Summary
Syftet med detta protokoll är att utvärdera om olika konstgjorda tår formuleringar kan skydda mänskliga hornhinnans epitelceller från uttorkning med hjälp av en in vitro-modell. Efter exponering för konstgjorda tår formuleringar och uttorkning, mänskliga hornhinnans epitelial celler bedöms för metabolisk aktivitet.
Abstract
Konstgjorda lipidhaltiga tårformuleringar utvecklas för att minska tåravdunstning genom restaurering av ett bristfälligt tårfettskikt. Konstgjorda tår formuleringar som förhindrar cell uttorkning kommer att resultera i okulärt ytskydd och underhåll av cellmetabolisk aktivitet. Under uttorkning genomgår cellerna processen att förlora metabolisk aktivitet och därefter celldöd. Detta arbete beskriver en metod för att bedöma effekten av konstgjorda tår formuleringar. Det metaboliska färgämnet (dvs. alamarBlue) ändras från en låg fluorescerande molekyl återförsäljningzurin till en fluorescerande molekyl resorufin i livskraftiga celler. Den biologiska prestandan hos en artificiell tårformulering mäts som formuleringens förmåga att a) bibehålla cellens livskraft och (b) ge cellskydd mot uttorkning. Tillväxtmedier och saltlösning används som kontroller för cellens livskrafts-/uttorkningstester. Cellerna inkuberas med testlösningar i 30 min och uttorkas sedan i 0 eller 5 min vid 37 °C och 45% relativ luftfuktighet. Cellmetabolisk aktivitet efter initial exponering och efter celluttorkning bestäms sedan. Resultaten visar de jämförande effekterna av ögondroppar formuleringar på cellmetabolisk aktivitet och uttorkningsskydd. Denna metod kan användas för att testa torröga formuleringar som är utformade för att behandla individer med avdunstnings torrt öga.
Introduction
Många olika ingredienser i multidos oftalmiska lösningar behövs för att upprätthålla stabilitet, pH, osmolaritet och effekt. Vissa kemikalier som konserveringsmedel eller tensider i okulära lösningar kan dock orsaka skador på hornhinnans epitel1,2. Cell livskraft tester med hjälp av mänskliga hornhinnans epitelial celler (HCEC) kan utföras för att bedöma de potentiella skador som orsakas av dessa olika ingredienser i oftalmiska formuleringar. En av de in vitro-analyser som är särskilt användbara för att bedöma cellskador är alamarBlue-analysen3. I denna analys innehåller det metaboliska färgämnet (dvs. alamarBlue) återförsäljningszurin, som fungerar som en cellviabilitetsindikator. Under cellulär andning reduceras resazurin till resorufin genom att acceptera elektroner4. Minskningen av resorufin orsakar en förändring från en icke-fluorescerande molekyl till en fluorescerande molekyl som kan detekteras med hjälp av en spektrofluorometer5.
Denna undersökning använder två olika behandlingar av hornhinnans epitelceller för att avgöra hur torra ögon produkter kan fungera i en in vitro modell. I den första utvärderingen behandlas cellerna med dessa produkter i 30 minuter. Efter behandlingen utvärderas cellerna sedan för metabolisk aktivitet omedelbart efter exponering för torra ögonprodukter och efter ett återhämtningstidsintervall. Denna bedömning bestämmer effekten av dessa produkter på celler före uttorkning i en fuktighetskammare. Lösningsbevarande medel, tensider eller buffertar i dessa lösningar kan ha vissa cytotoxiska effekter på cellerna som kan detekteras med hjälp av det metaboliska färgämnet.
Den andra utvärderingen avgör cellernas metaboliska aktivitet efter exponering för torra ögonprodukter och uttorkning. I denna bedömning, om produktbehandlingen ger skydd för cellerna från uttorkningsskador, kommer cellernas metaboliska aktivitet att bibehållas. Cellskydd mot de skadliga effekterna av uttorkning kan uppstå om torrögatprodukten kan täcka cellerna med lipider eller produkten kan absorbera vätska från omgivningen som tillför fukt till cellerna.
