Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך אם ניסוחים מלאכותיים שונים של קרע יכולים להגן על תאי אפיתל הקרנית האנושיים מפני התייבשות באמצעות מודל במבחנה. לאחר חשיפה לניסוחים מלאכותיים של קרעים והתייבשות, תאי אפיתל הקרנית האנושיים מוערכים לפעילות מטבולית.
Abstract
ניסוחים מלאכותיים המכילים שומנים בדמעות מפותחים כדי להפחית את אידוי הדמעות על ידי שחזור של שכבת שומנים דמעה לקויה. ניסוחים מלאכותיים של קרע המונעים ייבוש תאים יגרמו להגנה על פני העין ולשמירה על פעילות מטבולית של התא. במהלך התייבשות, תאים עוברים את התהליך של אובדן פעילות מטבולית ולאחר מכן מוות של תאים. עבודה זו מתארת שיטה להערכת היעילות של ניסוחים דמעה מלאכותית. הצבע המטבולי (כלומר, alamarBlue) משתנה ממולקולה פלואורסצנטית נמוכה resazurin למולקולה פלואורסצנטית resorufin בתאים קיימא. הביצועים הביולוגיים של ניסוח קרע מלאכותי נמדדים כיכולת הניסוח (א) לשמור על הכדאיות של התא ו-(ב) לספק הגנה על התאים מפני התייבשות. מדיית צמיחה ותמיסת מלח משמשים כפקדים לבדיקות הכדאיות/התייבשות של התאים. תאים הם דגירה עם פתרונות בדיקה במשך 30 דקות ולאחר מכן מיובש במשך 0 או 5 דקות ב 37 °C (69 °F) ו 45% לחות יחסית. פעילות מטבולית של התא לאחר החשיפה הראשונית ולאחר ייבוש התא נקבעת לאחר מכן. התוצאות מראות את ההשפעות ההשוואתיות של ניסוחים טיפת עיניים על פעילות מטבולית התא והגנה על התייבשות. שיטה זו יכולה לשמש לבדיקת ניסוחים עיניים יבשות שנועדו לטפל באנשים עם עין יבשה אידוי.
Introduction
מרכיבים רבים ושונים בפתרונות עיניים במינון מרובה נדרשים כדי לשמור על יציבות, pH, osmolarity, ויעילות. עם זאת, כמה כימיקלים כגון חומרים משמרים או פעילי שטח בתמיסות עיניים יכול לגרום נזק אפיתל הקרנית1,2. בדיקות הכדאיות של התא באמצעות תאי אפיתל הקרנית האנושיים (HCEC) ניתן לבצע כדי להעריך את הנזק הפוטנציאלי שנגרם על ידי מרכיבים שונים אלה ניסוחים עיניים. אחת מן מבחני במבחנה כי הוא שימושי במיוחד להערכת נזק לתאים הוא alamarBlue assay3. ב בדיקה זו, הצבע המטבולי (כלומר, alamarBlue) מכיל resazurin, אשר מתפקד כמחוון הכדאיות של התא. במהלך הנשימה התאית, resazurin מצטמצם resorufin על ידי קבלת אלקטרונים4. הפחתת resorufin גורם לשינוי ממולקולה שאינה פלואורסצנטית למולקולה פלואורסצנטית שניתן לזהות באמצעות ספקטרופלואורומטר5.
חקירה זו משתמשת בשני טיפולים שונים של תאי אפיתל הקרנית כדי לקבוע כיצד מוצרי עיניים יבשות עשויים לבצע במודל במבחנה. בהערכה הראשונה, התאים מטופלים עם מוצרים אלה במשך 30 דקות. לאחר הטיפול, התאים מוערכים לאחר מכן לפעילות מטבולית מיד לאחר החשיפה למוצרי העין היבשה ולאחר מרווח זמן התאוששות. הערכה זו קובעת את ההשפעה של מוצרים אלה על תאים לפני התייבשות בתא לחות. חומרים משמרים פתרון, פעילי שטח או מאגרים בפתרונות אלה עשויים להיות כמה השפעות ציטוטוקסיות על התאים שניתן לזהות באמצעות צבע מטבולי.
