A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Effektiv differentiering af postganglioniske sympatiske neuroner ved hjælp af humane pluripotente stamceller under Feeder-fri og kemisk definerede kulturbetingelser
Chapters
Summary May 24th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I denne protokol beskriver vi en stabil, yderst effektiv differentieringsstrategi for generering af postganglioniske sympatiske neuroner fra menneskelige pluripotente stamceller. Denne model vil gøre neuroner til rådighed for brug af undersøgelser af flere autonome lidelser.
Transcript
Denne protokol tillader afledning af sympatiske neuroner fra menneskelige pluripotente stamceller. Disse celler vil gøre det muligt for en videnskabsmand at studere menneskelige lidelser, der påvirker det sympatiske nervesystem. Denne teknik gør det muligt at udlede sympatiske neuroner i opdelte feeder-fri mødebetingelser på en høj skalerbar effektivitet.
Det resulterer i elektrisk aktive neuroner i 20 dage. Denne teknik kan anvendes på sygdomme forårsaget af en dysfunktionel sympatisk nervesystem, det også kan bruges til sygdom modellering, regenerativ medicin, og lægemiddelscreening. Disse celler kan anvendes in vitro til at innovere væv i et co-kultursystem, for eksempel til undersøgelse af regulering af hjertevæv.
Når den menneskelige pluripotente stamcellekultur når 80 til 90% sammenløbet, bør store kolonier med glatte lyse kanter observeres. Til opdeling vaskes kulturen med PBS, før cellerne behandles med fire milliliter 0,25 molar EDTA ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid. Efter to minutter skylles pladen med 10 milliliter E8-medium, og den fritliggende cellesuspension overføres til et konisk rør på 15 milliliter.
Derefter overføres 500 mikroliter af celler til et 9,5 milliliter aliquot frisk E8-medium. Og plade stamcellerne på nye vitronectin belagt 100 millimeter retter. En dag før differentiering induktion, pels det passende antal af seks godt plader med to milliliter kælder membran matrix per brønd.
Og opbevar pladerne ved fire grader Celsius natten over. Næste morgen, varm pladerne til stuetemperatur og vask klar til at opdele menneskelige pluripotente stamcellekultur to gange med frisk PBS per vask. Efter den anden vask behandles cellerne med syv milliliter 0,5 millimolar EDTA i 15 minutter i cellekulturinkubatoren, før de flydende humane pluripotente stamceller aspirerer, og de høstede celler overføres til et 50 milliliterrør.
Der tilsættes et tilsvarende volumen PBS til røret for at fortynde EDTA'en og indsamle cellerne ved centrifugering. Pelletsuspendrer pelletet igen i et milliliter af dag 01-differentieringsmediet, før der tilsættes et passende mediumvolumen til regnskabsføring. Fortyndes cellerne til en 1,25 gange 10 til de femte celler pr kvadratcentimeter koncentration i milliliter differentiering medium pr brønd.
Aspirere alle kælderen membran matrix løsning fra hver brønd af den tidligere forberedt til seks godt plade. Derefter frø to milliliter celler i hver brønd og læg pladen i cellekulturinkubatoren. Den næste morgen, fodre cellerne med tre milliliter af dagen 01 differentiering medium per brønd.
På dag to af differentiering, fodre cellerne med tre milliliter dag to til 10 differentiering medium pr brønd, derefter fodre cellerne hver anden dag indtil dag 10. At samle neurale crest celler i sfæroider, på dag 10, vaske cellerne med PBS. Og tilsæt to milliliter dissociation medium til hver brønd.
Efter 20 minutter i cellekulturinkubatoren overføres de flydende celler til et konisk rør på 50 milliliter, og suspensionsmængden i røret bringes op på 50 milliliter med frisk PBS. Indsamle cellerne ved centrifugering. Og resuspend pellet i et tilstrækkeligt volumen af dag 10 til 14 sfæroide medium til optælling.
Efter optællingen fortyndes cellerne til fem gange 10 til de femte celler pr. 500 mikroliters koncentration ved hjælp af dag 10 til 14 sfæroide medium. Og plade 500 mikroliter af celler i hver brønd af en ultra lav vedhæftet fil 24-brønd plade. Vend derefter cellerne tilbage til cellekulturskuvøsen.