Detta protokoll är utformat för att simulera svåra förhållanden av miljöbelastning på celler. Andra studier har använt olika modeller för att skapa denna externa stress. Vissa studier har torkat cellerna i laminära flödeshuvar6,7,8, medan andra har använt rumstemperatur och olika relativa fuktighetsvärden (RH)9,10,11. En metod för att simulera torra ögonförhållanden är att öka osmolariteten hos inkubationslösningen12,13. En annan in vitro-metod för att simulera ogynnsamma miljöförhållanden är att tillsätta cytokiner till cellmedierna för att simulera tårvätskan hos torra ögonpatienter14. Även om dessa tester är intressanta modeller som kan utvärdera hur kemikalier minskar osmotisk stress eller stimulerar immunsystemet, visar dessa modeller inte direkt hur kemiska formuleringar kan skydda celler från uttorkningsstress.
Uttorkningsmodellen använder en temperatur-/fuktighetskammare 37 °C och 45 % RH. Den simulerar miljöförhållanden som kan orsaka avdunstning från den okulära ytan. Simuleringar av andra extrema miljöförhållanden som den låga luftfuktighet som finns iflygplanshytter 15 eller i inomhusmiljöer under vintermånaderna16 kan också utföras med denna metod.
Cellkulturmodellering används för att simulera effekten av uttorkningsstress på den mänskliga hornhinnan. För att upptäcka cellstress utförs cellens livskraftstestning för att fastställa påverkan på cellhälsan. Flera olika fysiologiska tester kan utföras på celler för att avgöra om de är stressade17. Analysen som utförs i detta testförfarande använder det kommersiellt tillgängliga metaboliska färgämnet(Materialförteckningen). Det har fördelen jämfört med många andra cellstresstester genom att det är giftfritt, lösligt i tillväxtmedier och kan utvärdera celler utan cellfixering18. I detta förfarande testas cellerna för metabolisk aktivitet omedelbart efter varje behandling och en andra uppsättning celler placeras tillbaka i tillväxtmedier och utvärderas efter 18 h återhämtning. Anledningen till testning omedelbart och sedan efter en återhämtningsperiod är att identifiera cellskador som orsakar omedelbara effekter på metabolisk aktivitet och cellskador som orsakar fördröjda effekter. Det ger också en möjlighet att utvärdera effekten av dessa formuleringar på kortsiktiga kontra långsiktiga skador och formuleringarna förmåga att återhämta sig / inte återhämta sig från den första förolämpningen.
Denna undersökning används för att jämföra olika lipidinnehållande torra ögonprodukter för deras effekt på HCEC metabolisk aktivitet med och utan uttorkning. Ingredienserna i de testade torra ögonprodukterna beskrivs i Table of Materials. Ingredienserna i lösning #1 är karboxymetylcellulosanatrium (0,5%), glycerin (1%), och polysorbat 80 (0,5%), i lösning #2 de är lätt mineralolja (1,0%) och mineralolja (4,5%), och #3 lösning är lipiden mineralolja och propylenglykol är demulcent. Dessa lipider är de formuleringskomponenter som förväntas ge skydd av HCEC mot uttorkning.
Protocol
1. Mänsklig hornhinnans epitelcellskultur
- Odla odödlig HCEC19 i kollagenbelagda 75 cm2 flaskor med 20 ml Dulbeccos modifierade Eagle medium/näringsblandning F-12 (DMEM/F12) innehållande 10% fetala nötkreatursserum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin vid 37 °C med 5% CO2.
OBS: Skakning krävs inte. - Byt media var 2−3:e dag.
2. Beredning av celler för testning
- När cellerna nästan är sammanflöde ta bort odlingsmedier.
