यह प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ (पीडीएक्स) की विट्रो संस्कृति में विस्तारित को सक्षम करने के तरीकों को दर्शाता है। एक कदम गैर-व्यवहार्य एकल कोशिकाओं को सीधे हटाने के माध्यम से 3 डी हाइड्रोगेल में बहुकोशिकीय क्लस्टर संस्कृतियों की समग्र व्यवहार्यता को बढ़ाता है। एक द्वितीयक कदम एक छिद्रित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में पीडीएक्स संस्कृति के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को दर्शाता है।
रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स), उत्पन्न जब रोगी ट्यूमर ऊतक को सीधे इम्यूनोसमझीज़ चूहों में संलग्न किया जाता है, जैविक रूप से स्थिर रहते हैं, जिससे आणविक, आनुवंशिक और हिस्टोलॉजिकल सुविधाओं के साथ-साथ मूल ट्यूमर की विषमता भी होती है। हालांकि, इन मॉडलों का उपयोग करने के लिए दवा स्क्रीनिंग सहित प्रयोगों की एक भीड़ प्रदर्शन, लागत और समय दोनों के मामले में निषेधात्मक है । त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों को व्यापक रूप से प्लेटफार्मों के रूप में देखा जाता है जिसमें कैंसर कोशिकाएं जैव रासायनिक बातचीत, आकृति विज्ञान और वास्तुकला के माध्यम से अपनी जैविक अखंडता को बनाए रखती हैं। हमारी टीम के पास हायलूरोनिक एसिड (एचए) से बने 3डी मैट्रिस का उपयोग करके विट्रो में पीडीएक्स कोशिकाओं को बनाने का व्यापक अनुभव है। पीडीएक्स से जुड़े माउस फाइब्रोब्लास्ट स्ट्रोमल कोशिकाओं को अलग करने के लिए, हम रोटेशन संस्कृति का उपयोग करते हैं, जहां स्ट्रोमल कोशिकाएं ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों की सतह का पालन करती हैं जबकि अलग-अलग पीडीएक्स ट्यूमर कोशिकाएं बहुकोशिकीय समूहों में तैरती हैं और स्वयं-सहयोगी होती हैं। इसके अलावा सुपरनैंट में तैरने वाली एकल, अक्सर मृत कोशिकाएं होती हैं, जो 3 डी सेल संस्कृति के लिए हाइड्रोगेल में डाउनस्ट्रीम एनकैप्सुलेशन के लिए व्यवहार्य पीडीएक्स क्लस्टर एकत्र करने में एक चुनौती पेश करती हैं। इन एकल कोशिकाओं को लाइव सेल क्लस्टर से अलग करने के लिए, हमने घनत्व चरण ढाल अपकेंद्रित्र को नियोजित किया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल समूहों की स्वस्थ आबादी से गैर-व्यवहार्य एकल कोशिकाओं की कमी के लिए अनुमति देता है जिसका उपयोग आगे विट्रो प्रयोग के लिए किया जाएगा। हमारे अध्ययनों में, हम माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटों में 3 डी संस्कृतियों को शामिल करते हैं जो संस्कृति के दौरान मीडिया परफ्यूजन की अनुमति देते हैं। शुद्ध बनाम गैर-शुद्ध कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवि-आधारित व्यवहार्यता परख का उपयोग करके परिणामी संस्कृतियों का आकलन करने के बाद, हमारे परिणाम बताते हैं कि इस अतिरिक्त पृथक्करण कदम ने हमारी संस्कृतियों से गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को काफी कम कर दिया।
पिछले एक दशक में, कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में कैंसर सेल मार्ग निर्भरता और दवा संवेदनशीलता1का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) के लिए नए सिरे से उत्साह का प्रदर्शन किया है । सबसे आम पीडीएक्स मॉडल मानव ट्यूमर कोशिकाओं के चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण द्वारा स्थापित किए जाते हैं- एक ट्यूमर टुकड़ा, अलग ट्यूमर-व्युत्पन्न कोशिकाओं का एक समूह, या अलग परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) का एक नमूना- एक कृंतक मेजबान में। यदि ट्यूमर “ले” सफल होता है, तो ज़ेनोबेड़ा कोशिकाएं पैदा होंगी, संवहनी करेंगी, और अन्यथा एक ट्यूमर बनाने के लिए मेजबान ऊतक के साथ बातचीत करेंगी, जिसे इष्टतम आकार में काटा जा सकता है, उपविभाजित किया जा सकता है, और अन्य मेजबानों में फिर से प्रत्यारोपित किया जा सकता है। एक मॉडल प्रणाली के रूप में उनके कई फायदों में, पीडीएक्स आमतौर पर देशी ट्यूमर सेल आबादी की विषमता का एक बड़ा हिस्सा बनाए रखते हैं और मानव-विशिष्ट मार्गों और सेल प्रतिक्रियाओं2,,3के आकलन को सक्षम करते हैं। वीवो संदर्भ में वैक्यूलेचर और अन्य आसन्न स्ट्रोमा के साथ ट्यूमर बातचीत को सक्षम बनाता है और ऊतक विशेषताओं जैसे दवा प्रसार गतिशीलता, ऑक्सीजन तनाव और बाह्य मैट्रिक्स प्रभाव