ההערכה השנייה קובעת את הפעילות המטבולית של התאים לאחר חשיפה למוצרי העין היבשה והתייבשות. בהערכה זו, אם הטיפול במוצר מציע הגנה לתאים מפני נזקי התייבשות, הפעילות המטבולית של התאים תישמר. הגנה על תאים מפני ההשפעות המזיקות של התייבשות עלולה להתרחש אם מוצר העין היבשה יכול לציפוי התאים עם שומנים או המוצר עלול לספוג נוזלים מהסביבה הוספת לחות לתאים.
פרוטוקול זה נועד לדמות תנאים חמורים של לחץ סביבתי על תאים. מחקרים אחרים השתמשו במודלים שונים כדי ליצור מתח חיצוני זה. מספר מחקרים ייבשו את התאים במכסה המנוע של זרימהלמינארית 6,7,8, ואילו אחרים השתמשו בטמפרטורת החדר ובלחות יחסית שונים (RH) ערכים9,10,11. שיטה של הדמיית תנאי עיניים יבשים היא להגדיל את osmolarity של פתרון הדגירה12,13. שיטה נוספת במבחנה להדמיית תנאים סביבתיים קשים היא להוסיף ציטוקינים למדיית התא כדי לדמות את נוזל הדמעות של חולי עיניים יבשות14. למרות בדיקות אלה הם מודלים מעניינים שיכולים להעריך כיצד כימיקלים להפחית מתח אוסמוטי או לעורר את המערכת החיסונית, מודלים אלה אינם מראים ישירות כיצד ניסוחים כימיים יכולים להגן על התאים מפני מתח התייבשות.
מודל התייבשות משתמש בתא טמפרטורה / לחות 37 °C (77 °F) ו 45% RH. הוא מדמה תנאים סביבתיים שיכולים לגרום לאידוי מפני השטח העין. סימולציות של תנאי סביבה קיצוניים אחרים כגון לחות נמוכה נמצא בתאי מטוסים15 או בסביבות מקורה בחודשי החורף16 יכול להתבצע גם בשיטה זו.
דוגמנות תרבות התא משמשת כדי לדמות את ההשפעה של לחץ ייבוש על הקרנית האנושית. על מנת לזהות מתח התא, בדיקות הכדאיות של התא מתבצעת כדי לקבוע את ההשפעה על בריאות התא. מספר בדיקות פיזיולוגיות שונות יכולות להתבצע על תאים כדי לקבוע אם הם לחוצים17. הניתוח המבוצע בהליך בדיקה זה משתמש בצבע המטבולי הזמין מסחרית (טבלת החומרים). יש לו את היתרון על פני בדיקות מתח תאים רבים אחרים בכך שהוא לא רעיל, מסיס במדיית צמיחה והוא יכול להעריך תאים ללא קיבעון התא18. בהליך זה התאים נבדקים לפעילות מטבולית מיד לאחר כל טיפול וקבוצה שנייה של תאים ממוקמים בחזרה לתוך מדיה צמיחה מוערך לאחר 18 שעות התאוששות. הסיבה לבדיקה מיד ולאחר מכן לאחר תקופת ההחלמה היא לזהות נזק לתאים שגורם להשפעות מיידיות על פעילות מטבולית ונזק לתאים שגורם להשפעות מעוכבות. כמו כן, הוא מספק הזדמנות להעריך את ההשפעה של ניסוחים אלה על נזק לטווח קצר לעומת לטווח ארוך ואת היכולת של ניסוחים להתאושש / לא להתאושש העלבון הראשוני.
חקירה זו משמשת להשוואת מוצרים שונים המכילים שומנים בעין יבשה להשפעתם על פעילות מטבולית HCEC עם וללא התייבשות. המרכיבים במוצרי העין היבשה שנבדקו מתוארים בטבלת החומרים. המרכיבים בתמיסה #1 הם נתרן קרבוקסימתילקולוז (0.5%), גליצרין (1 #2%) ושמן מינרלי (4.5%), ובתמיסה #3 השומנים הוא שמן מינרלי פרופילן גליקול הוא demulcent. שומנים אלה הם מרכיבי הניסוח שצפויים לספק הגנה על HCEC מפני התייבשות.
Protocol
1. תרבות תאי אפיתל הקרנית האנושית
- לגדול מונצח HCEC19 ב מצופה קולגן 75 ס"מ2 בקבוקונים עם 20 מ"ל של הנשר שונה של Dulbecco בינוני / מיזינים תערובת F-12 (DMEM / F12) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין ב 37 °C (37 °F12) המכיל 10% CO2.
הערה: אין צורך לרעוד. - שנה את המדיה כל יומיים-שלושה.
2. הכנת תאים לבדיקה
- לאחר שהתאים כמעט מתבלבלים להסיר מדיה תרבות.
- הוסף 4-6 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לכל 75 ס"מ2 בקבוקים. דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) עד התאים להתנתק (כ 20-30 דקות), בדיקה מתחת למיקרוסקופ מעת לעת.
- הוסף 2-6 מ"ל של DMEM/F12 המכיל 10% FBS לכל בקבוק 75 ס"מ2.
- מעבירים את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה התאים ב 450-500 x g במשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנט ומחדשים את התאים במדיה מחוממת מראש.
- לספור את התאים באמצעות המוציטרומטר. חשב את נפח המדיה המכיל סך של 1 x 105 תאים.
- מוסיפים 1 x 105 תאים לכל באר של צלחת תרבות מצופה קולגן-1 48 באר. הוסף מספיק מדיה לבאר כך שהנפח הסופי של המדיה בבאר הוא 0.5 מ"ל של תרבות DMEM/F12 עם 10% FBS.
הערה: ניסוח קרע מלאכותי עלול לגרום לציטוקסיות שניתן למדוד על ידי ירידה בפעילות המטבולית של HCEC. עקביות הנתונים תלויה בהוספת אותו מספר של HCEC לכל באר בעת הזריעה. ריכוז התרבות המומלץ עבור 48 צלחות באר הוא 1 x 105. מכיוון שתאי יונקים יכולים להתיישב בצינור הצנטריפוגה לאחר שימוש חוזר, מומלץ לעשות שימוש חוזר בתאים על ידי עצבנות לעתים קרובות תוך זריעת הצלחות עם התאים, כך השעיית התא יש HCEC מופץ באותה מידה. - דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 עבור 24 שעות.
3. אין פרוטוקול ייבוש
- פרוצדורת בקרה
- לאחר הדגירה 24 שעות להסיר את התקשורת התרבותית מהצלחת.
- מיד לטפל עם 150 μL של ניסוח הבדיקה פתרון בקרת מדיה.
- דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 במשך 30 דקות.
- הסר את פתרונות הבדיקה מהתאים.
- הוסף 0.5 מ"ל של 10% פתרון צבע מטבולי כדי לבדוק פעילות מטבולית. דגירה התאים עוד 4 שעות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
- לאחר תקופת הדגירה 4 שעות, להסיר 100 μL של פתרון צבע מטבולי מכל באר ומניחים כל 100 μL לתוך באר של צלחת 96 היטב.
- למדוד את הפלואורסצנטיות של כל באר באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי(שולחן החומרים). הגדר את אורך גל העירור על 540 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ב 590 ננומטר.
- ללא פרוטוקול ייבוש (הליך התאוששות)
- חזור על שלבים 3.1.1-3.1.4.
- הוסף 0.5 מ"ל של מדיית DMEM/F12 לכל באר.
- דגירה קבוצה אחת של תרבויות עבור 18 שעות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
- הסר את המדיה ולהוסיף 0.5 מ"ל של 10% פתרון צבע מטבולי. חזור על שלבים 3.1.6 ו- 3.1.7.
4. פרוטוקול התייבשות
- פרוצדורת בקרה
- לאחר הדגירה 24 שעות (שלב 2.8), להסיר את התקשורת התרבותית מהצלחת.
- מיד לטפל עם 150 μL של ניסוח הבדיקה פתרון בקרת מדיה.
- דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 במשך 30 דקות.
- הסר את פתרונות הבדיקה מהתאים.
- מניחים את התאים בתא 37 °C (70 °F) ו 45% RH במשך 5 דקות כדי לייבש את התאים.
- הוסף 0.5 מ"ל של 10% פתרון צבע מטבולי לבדיקת פעילות מטבולית. דגירה התאים עוד 4 שעות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
- לאחר תקופת הדגירה 4 שעות, להסיר 100 μL של פתרון צבע מטבולי מכל באר ומניחים כל 100 μL לתוך באר של צלחת 96 היטב.
- למדוד את הפלואורסצנטיות של כל באר באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. הגדר את אורך גל העירור על 540 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ב 590 ננומטר.
- הליך שחזור
- חזור על שלבים 4.1.1-4.1.5.
- הוסף 0.5 מ"ל של מדיית DMEM/F12 לכל באר.
- דגירה קבוצה אחת של תרבויות עבור 18 שעות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
- הסר את המדיה ולהוסיף 0.5 מ"ל של 10% פתרון צבע מטבולי. חזור על שלבים 4.1.7 ו- 4.1.8.
5. ניתוח נתונים
- חשב את הפלואורסצנטיות הממוצעת של פקד המדיה. חשב את הכדאיות באחוזים של המדגם באמצעות הנוסחה הבאה:
אחוז הכדאיות של המדגם = דגימת בדיקה פלואורסצנטיות / בקרת מדיה פלואורסצנטיות x 100
הערה: ממוצע בקרת המדיה הוא 100% כדאיות. לצבע המטבולי כשלעצמו יש כמות קטנה של פלואורסצנטיות הקשורה אליו. ניתן להחסיר את הפלואורסצנטיות של מגיב הצבע המטבולי מפלואורסצנטיות דגימת הבקרה והבדיקה לפני חישוב % הכדאיות של דגימות הבדיקה לבקרת המדיה. - בצע בדיקת נורמליות ובדיקה של שונות שווה בדגימות הבקרה והבדיקה.
- אם בדיקת הנורמליות עוברת והשונות שווה, בצע ANOVA חד-כיווני. כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות ספציפיות, בצעו השוואות זוגיות לאחר בדיקת הוק (כלומר, בדיקות ההשוואות המרובות של Tukey או Dunnett).
- אם בדיקת הנורמליות עוברת והשונות שונה, בצע את ANOVA של וולש. כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות ספציפיות, בצעו השוואות זוגיות לאחר בדיקת הוק (כלומר, בדיקות השוואות מרובות של Dunnett או Games-Howell).
- אם בדיקת הנורמליות נכשלת, יש להשתמש במבחן לא פרמטרי (כלומר, מבחן קרוסקל-וואליס). כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות ספציפיות, בצעו השוואות זוגיות לאחר בדיקת הוק (כלומר, הבדיקה של דאן).