- Tillsätt 4−6 ml celldeassociationslösning till varje 75 cm2 flaskor. Inkubera cellerna vid 37 °C tills cellerna lossnar (cirka 20−30 min) och kontrollera under mikroskopet regelbundet.
- Tillsätt 2−6 ml DMEM/F12 som innehåller 10 % FBS till varje 75 cm2 kolv.
- Överför innehållet i kolven till ett 50 ml centrifugeringsrör.
- Centrifugera cellerna vid 450−500 x g i 5 min. Pipet ut supernatant och återanvänd cellerna i förvärmda medier.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Beräkna medievolymen som innehåller totalt 1 x 105 celler.
- Tillsätt 1 x 105 celler till varje brunn på en 48 brunn kollagen-1 bebelagd odlingsplatta. Lägg till tillräckligt med media till brunnen så att den slutliga medievolymen i brunnen är 0,5 ml kultur DMEM / F12 med 10% FBS.
OBS: En konstgjord tårformulering kan orsaka cytotoxicitet som kan mätas genom en minskning av HCEC:s metaboliska aktivitet. Konsekvensen i data är beroende av att samma antal HCEC tillsätts till varje brunn vid sådd. Odlingskoncentrationen som rekommenderas för 48 brunnsplattor är 1 x 105. Eftersom däggdjursceller kan bosätta sig i centrifugröret efter återupplivning, rekommenderas att återanvända cellerna genom agitation ofta medan man sår plattorna med celler så att cellfjädringen har HCEC jämnt fördelad. - Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i 24 timmar.
3. Inget uttorkningsprotokoll
- Kontrollförfarande
- Efter 24 h inkubation ta bort kulturmedierna från plattan.
- Behandla omedelbart med 150 μL av en testformulering och mediekontrolllösning.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter.
- Ta bort testlösningarna från cellerna.
- Tillsätt 0,5 ml 10% metabolisk färglösning för att testa för metabolisk aktivitet. Inkubera cellerna i ytterligare 4 timmar vid 37 °C och 5 % CO2.
- Efter inkubationstiden på 4 timmar, ta bort 100 μL metabolisk färglösning från varje brunn och placera varje 100 μL i en brunn på en 96 brunnsplatta.
- Mät fluorescensen för varje brunn med hjälp av en fluorescerande plåtläsare( Materialförteckning). Ställ excitationsvåglängden på 540 nm och utsläppsvåglängden till 590 nm.
- Inget uttorkningsprotokoll (återställningsprocedur)
- Upprepa steg 3.1.1−3.1.4.
- Tillsätt 0,5 ml DMEM/F12-media till varje brunn.
- Inkubera en uppsättning kulturer i 18 timmar vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ta bort mediet och tillsätt 0,5 ml 10% metabolisk färglösning. Upprepa steg 3.1.6 och 3.1.7.
4. Uttorkningsprotokoll
- Kontrollförfarande
- Efter inkubationen på 24 timmar (steg 2.8) tar du bort odlingsmedierna från plattan.
- Behandla omedelbart med 150 μL av en testformulering och mediekontrolllösning.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter.
- Ta bort testlösningarna från cellerna.
- Placera cellerna i en 37 °C och 45% RH-kammare i 5 minuter för att desiccate cellerna.
- Tillsätt 0,5 ml metabolisk färglösning till testmetabolisk aktivitet. Inkubera cellerna i ytterligare 4 timmar vid 37 °C och 5 % CO2.
- Efter inkubationstiden på 4 timmar, ta bort 100 μL metabolisk färglösning från varje brunn och placera varje 100 μL i en brunn på en 96 brunnsplatta.
- Mät fluorescensen i varje brunn med hjälp av en fluorescerande plåtläsare. Ställ excitationsvåglängden på 540 nm och utsläppsvåglängden till 590 nm.
- Förfarande för återställning
- Upprepa steg 4.1.1-4.1.5.
- Tillsätt 0,5 ml DMEM/F12-media till varje brunn.
- Inkubera en uppsättning kulturer i 18 timmar vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ta bort mediet och tillsätt 0,5 ml 10% metabolisk färglösning. Upprepa steg 4.1.7 och 4.1.8.
5. Dataanalys
- Beräkna mediekontrollens genomsnittliga fluorescens. Beräkna provets procentvis bärkraft med hjälp av följande formel:
Provet är i procent av livskraften = provprovet fluorescens/mediakontroll fluorescens x 100
OBS: Mediekontrollgenomsnittet är 100% livskraft. Det metaboliska färgämnet i sig har en liten mängd fluorescens associerad med det. Fluorescensen hos det metaboliska färgämnesreagenset kan subtraheras från kontroll- och testprovets fluorescens innan testprovernas livskraft beräknas till mediekontrollen. - Utför ett normalitetstest och ett test för lika avvikelser på kontroll- och provexemplar.
- Om normalitetstestet passerar och varianserna är lika utför du en enkelvägs ANOVA. För att identifiera signifikanta skillnader mellan specifika grupper utför man en parvis jämförelse efter hoc-test (dvs. Tukey eller Dunnetts tester med flera jämförelser).
- Om normalitetstestet passerar och varianserna är olika, utför welchs ANOVA. För att identifiera betydande skillnader mellan specifika grupper utför du en parvis jämförelse efter hoc-test (dvs. Dunnetts eller Games-Howell flera jämförelsetester).
- Om normalitetstestet misslyckas ska du använda ett icke-parametertest (t.ex. Kruskal-Wallis-testet). För att identifiera betydande skillnader mellan specifika grupper utför man en parvis jämförelse efter hoc-test (dvs. Dunns test).
Representative Results
Resultat från en studie som jämför tre torröga formuleringar visas i figur 1. Denna siffra visar att det finns skillnader i effekten som de tre produkterna, lösning #1, lösning #2 och lösning #3 (Table of Materials) har på HCEC: s livskraft. Lösning #1 och lösning #2 hade en signifikant effekt på den metaboliska aktiviteten hos HCEC före uttorkning. Detta innebär att det finns formuleringskomponenter i dessa produkter som kan störa HCEC: s metaboliska aktivitet. Den ytterligare minskningen av cellmetabolisk aktivitet som inträffade efter 18 h återhämtning av celler som exponerats för lösning #1 visar att HCEC skadades inledningsvis och efter 18 h skadan reparerades inte. I jämförelse hade #3 endast en mild effekt på HCEC: s metaboliska aktivitet.
Figur 2 visar effekten av dessa lipidhaltiga torröga formuleringar på cellskyddet. Med en nära 0% HCEC metabolisk aktivitet vid 18 h återhämtningsintervallet, lösning #1 och lösning #2 inte cellerna från uttorkning stress. Lösning #3 dock ett visst skydd mot uttorkningsstress.
Figur 1: Effekten av lipidförbättrade produkter med torra ögon påverkar cellens livskraft. Relativ livskraft mätt med HCEC metabolisk aktivitet efter behandling med lipidinnehållande torra ögonprodukter. * = statistisk signifikans (p < 0,05) i förhållande till lösning #3, Δ = statistisk signifikans (p < 0,05) i förhållande till mediekontrollen under lämplig återhämtningsperiod. Höjden på fältet representerar medelvärdet, och felstaplarna är SD. Klicka här för att visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Effekten av lipidförbättrade produkter med torra ögon på uttorkningsskyddet. Effekten av lipidhaltiga torröga formuleringar på cellskyddet. Lösning #1 och lösning #2 inte cellerna från uttorkning stress, och de återhämtade sig inte från uttorkning effekter över tid. Däremot erbjöd lösnings #3 ett visst skydd mot uttorkningsstress. * = p < 0,05 i förhållande till lösning #3 och Δ = p < 0,05 i förhållande till obehandlat (kontroll) medium under lämplig återställningstid. Höjden på fältet representerar medelvärdet, och felstaplarna är SD. Klicka här för att visa en större version av den här figuren.
Discussion
Detta protokoll är utformat för att bestämma de skyddande effekterna av konstgjorda tårlösningar mot celluttorkning. Inledningsvis utsätts cellerna för de torra ögondropparna för att täcka cellerna. Därefter torkas cellerna, och den metaboliska aktiviteten övervakas för att bedöma om formuleringarna kan mildra de skadliga effekterna av uttorkningsstress. Dessa steg är avgörande för att förstå den övergripande inverkan de torra ögon formuleringar kan ha på den övergripande livskraften hos hornhinnans epitelceller.
När de flesta av torrögatformuleringarna har tagits bort från odlingsbrunnarna kommer kemin hos de återstående molekylerna som är i kontakt med cellerna att påverka celluttorkningen. Vissa produkter innehåller mikroemulsioner av oljor som minimerar cellavdunstning20. En studie som utvärderade friktionsanalys efter sköljning visade underhåll av låg friktion för vissa torröga formuleringar som kan vara en indikator på den förbättrade uppehållstiden för torrögatformuleringar 21. En av begränsningarna i denna analys är att även om uttorkningsskydd kan utvärderas i jämförelse med andra ögondroppeformuleringar kan varaktigheten av detta skydd inte bestämmas på grund av den korta torktiden som bedöms. Längre torktider i denna in vitro-analys kan kräva användning av flerskiktskulturer som överlag har mer fukthalt än ett cellmonoskikt.
De specifika inkubationstiderna för formuleringarna på cellerna och torktidens längd kan behöva justeras om temperatur- och fuktighetsvärdena ändras. Att välja en temperatur, RH och luftflöde för att simulera miljöstressförhållanden som kan bidra till torra ögon kan vara svårt eftersom de säsongsbetonade och lokala miljöförhållandena är ganska varierande21. Moderna miljökammare för mänskliga studier kan variera temperaturen mellan 5 °C och 35 °C och RH mellan 5% och 95%22. Med hjälp av en evaporimeter och tätt monterade skyddsglasögon fastställdes att vid RH på 40−45% var avdunstningshastigheten från hornhinnan 0,037 μL/cm2/min och vid RH på 20−25% var avdunstningshastigheten 0,065 μL/cm2/min23. Om in vitro-modellen tittar på den skyddande effekten av formuleringar under extremt låga RH-förhållanden som i flygplan15, öknar eller torrainomhusmiljöer 16, kan inkubationstiderna behöva minskas för att rymma de förbättrade avdunstningshastigheterna från cellerna. I den mänskliga tårvätskan finns en mängd olika lipider som härrör från meibomiska och andra körtlar som skyddar tårarna från avdunstning. Dessa lipider har olika smältpunkter24. Temperaturförändringar kan påverka vätskan hos tårvätskan så att tester som utförs vid omgivningstemperatur kan ha betydligt annorlunda avdunstningshastigheter än tester som utförs vid 37 °C. Eftersom det genomsnittliga okulära yttemperaturområdet är från 32,9 till 36 °C25rekommenderas att testet framförs nära detta temperaturområde.