को पुनः प्राप्त करता है जो जैविक और यांत्रिक रूप से ट्यूमर प्रगति को प्रभावित करता है। पीडीएक्स का एक नकारात्मक पहलू ट्यूमर विस्तार के लिए और अंततः परिकल्पना परीक्षण के लिए एक कृंतक मेजबान पर उनकी निर्भरता है। क्योंकि कई पीडीएक्स अपनी कई वांछनीय विशेषताओं को खोए बिना ऊतक संस्कृति पॉलीस्टीरिन पर पारंपरिक दो-आयामी (2डी) संस्कृति के अनुकूल नहीं हो सकते हैं, इस अपेक्षाकृत नियंत्रित इन विट्रो विधि के बीच शोधकर्ताओं के लिए न्यूनतम मध्य भूमि रही है, और वीवो पीडीएक्स उपयोग में खर्च, सुविधाओं और समय आवश्यकताओं में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है।
हमने कई इन विट्रो मॉडलों का वर्णन किया है जो एक सहायक मैट्रिक्स के भीतर 3 डी सेल संस्कृति को लागू करते हैं, और हाल ही में विस्तारित किया गया है कि कई प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) की पूर्व वीवो संस्कृति को प्रदर्शित करने के लिए काम करें- व्युत्पन्न पीडीएक्स, दोनों अकेले और सह-संस्कृति में बोन मैरो-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट4,,5के साथ। हायलूरोनिक एसिड (एचए) आधारित हाइड्रोगेल मैट्रिस हाइड्रोगेल गहराई6के माध्यम से इमेजिंग के लिए हाइड्रोजेल विशेषताओं और ऑप्टिकल स्पष्टता पर फेसियल नियंत्रण के साथ दोनों सेल प्रकारों के लिए अनुकूलन योग्य और जैविक रूप से प्रासंगिक समर्थन प्रदान करते हैं।
परिपक्व पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों में विषम मानव कैंसर कोशिकाओं और माउस स्ट्रोमा (फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं, आदि) का एक चर मिश्रण शामिल है। विट्रो में ट्यूमर प्रगति के लिए सेल-प्रकार विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने के लिए, ट्यूमर को अलग करना, कोशिका आबादी को अलग करना, और पारस्परिक रूप से उन्हें अंतरकोशिकीय संचार के रास्तों को विच्छेदन करने के लिए संगठित तरीके से शामिल करना लाभप्रद हो सकता है। ऊतक डाइजेस्ट के भीतर मिश्रित कोशिका आबादी में विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के साथ अंतर अनुकूलता होती है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता को या तो सतह पालन या 3डी मैट्रिस को इंटीग्रिन लिगांड के साथ कार्यात्मक होना आवश्यक है, जबकि एपिथेलियल-व्युत्पन्न पीडीएक्स कोशिकाओं में आमतौर पर ये आवश्यकताएं नहीं होती हैं, इसके बजाय सेल-सेल इंटरैक्शन का पक्ष लेते हैं। इन मतभेदों को दूषित माउस स्ट्रोमल कोशिकाओं से PDX कोशिकाओं के प्रभावी जुदाई प्राप्त करने के लिए शोषण किया जा सकता है । ऊतक डाइजेस्ट की रोटेशन संस्कृति स्ट्रोमल कोशिका को ऊतक संस्कृति सतह का पालन करने की अनुमति देती है जबकि सेल-सेल आसंजन 24−48 घंटे में सुपरनेट में बहुकोशिकीय समूह बनाने के लिए घूर्णन संस्कृति सतह के ऊपर तैरते पीडीएक्स कोशिकाओं को ड्राइव करता है। इन समूहों की विशिष्ट विशेषताएं पीडीएक्स (उदाहरण के लिए, बड़े, तंग, अत्यधिक गोलाकार समूहों या छोटे, लूजर समुच्चय अंगूर के गुच्छों जैसी होती हैं), लेकिन आम तौर पर जैविक रूप से प्रासंगिक आकार (50−250 माइक्रोन व्यास) के होते हैं, जो अंतरकोशिकीय संपर्कों पर भरोसा करने वाले सेलुलर इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए पर्याप्त होते हैं।
ट्यूमर पुनर्प्राप्ति और प्रसंस्करण अनिवार्य रूप से कुछ हद तक संपाश्र्वक कोशिका मृत्यु में परिणाम देता है, या तो यांत्रिक/एंजाइमेटिक व्यवधान से अल्पकालिक क्षति के कारण, या चुने हुए संस्कृति स्थितियों के साथ उपआबादी की दीर्घकालिक असंगति । एक प्रारंभिक थोक जुदाई के रूप में रोटेशन संस्कृति की उपयोगिता के बावजूद, मृत या मरने वाली कोशिकाओं को अनिवार्य रूप से पीडीएक्स समूहों के साथ स्थानांतरित कर दिया जाता है और परिणामी संस्कृति को प्रभावित कर सकता है। ये मृत कोशिकाएं अक्सर व्यक्तिगत पीडीएक्स कोशिकाएं होती हैं जिन्हें क्लस्टर में एकीकृत नहीं किया जाता था, माउस स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट जो चयनित संस्कृति स्थितियों, या विशेष रूप से नाजुक एंडोथेलियल कोशिकाओं में जीवित नहीं रह सकते हैं। इस तरह के मरने वाली कोशिकाएं “जीवित बचे” से प्रायोगिक परिणामों को प्रभावित कर सकती हैं और फ्लोरोसेंट छवि-आधारित व्यवहार्यता स्क्रीनिंग परख के माध्यम से मात्राकरण को काफी हद तक प्रभावित कर सकती हैं। इस विधि से जीवित पीडीएक्स कोशिकाओं के चयन में सुधार करने के लिए, हमने पीडीएक्स मिश्रण से व्यक्तिगत मृत/मरने वाली कोशिकाओं को आसानी से हटाने और मुख्य रूप से लाइव बहुकोशिकीय समूहों को बनाए रखने के लिए घनत्व चरणों के साथ अपकेंद्रित्र विधियों को अनुकूलित किया।