At fremkalde en minimal sfæroid kultur, på dag 11 af kultur, fodre neurale crest sfæroider med en yderligere 500 mikroliter af dagen 10 til 14 sfæroide medium per godt. På dag 12 vippes pladen for at samle sfæroiderne på den ene side af pladen. Og omhyggeligt aspirere så meget medium som muligt fra hver brønd uden at aspirere sfæroider.
Derefter fodres sfæroider med en milliliter dag 10 til 14 sfæroide medium per brønd. At fremkalde en udvidet sfæroide kultur, på dag 15, fodre sfæroider med 1,5 milliliter af dagen 10 til 14 sfæroide medium suppleret med 0,5 mikromolar retinsyre per brønd. Derefter returneres sfæroiderne til cellekulturinkubatoren.
For sympatisk neuron differentiering, på dag 14 eller 28, vippe pladen til at akkumulere sfæroider på den ene side af pladen og omhyggeligt aspirere så meget medium som muligt. Fodre cellerne med en milliliter af sympatisk neuron medium. At bryde op store sfæroid aggregater i mindre sfæroider, tilføje ikke mere end en milliliter medium per godt og pipette sfæroider fem til 10 gange før opdeling.
Og fjern den overskydende laminin fibronectin fra tidligere forberedte 24-brønds plader. Split pladen en milliliter af sfæroider fra hver brønd på 24-brønde sfæroide kultur plade mellem fire separate brønde af den nye belagte 24-brønd plade. Tilføj 250 mikroliter af frisk sympatisk neuron medium til hver brønd.
Og læg pladen i cellekulturskuvøsen. Den næste morgen, erstatte mediet i hver brønd med en milliliter sympatisk neuron medium suppleret med 0,125 mikromolar retinsyre og returnere pladen til cellekultur inkubator. Efter dag 35 fodres neuronerne ved omhyggeligt at erstatte halvdelen af det eksisterende medium i hver brønd med frisk medium.
Før differentiering, bør den menneskelige pluripotente stamceller kolonier være runde med skinnende, glatte kanter og lidt at ingen differentiering. Cellerne udtrykker den neurale crest markør Sox10 fra dag fire til 10. Neurale crest celler opstår i tætte mørke højderygge, der er synlige fra dag seks på.
Disse kamme også udtrykke Sox10. På neurale crest celler fase, Sox10 korrelerer med cellen overflade markør CD49D, som kan bruges til at sortere neurale crest celler. Positive sorterede og usorterede populationer produceret neurale crest sfæroider på en lignende måde.
Mens negative sorterede celler ikke samles ordentligt, ikke producerer runde, glat sundt udseende sfæroider og dø inden for tre til fire dage. Endvidere, når neurale crest sfæroider sammenlignes på dag 14, den kvantitative omvendte transskription PCR for neurale crest og sympatiske nerve progenitor markører, betydelige forskelle mellem de sorterede og usorterede celler kan ikke påvises. På dag 20 eller 35, de respektive minimale eller udvidede protokoller, neuroider kan observeres vokser i et radialt mønster fra de vedlagte sfæroider.
Markører relateret til noradrenalin syntese og transport er udtrykt på dette tidspunkt, samt Hox6 gennem ni stammen neurale crest gener. Elektrofysiologisk optagelse registrerer også neural aktivitet fra dag 20 på. En sådan aktivitet kan forbedres eller undertrykkes af lægemidler, der er målrettet autoreceptorer af sympatiske neuroner justere funktionaliteten af differentierede neuroner.
Den menneskelige fortaler selv skal være sund starter på dag nul af differentiering, ellers vil forsøget sandsynligvis mislykkes. Farmakologiske hæmmere eller aktivatorer kan føjes til neuroner til at forstå deres normale eller patologiske adfærd. Denne metode åbner en ny vej for at studere sympatisk biologi og patologi, da det nu er muligt at opnå biopsier af sympatiske neuroner fra mennesker nemt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