Representative Results
תוצאות ממחקר המשווה בין שלוש ניסוחים של עיניים יבשות מוצגות באיור 1. נתון זה מראה כי ישנם הבדלים בהשפעה שיש לשלושת המוצרים, #1 הפתרון, #2 פתרון ופתרון #3 (שולחן החומרים) על הכדאיות של HCEC. #1 פתרון ופתרון #2 הייתה השפעה משמעותית על הפעילות המטבולית של HCEC לפני התייבשות. משמעות הדבר היא כי ישנם רכיבי ניסוח במוצרים אלה שיכולים לשבש את הפעילות המטבולית של HCEC. הירידה הנוספת בפעילות המטבולית של התאים שהתרחשה לאחר התאוששות של 18 שעות של תאים שנחשפו לפתרון #1 מראה כי HCEC נפצע בתחילה ולאחר 18 שעות הפציעה לא תוקנה. לשם השוואה, לפתרון #3 הייתה השפעה קלה בלבד על הפעילות המטבולית של HCEC.
איור 2 מראה את ההשפעה של ניסוחים אלה המכילים שומנים בעין יבשה על הגנה על תאים. עם כמעט 0% פעילות מטבולית HCEC במרווח התאוששות 18 שעות, #1 פתרון #2 פתרון לא להגן על התאים מפני לחץ התייבשות. פתרון #3, לעומת זאת, הציע הגנה מסוימת מפני לחץ ייבוש.
איור 1: ההשפעה של מוצרים משופרים של שומנים בעין יבשה על הכדאיות של התאים. כדאיות יחסית נמדדת על ידי פעילות מטבולית HCEC לאחר טיפול במוצרי עיניים יבשות המכילות שומנים. * = מובהקות סטטיסטית (עמ' < 0.05) ביחס לפתרון #3, Δ = מובהקות סטטיסטית (עמ' < 0.05) ביחס לבקרת המדיה לתקופת ההחלמה המתאימה. גובה מייצג הכלים מייצג את הערך הממוצע ופסי השגיאה הם SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההשפעה של מוצרים משופרים של שומנים בעין יבשה על הגנת התייבשות. ההשפעה של ניסוחים עיניים יבשות המכילות שומנים על הגנה על תאים. פתרון #1 ותמיסה #2 לא הגן על התאים מפני לחץ ייבוש, והם לא התאוששו מהשפעות התייבשות לאורך זמן. לעומת זאת, הפתרון #3 הציע הגנה מסוימת מפני לחץ ייבוש. * p < 0.05 ביחס #3 פתרון, ו Δ = p < 0.05 יחסית למדיה לא מטופלת (בקרה) עבור זמן השחזור המתאים. גובה מייצג הכלים מייצג את הערך הממוצע ופסי השגיאה הם SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה נועד לקבוע את ההשפעות המגנות של פתרונות קרע מלאכותיים נגד התייבשות התא. בתחילה, התאים נחשפים לטיפות העיניים היבשות כדי לצפות את התאים. לאחר מכן, התאים מיובשים, ואת הפעילות המטבולית מנוטר כדי להעריך אם ניסוחים יכול להקל על ההשפעות המזיקות של מתח התייבשות. צעדים אלה הם קריטיים להבנת ההשפעה הכוללת של ניסוחים עיניים יבשות יכול להיות על הכדאיות הכוללת של תאי אפיתל הקרנית.
לאחר שרוב ניסוחי העין היבשה מוסרים מבארות התרבות, הכימיה של המולקולות הנותרות שנמצאות במגע עם התאים תשפיע על ייבוש התאים. מוצרים מסוימים מכילים מיקרו אמולסיות של שמנים הממזערים את אידוי התאים20. מחקר שהעריך ניתוח חיכוך לאחר השטיפה הראה תחזוקה של חיכוך נמוך עבור כמה ניסוחים עיניים יבשות אשר עשוי להיות אינדיקטור של זמן מגורים משופר של ניסוחים עיניים יבשות21. אחת המגבלות של מבחנה זו היא שלמרות שניתן להעריך הגנה מיובשת בהשוואה לניסוחים אחרים של טיפת עיניים, לא ניתן לקבוע את משך ההגנה הזו בשל זמן הייבוש הקצר המוערך. זמני ייבוש ארוכים יותר במבחנה זו עשויים לדרוש שימוש בתרבויות רב שכבתיות שיש להן בסך הכל יותר תכולת לחות מאשר מונולאייר של תאים.
ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמני הדגירה הספציפיים עבור הניסוחים בתאים ואת משך זמן הייבוש אם ערכי הטמפרטורה והלחות משתנים. בחירת טמפרטורה, RH וזרימת אוויר עבור הדמיית תנאי מתח סביבתי שיכולים לתרום לעין יבשה יכול להיות קשה כמו התנאים הסביבתיים העונתיים והמקומיים הם משתנים למדי21. תאי סביבה מודרניים למחקרים בבני אדם יכולים לשנות את הטמפרטורה בין 5 °C (70 °F) ו 35 °C (60 °F), ו RH בין 5% ו 95%22. באמצעות אידוי ומשתפי מגן מצוידים היטב נקבע כי ב RH של 40-45% שיעור האידוי מהקרנית היה 0.037 μL / cm2/ min וב RH של 20-25% שיעור האידוי היה 0.065 μL / cm2/ min23. אם מודל במבחנה מסתכל על ההשפעה המגנה של ניסוחים בתנאי RH נמוכים מאוד כגון במטוסים15, מדבריות, או סביבות מקורה יבשות16, ייתכן שיהיה צורך להפחית את זמני הדגירה כדי להתאים את שיעורי האידוי המשופרים מהתאים. בנוזל הדמעות האנושי, קיימים מגוון שומנים שמקורם במיבומיה ובלוטות אחרות המגנות על הדמעות מפני אידוי. שומנים אלה יש נקודות התכה שונות24. שינויי טמפרטורה יכולים להשפיע על הנזילות של נוזל הדמעות כך שבדיקות המבוצעות בטמפרטורת הסביבה יכולות להיות שונות באופן משמעותי מבדיקות שנערכו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מאז טווח טמפרטורת פני העין הממוצע הוא מ 32.9 כדי 36 °C25, ביצוע הבדיקה ליד טווח טמפרטורה זה מומלץ.
בנוסף לצבע המטבולי (alamarBlue) המשמש בפרוטוקול זה, ישנם ריאגנטים כימיים אחרים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההשפעות של ניסוחים המוצר על פעילות מטבולית של התא. מלחי טטרזוליום (MTT, XTT, MTS, WST) הם כימיקלים חלופיים שניתן להשתמש בהם. ההבדל במלחי הטטרזוליום הוא ש- MTT היא מולקולה טעונה באופן חיובי כך שהיא יכולה להיכנס לציטופלסמה של תאיםחיים 26. MTT הופך בלתי מסיס לאחר הפחתתו על ידי NAD(P)H27. זה חייב להיות solubilized לפני קריאת ספיגה על קורא צלחת. שאר מלחי הטטרזוליום טעונים באופן שלילי28. הם חייבים להיות מופחתים על ידי מולקולות משניות מחוץ לתא החי כי הם לא יכולים להיכנס לתא ולקיים אינטראקציה ישירה עם מולקולות תאיים29. עבור XTT, MTS, ו WST-1 מבחנים, התוספת של סוכן צימוד אלקטרונים 1-methoxy phenazine methosulfate (PMS) יכול לשפר את הביצועים של מבחני30. בניגוד למבחנים המטבוליים המשתמשים במלחי טטרזוליום, alamarBlue אינו דורש סוכני צימוד סולוביליזציה או אלקטרונים נוספים. כמו כן, שלא כמו XTT, MTS או WST-1, alamarBlue חודר קרום התא והוא יכול להיות מופחת ישירות על ידי אנזימים הסלולר27,29. השוואה ישירה של alamarBlue למלחי tetrazolium הראו כי alamarBlue רגיש יותר להערכת הפעילות המטבולית של קווי תאים שונים כולל HCEC3,27,31,32.