3 डी संस्कृति में परिणामी पीडीएक्स-व्युत्पन्न समूहों के अध्ययन को बढ़ाने के लिए, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित परफ्यूजन कल्चर प्लेटफॉर्म, ऑर्गेनोप्लेट(चित्रा 1)का उपयोग किया, जो एक उच्च-थ्रूपुट अंग-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म है जो 384-वेल माइक्रोटिटर प्लेट-बेस(चित्रा 1A)7, 8,8पर 96 व्यक्तिगत परफ्यूस्ड, 3 डी संस्कृतियों की एक साथ संस्कृति के लिए अनुमति देता है। 2-लेन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में, एक ऊतक चिप दो माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों(चित्रा 1B,जेल चैनल: लाल, पर्फ्यूजन चैनल: नीला) से जुड़ा हुआ है जो एक पंक्ति में चार कुओं का विस्तार करता है। दो माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को एक छोटे प्लास्टिक रिज द्वारा अलग किया जाता है जिसे फेजगाइड कहा जाता है जो एक चैनल के ओवरफ्लो को अपने निकटवर्ती पड़ोसी चैनल में रोकता है, और साथ ही जेल और परफ्यूजन चैनल9की सामग्री के बीच झिल्ली मुक्त इंटरफ़ेस की अनुमति देता है। क्योंकि माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट के नीचे माइक्रोस्कोप ग्रेड ग्लास से बना है, संस्कृतियों को एक मानक या स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ प्लेट के नीचे के माध्यम से अवलोकन खिड़की में देखा जा सकता है। पर्फ्यूजन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक प्रोग्रामेबल रॉकर के साथ स्थापित किया गया है, जो जलाशय कुओं(चित्रा 1C)के बीच माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से मीडिया को चलाने के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग कर रहा है। पर्फ्यूजन प्रवाह-नकल स्थिर संस्कृति की तुलना में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को अधिक बारीकी से पुनः रीकैपिटुलेट करता है, जिससे कतरनी तनाव के समावेश और गैसों और पोषक तत्वों के उन्नत वितरण की अनुमति मिलती है। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक परफुसेस कैंसर सेल संस्कृति को बनाए रखने के लाभों को पहले वर्णित किया गया है क्योंकि स्तन कैंसर संस्कृतियों ने एक ही कोशिकाओं की स्थिर 3 डी संस्कृति की तुलना में इष्टतम व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है7।
वर्तमान रिपोर्ट में लाइव मल्टीसेलुलर पीडीएक्स समूहों को अलग-थलग करने के लिए एक अनुकूलित घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधि का वर्णन किया गया है और पर्फ्यूसाबल माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटों के भीतर 3 डी पीडीएक्स संस्कृतियों की स्थापना में इसकी उपयोगिता को दर्शाता है। क्योंकि अनुसंधान प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या PDX उपयोग की सुविधा के तरीकों की मांग कर रहे हैं, हम आशा है कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तत्काल उपयोगिता का होगा ।
यहां हम एक उच्च थ्रूपुट, perfused 3 डी संस्कृति प्रणाली में व्यवहार्य पीडीएक्स-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसंस्करण और खेती के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। जबकि यह प्रोटोकॉल पीसीए पीडीएक्स ऊतक का उपय?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान राष्ट्रीय कैंसर संस्थान SBIR चरण 1 (HHSN26120700015C) और P01CA098912 द्वारा समर्थित किया गया था ।
1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
6-well tissue culture plates | any suitable | ||
70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
Forceps | any suitable | ||
HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
Razor blades | any suitable | ||
Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
Scalpel handle | any suitable | ||
Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |