0% एचसीईसी मेटाबोलिक गतिविधि के साथ, समाधान #1 और समाधान #2 कोशिकाओं को डिसिकेशन तनाव से नहीं बचाता था। समाधान #3, हालांकि, desiccation तनाव के खिलाफ कुछ सुरक्षा की पेशकश की ।

Figure 1
चित्रा 1: सूखी आंख लिपिड का प्रभाव सेल व्यवहार्यता पर उत्पादों को बढ़ाया। लिपिड युक्त शुष्क नेत्र उत्पादों के साथ उपचार के बाद एचसीईसी मेटाबोलिक गतिविधि द्वारा मापा गया सापेक्ष व्यवहार्यता। = = सांख्यिकीय महत्व (पी < 0.05) समाधान #3 के सापेक्ष, उपयुक्त वसूली अवधि के लिए मीडिया नियंत्रण के सापेक्ष < 0.05) । बार की ऊंचाई मतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रुटि सलाखों एसडी हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: शुष्क आंख लिपिड का प्रभाव सुखाने की सुरक्षा पर उत्पादों को बढ़ाया। कोशिका संरक्षण पर लिपिड युक्त शुष्क नेत्र योगों का प्रभाव। समाधान #1 और समाधान #2 कोशिकाओं को आनंदित करने के तनाव से नहीं बचाता था, और वे समय के साथ आनंद प्रभाव से उबर नहीं पाए। इसके विपरीत, समाधान #3 ने डिसिकेशन तनाव के खिलाफ कुछ सुरक्षा की पेशकश की है। * = पी < 0.05 समाधान #3 के सापेक्ष, और 0.05 < उपयुक्त वसूली समय के लिए अनुपचारित (नियंत्रण) मीडिया के सापेक्ष पी। बार की ऊंचाई मतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रुटि सलाखों एसडी हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल सेल विलवणीकरण के खिलाफ कृत्रिम आंसू समाधान के सुरक्षात्मक प्रभावों को निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रारंभ में, कोशिकाओं को कोट करने के लिए सूखी आंखों की बूंदों के संपर्क में आती हैं। इसके बाद, कोशिकाओं को सूख जाता है, और मेटाबोलिक गतिविधि की निगरानी की जाती है ताकि यह आकलन किया जा सके कि क्या योगों से सुखाने के तनाव के हानिकारक प्रभावों को कम किया जा सकता है। ये कदम समग्र प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं शुष्क नेत्र योगों कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं की समग्र व्यवहार्यता पर हो सकता है ।

अधिकांश शुष्क नेत्र योगों को संस्कृति कुओं से हटाने के बाद, शेष अणुओं की रसायन शास्त्र जो कोशिकाओं के संपर्क में हैं, कोशिका के उपयोग को प्रभावित करेंगे। कुछ उत्पादों में तेलों के सूक्ष्म पायस होते हैं जो सेल वाष्पीकरण20को कम करते हैं। एक अध्ययन जिसमें रिंसिंग के बाद घर्षण विश्लेषण का मूल्यांकन किया गया , जिसमें कुछ शुष्क नेत्र योगों के लिए कम घर्षण का रखरखाव दिखाया गया है जो शुष्क नेत्र योगों के बढ़ेहुएनिवास समय का सूचक हो सकता है । इस परख की सीमाओं में से एक यह है कि यद्यपि अन्य आई ड्रॉप फॉर्मूलेशन की तुलना में सुखाने की सुरक्षा का मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन इस सुरक्षा की अवधि कम सुखाने के समय के कारण निर्धारित नहीं की जा सकती है। इस इन विट्रो परख में लंबे समय तक सुखाने के समय को बहुस्तरीय संस्कृतियों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है जिसमें सेल मोनोलेयर की तुलना में समग्र रूप से अधिक नमी की मात्रा होती है।

कोशिकाओं पर योगों के लिए विशिष्ट इनक्यूबेशन समय और सुखाने के समय की अवधि को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है यदि तापमान और आर्द्रता मूल्यों को बदल दिया जाता है। पर्यावरणीय तनाव की स्थिति का अनुकरण करने के लिए तापमान, आरएच और वायु प्रवाह का चयन करना मुश्किल हो सकता है क्योंकि मौसमी और स्थानीय पर्यावरणीय स्थितियां काफी परिवर्तनीयहैं 21। मानव अध्ययन के लिए आधुनिक पर्यावरण कक्षों में 5 डिग्री सेल्सियस और 35 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान भिन्न हो सकता है, और आरएच 5% और 95%22के बीच हो सकता है। एक इवोपोरीमीटर और कसकर फिट चश्मे का उपयोग करना यह निर्धारित किया गया था कि 40−45% के आरएच में कॉर्निया से वाष्पीकरण दर ०.०३७ माइक्रोएल/सेमी2/मिनटथी और आरएच में 20−25% वाष्पीकरण दर ०.०६५ माइक्रोल/सेमी2/मिनट23थी । यदि इन विट्रो मॉडल बेहद कम आरएच स्थितियों के तहत फॉर्मूलों के सुरक्षात्मक प्रभाव को देख रहा है जैसे हवाई जहाज15,रेगिस्तान, या शुष्क इनडोर वातावरण16में, इनक्यूबेशन बार कोशिकाओं से बढ़ी हुई वाष्पीकरण दरों को समायोजित करने के लिए कम करने की आवश्यकता हो सकती है। मानव आंसू तरल पदार्थ में, मीबोमियन और अन्य ग्रंथियों से प्राप्त विभिन्न प्रकार के लिपिड मौजूद हैं जो आंसुओं को वाष्पीकरण से बचाते हैं। इन लिपिड में पिघलने के अलग - अलग अंकहोतेहैं . तापमान परिवर्तन आंसू तरल पदार्थ की तरलता को प्रभावित कर सकता है इसलिए परिवेश के तापमान पर किए गए परीक्षणों में 37 डिग्री सेल्सियस पर किए गए परीक्षणों की तुलना में काफी अलग वाष्पीकरण दर हो सकती है। चूंकि औसत नेत्र सतह तापमान सीमा 32.9 से 36 डिग्री सेल्सियस25तक है, इसलिए इस तापमान सीमा के पास परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले मेटाबॉलिक डाई (अलामारब्लू) के अलावा अन्य केमिकल रिएजेंट्स भी हैं जिनका इस्तेमाल सेल मेटाबॉलिक एक्टिविटी पर प्रॉडक्ट फॉर्मूलेशन के इफेक्ट्स का आकलन करने के लिए किया जा सकता है । टेट्राजोलियम साल्ट (एमटीटी, एक्सटीटी, एमटीएस, डब्ल्यूएसटी) वैकल्पिक रसायन हैं जिनका उपयोग किया जा सकता है। टेट्राजोलियम लवण में अंतर यह है कि एमटीटी एक सकारात्मक आवेशित अणु है ताकि यह जीवित कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में प्रवेश करसके 26. एमटीटी (पी) एच27द्वारा अपनी कमी के बाद अघुलनशील हो जाता है । यह एक थाली पाठक पर अवशोषण पढ़ने से पहले घुलनशील होना चाहिए । अन्य टेट्राजोलियम लवण28को नकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है । उन्हें जीवित कोशिका के बाहर माध्यमिक अणुओं द्वारा कम किया जाना चाहिए क्योंकि वे कोशिका में प्रवेश नहीं कर सकते और सीधे इंट्रासेलुलर अणुओं से बातचीत नहीं करसकतेहैं । XTT, MTS, और WST-1 परख के लिए, एक इलेक्ट्रॉन युग्मन एजेंट 1-मेथॉक्सी फेनाज़ीन मेथोसुल्फेट (पीएमएस) के अलावा परख30के प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं । मेटाबोलिक परख के विपरीत जो टेट्राजोलियम लवण का उपयोग करते हैं, अलामारब्लू को अतिरिक्त घुलनशील या इलेक्ट्रॉन युग्मन एजेंटों की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, एक्सटीटी, एमटीएस या डब्ल्यूएसटी-1 के विपरीत, अलाअरब्लू कोशिका झिल्ली में प्रवेश करता है और सीधे सेलुलर एंजाइमों27, 29द्वारा कम किया जा सकता है। अलामारब्लू की टेट्राज़ोलियम लवण से सीधी तुलना से पता चला है कि एचसीईसी 3 , 27 , 31,32सहित विभिन्न सेल लाइनों की मेटाबॉलिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए अलाअरब्लू अधिक संवेदनशीलहै।

अन्य जैव रासायनिक एंडपॉइंट्स को भी विलवणीकरण द्वारा मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं की सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए विचार किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कोशिका झिल्ली पारमी और सेल एस्टेरास गतिविधि का पता लगाने के लिए किया जा सकता है1. इसके अलावा , कोशिका की सतह पर एपोप्टिक मार्कर के लिए धुंधला करके या कैस्पा गतिविधि1,33के लिए मापने के द्वारा एपोप्टोसिस का पता लगाया जा सकता है। अन्य परखों ने एचसीईसी तंग जंक्शनों पर नेत्र उत्पादों के प्रभाव34निर्धारित किए हैं । इन परख इस लेख में वर्णित desiccation प्रक्रियाओं का उपयोग भविष्य के आकलन में शामिल किया जा सकता है ।