Förutom det metaboliska färgämne (alamarBlue) som används i detta protokoll finns det andra kemiska reagenser som kan användas för att bedöma effekterna av produktformuleringar på cellmetabolisk aktivitet. Tetrazoliumsalterna (MTT, XTT, MTS, WST) är alternativa kemikalier som kan användas. Skillnaden i tetrazoliumsalterna är att MTT är en positivt laddad molekyl så att den kan komma in i cytoplasman i levande celler26. MTT blir olösligt efter minskningen med NAD(P)H27. Den måste vara löslig före läsabsorbans på en plåtläsare. De andra tetrazoliumsalterna är negativt laddade28. De måste minskas med sekundära molekyler utanför levande cell eftersom de inte kan komma in i cellen och interagera direkt med intracellulära molekyler29. För testerna XTT, MTS och WST-1 kan tillsats av ett elektronkopplingsmedel 1-metoxifenazinmefosulfat (PMS) förbättra prestandan hos analyserna30. I motsats till de metaboliska analyser som använder tetrazoliumsalter kräver alamarBlue inte ytterligare lösliga eller elektronkopplingsmedel. Till skillnad från XTT, MTS eller WST-1 tränger alamarBlue in i cellmembran och kan minskas direkt med celluläraenzymer 27,29. Direkt jämförelse av alamarBlue med tetrazoliumsalter har visat att alamarBlue är känsligare för att utvärdera den metaboliska aktiviteten hos olika cellinjer inklusive HCEC3,27,31,32.
Andra biokemiska effektmått kan också övervägas för att utvärdera skyddet av mänskliga hornhinnans epitelceller genom uttorkning. Fluorescerande färgämnen kan användas för att upptäcka cellmembranpermeabilitet och cellesterasaktivitet1. Apoptos kan också detekteras genom färgning för apoptotiska markörer på cellytan eller genom att mäta för caspase aktivitet1,33. Andra analyser har fastställt effekterna av oftalmiska produkter på HCEC snäva korsningar34. Dessa analyser kan införlivas i framtida bedömningar med hjälp av de uttorkning förfaranden som beskrivs i denna artikel.
Det finns många orsaker till torra ögon. Torra ögon kan orsakas av minskad utsöndring av tårar, ökad okulär ytinflammation eller ökad uttorkning vid okulärytan. För de individer som har avdunstningsvis torr ögonanvändning av en torr ögondroppe som hindrar deras celler från att torka under uttorkningsförhållanden kan lindra symtomen på torra ögon. Ett av problemen i vissa torra ögonformuleringar är närvaron av konserveringsmedel som kan skada den okulära ytan. Att skada celler är inte till hjälp för torra ögonpatienter eftersom det kan orsaka fler celler att dö eftersom skadade celler är mer mottagliga för uttorkningsstress35.
En nyligen publicerad recensionsartikel av Garrigue et al.36 ger en bedömning av den aktuella kunskapen om hur lipidbaserade produkter verkar för att lindra avdunstnings torra ögon. Att lägga till lipider till lipidbristande tårar kan förhindra avdunstning, vilket skyddar cellerna från uttorkning. Dessutom är humectants molekyler som lockar och behåller vatten vid den okulära ytan37. Både glycerin i lösning #1 och propylenglykol i lösnings#3 humectants. Lösning #3 visade en större skyddande effekt av HCEC som kan ha berott på lipid och fuktiga egenskaper hos formulering ingredienserna.
Detta protokoll är utformat för att utvärdera den metaboliska aktiviteten hos HCEC efter exponering för torra ögon formuleringar och till uttorkning stress. Genom att använda de metoder som beskrivs i denna artikel kan nya ickeirriterande och skyddande ögondroppar utvecklas för personer som lider av avdunstnings torrt öga.
Disclosures
Tre författare (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) är anställda på Alcon. Alcon är den enda finansieringskällan och sponsorn av detta projekt. Lyndon W. Jones har under de senaste 3 åren fått forskningsstöd eller föreläsningshederior från följande företag: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass och Visioneering. Lyndon Jones är också konsult och/eller sitter i en rådgivande styrelse för Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis och Ophtecs. Följande lista över författare har inget att avslöja: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.
Acknowledgments
Författarna tackar Alcon för att ha gett ekonomiskt stöd till dessa studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
- Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
- Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
- Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
- Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
- Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
- Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
- Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
- Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
- Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
- Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
- Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
- van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
- Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
- Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
- Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
- Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
- McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
- Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
- Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
- Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F.
- Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
- Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).