נקודות קצה ביוכימיות אחרות יכולות להיחשב גם להערכת ההגנה על תאי אפיתל הקרנית האנושיים על ידי התייבשות. צבעים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי לזהות חדירות קרום התא ופעילות אסטראז התא1. כמו כן, אפופטוזיס יכול להיות מזוהה על ידי כתמים עבור סמנים אפופטוטיים על פני התא או על ידי מדידה עבור פעילות caspase1,33. מבחנים אחרים קבעו את ההשפעות של מוצרים אופטלמולוגיים על צמתים הדוקים HCEC34. מבחנים אלה יכולים להיות משולבים בהערכות עתידיות תוך שימוש בהליכי הייבוש המתוארים במאמר זה.
ישנם גורמים רבים של עין יבשה. עין יבשה יכולה להיגרם על ידי הפרשת ירידה של דמעות, דלקת פני העין מוגברת או התייבשות מוגברת על פני העין. עבור אנשים שיש להם אידוי שימוש בעין יבשה טיפה המונעת התאים שלהם להתייבש במהלך תנאי ייבוש עשוי להקל על הסימפטומים של עין יבשה. אחת הבעיות בכמה ניסוחים עיניים יבשות היא נוכחות של חומרים משמרים שעלולים לפגוע במשטח העין. פגיעה בתאים אינה מועילה לחולי עיניים יבשים מכיוון שהיא יכולה לגרום ליותר תאים למות מכיוון שתאים פצועים רגישים יותר ללחץ ייבוש35.
מאמר סקירה שנערך לאחרונה על ידי Garrigue et al.36 מספק הערכה של הידע הנוכחי של איך מוצרים מבוססי שומנים פועלים כדי להקל על עין יבשה אידוי. הוספת שומנים לדמעות חסרות שומנים יכולה למנוע אידוי, ובכך להגן על התאים מפני התייבשות. בנוסף, humectants הם מולקולות למשוך ולשמור על מים על פני השטח העין37. גם גליצרין בתמיסה #1 וגם פרופילן גליקול בתמיסה #3 הם humectants. פתרון #3 הראה השפעה הגנתית גדולה יותר של HCEC שאולי היה בשל תכונות השומנים ולחות של מרכיבי הניסוח.
פרוטוקול זה נועד להעריך את הפעילות המטבולית של HCEC לאחר חשיפה לניסוחים של העין היבשה וללחץ ייבוש. באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה, ניתן לפתח טיפות עיניים חדשות שאינן מרגיזות ומגוננות עבור אנשים הסובלים מעין יבשה מתאדה.
Disclosures
שלושה סופרים (רקה רנגרג'אן, הווארד א. קטלסון, לאקשמן סובארמן) הם עובדי אלקון. אלקון היא המקור היחיד למימון ונותני חסות לפרויקט זה. לינדון ו. ג'ונס, במהלך 3 השנים האחרונות, קיבל תמיכה מחקרית או הרצאות מכובדות מהחברות הבאות: אלקון, אלרגן, קונטמאק, קופר ויז'ן, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, נוברטיס, PS Therapy, סנטן, שייר, SightGlass ו-Visioneering. לינדון ג'ונס הוא גם יועץ ו/או מכהן בוועדה המייעצת של אלקון, קופר ויז'ן, J&J Vision, נוברטיס ואופטק. לרשימת המחברים הבאה אין מה לחשוף: ריצ'רד דו, דיוויד ג'יי מקאן, אדלין סוקו, דריל אנסטון, ג'איה דנטאם.
Acknowledgments
המחברים מודים לאלקון על מתן תמיכה כספית למחקרים אלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
- Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
- Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
- Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
- Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
- Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
- Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
- Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
- Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
- Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
- Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
- Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
- van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
- Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
- Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
- Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
- Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
- McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
- Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
- Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
- Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
- Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
- Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).