सूखी आंखों के कई कारण होते हैं। सूखी आंख आँसू के कम स्राव, नेत्र सतह सूजन में वृद्धि या नेत्र सतह पर निर्जलीकरण में वृद्धि के कारण हो सकता है। उन व्यक्तियों के लिए जिनके पास सूखी आंखों की बूंद का वाष्पीकरण शुष्क आंखों का उपयोग होता है जो उनकी कोशिकाओं को सुखाने की स्थिति के दौरान सूखने से रोकता है, सूखी आंखों के लक्षणों को कम कर सकता है। कुछ शुष्क आंखों के योगों में समस्याओं में से एक संरक्षक की उपस्थिति है जो नेत्र सतह को नुकसान पहुंचा सकती है। घायल कोशिकाएं आंखों के रोगियों को सुखाने में सहायक नहीं होती हैं क्योंकि इससे अधिक कोशिकाएं मर सकती हैं क्योंकि घायल कोशिकाएं तनाव35के लिए अधिक संवेदनशील होती हैं ।

Garrigue एट अल द्वारा हाल ही में एक समीक्षा लेख३६ कैसे लिपिड आधारित उत्पादों के वर्तमान ज्ञान का आकलन प्रदान करता है वाष्पीकरण सूखी आंख को कम करने के लिए कार्य करते हैं । लिपिड की कमी वाले आंसुओं में लिपिड जोड़ने से वाष्पीकरण को रोका जा सकता है, इस प्रकार कोशिकाओं को डिलिस्केशन से बचाया जा सकता है। इसके अलावा, ह्यूमेक्टेंट अणु हैं जो नेत्र सतह37पर पानी को आकर्षित और बनाए रखते हैं। समाधान #1 में ग्लिसरीन और समाधान में प्रोपलीन ग्लाइकोल दोनों #3 ह्यूमेक्टेंट हैं। समाधान #3 ने एचसीईसी का अधिक सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाया जो निर्माण सामग्री के लिपिड और ह्यूमेक्टेंट गुणों के कारण हो सकता है।

यह प्रोटोकॉल शुष्क आंखों के योगों के संपर्क में आने और तनाव को कम करने के बाद एचसीईसी की मेटाबोलिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस लेख में वर्णित तरीकों का उपयोग करके, वाष्पीकरण शुष्क आंखों से पीड़ित लोगों के लिए नई गैर-इरिटिंग और सुरक्षात्मक आंखों की बूंदें विकसित की जा सकती हैं।

Disclosures

तीन लेखक (रेखा रंगराजन, हावर्ड ए केटेलसन, लक्ष्मण सुब्बारमन) एल्कॉन के कर्मचारी हैं। एल्कॉन इस परियोजना के वित्तपोषण और प्रायोजक का एकमात्र स्रोत है। लिंडन डब्ल्यू जोन्स, पिछले 3 वर्षों में, निम्नलिखित कंपनियों से अनुसंधान समर्थन या व्याख्यान मानदेय प्राप्त हुआ है: एल्कॉन, एलर्गन, कॉन्टामैक, कूपरविजन, जीएल चेमटेक, फ्यूरटेक्स रिसर्च, जेएंडजे विजन, मेनिकॉन, नेचर वे, नोवार्टिस, पीएस थेरेपी, सैंटन, शायर, SightGlass और Visioneering। लिंडन जोन्स भी एक सलाहकार है और/या एल्कॉन, कूपरविजन, जेएंडजे विजन, नोवार्टिस और ओफटेक्स के लिए एक सलाहकार बोर्ड पर कार्य करता है । लेखकों की निम्नलिखित सूची का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है: रिचर्ड डो, डेविड जे मैककैना, एडेलीन सुको, डेरिल एनस्टोन, जया डैंटम।

Acknowledgments

लेखक इन अध्ययनों के लिए वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए Alcon धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Vented Flask Corning 354485 This is the BioCoat brand collagen coated
96 well plate costar 3370
alamarBlue Fisher Scientific dal 1025
Corning 48 Well plates Corning 354505 This is the BioCoat brand collagen coated
Cytation 5 BioTek CYT5MPV Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES Gibco 11039-021 There is No Phenol Red in this media
Fetal Bovine Serum Hycone SH30396.03
Human Corneal Epithelial Cells University of Ottawa N/A SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72.
Humidity/Temperature Chamber Associated Environmental Systems LH-1.5 Economy Line Humidity Chamber
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media
Refresh Optive Advanced (solution #1) Allergan, Inc Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.
Soothe XP (solution #2) Bausch & Lomb Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).
Systane Complete (solution #3) Alcon Inc. Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.
TrypLE Express (cell disassociation solution) Fisher Scientific 12605036

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चिकित्सा अंक 159 मेटाबोलिक गतिविधि सूखी आंख कृत्रिम आंसू निर्माण सुखाने मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं मेटाबोलिक डाई
Desiccation के संपर्क में आने के बाद मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि पर कृत्रिम आंसू योगों का प्रभाव
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Rangarajan, R., Ketelson, H. A., Do, R., McCanna, D. J., Suko, A., Enstone, D., Subbaraman, L. N., Dantam, J., Jones, L. W. Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation. J. Vis. Exp. (159), e60812, doi:10.3791/60812 (2020).

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