Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Published: December 5, 2020 doi: 10.3791/60872
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1,5,6, 1,7, 2, 3, 1,5,6
1Department of BioSciences, Rice University, 2Mimetas US Inc, 3Department of Genitourinary Medical Oncology Research, Division of Cancer Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Mimetas B.V., 5Department of Bioengineering, Rice University, 6Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center, 7Sheikh Ahmed Center for Pancreatic Cancer Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Summary

Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.

Abstract

Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), generados cuando el tejido tumoral resecado del paciente se injerta directamente en ratones inmunocomprometidos, permanecen biológicamente estables, preservando así las características moleculares, genéticas e histológicas, así como la heterogeneidad del tumor original. Sin embargo, el uso de estos modelos para realizar una multitud de experimentos, incluyendo la detección de drogas, es prohibitivo tanto en términos de costo como de tiempo. Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) son ampliamente vistos como plataformas en las que las células cancerosas conservan su integridad biológica a través de interacciones bioquímicas, morfología y arquitectura. Nuestro equipo tiene una amplia experiencia en el cultivo de células PDX in vitro utilizando matrices 3D compuestas de ácido hialurónico (HA). Con el fin de separar las células estromales fibroblastas de ratón asociadas con los PDX, utilizamos el cultivo de rotación, donde las células estromales se adhieren a la superficie de las placas tratadas con cultivo de tejidos mientras flotan las células tumorales PDX disociadas y se autoasocien en cúmulos multicelulares. También flotan en el sobrenadante son células simples, a menudo muertas, que presentan un desafío en la recolección de clústeres PDX viables para la encapsulación aguas abajo en hidrogeles para el cultivo celular 3D. Con el fin de separar estas células individuales de los cúmulos de células vivas, hemos empleado centrifugación de gradiente de paso de densidad. El protocolo descrito aquí permite el agotamiento de células individuales no viables de la población sana de grupos celulares que se utilizarán para la experimentación in vitro. En nuestros estudios, incorporamos los cultivos 3D en placas microfluídicas que permiten la perfusión media durante el cultivo. Después de evaluar los cultivos resultantes utilizando un ensayo de viabilidad basado en imágenes fluorescentes de células purificadas frente a no purificadas, nuestros resultados muestran que este paso de separación adicional redujo sustancialmente el número de células no viables de nuestros cultivos.

Introduction

Durante la última década, el campo de la investigación del cáncer ha demostrado un renovado entusiasmo por los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) como una herramienta para evaluar la dependencia de las vías de las células cancerosas y la susceptibilidad a los medicamentos1. Los modelos PDX más comunes se establecen mediante implantación subcutánea u ortotópica de células tumorales humanas (un fragmento tumoral, un grupo de células derivadas de tumores disociadas o una muestra de células tumorales circulantes aisladas (CTC)) en un huésped de roedores. Si la "toma" tumora tiene éxito, las células del xenoinjerto proliferarán, vascularizarán e interactuarán de otra manera con el tejido huésped para crear un tumor, que puede ser cosechado en un tamaño óptimo, subdividido y reim implantado en otros huéspedes. Entre sus muchas ventajas como sistema modelo, los PDX suelen retener una parte sustancial de la heterogeneidad de la población de células tumorales nativas y permiten evaluar las vías específicas del ser humano y las respuestas celulares2,,3. El contexto in vivo permite la interacción tumoral con vasculatura y otros estroma adyacentes y recapitula características tisulares como la dinámica de difusión de fármacos, la tensión de oxígeno y la matriz extracelular influyen en la progresión tumoral biológica y mecánicamente. Un aspecto negativo de los PDX es su dependencia de un huésped de roedores, tanto para la expansión del tumor como, en última instancia, para las pruebas de hipótesis. Debido a que muchos PDX no pueden adaptarse al cultivo bidimensional tradicional (2D) en el poliestireno del cultivo tisular sin perder muchas de sus características deseables, ha habido un mínimo de terreno medio para los investigadores entre este método in vitro relativamente controlado, y el aumento significativo en los requisitos de gasto, instalaciones y tiempo para el uso de PDX in vivo.

Hemos descrito múltiples modelos in vitro que implementan el cultivo celular 3D dentro de una matriz de apoyo, y recientemente ampliamos ese trabajo para demostrar el cultivo ex vivo de los PDX derivados del cáncer de próstata múltiple (PCa), tanto solos como en co-cultivo con fibroblastos derivados de médula ósea4,,5. Las matrices de hidrogel a base de ácido hialurónico (HA) proporcionan un soporte personalizable y biológicamente relevante para ambos tipos de células, con control fácil sobre las características del hidrogel y claridad óptica para la toma de imágenes a través de la profundidad del hidrogel6.

Los tejidos tumorales PDX maduros comprenden una mezcla variable de células cancerosas humanas heterogéneas y estroma de ratón (fibroblastos, células endoteliales, etc.). Para estudiar las contribuciones específicas de tipo celular a la progresión tumoral in vitro, puede ser ventajoso disociar tumores, separar las poblaciones celulares e incorporarlos experimentalmente de manera organizada para diseccionar vías de comunicación intercelular. Las poblaciones de células mixtas dentro de los digestatos de tejido tienen compatibilidad diferencial con condiciones específicas de cultivo. Por ejemplo, la viabilidad de los fibroblastos asociados al tumor requiere adherencia superficial o matrices 3D funcionalizadas con ligandos de integrina, mientras que las células PDX derivadas de la epitelial no suelen tener estos requisitos, sino que favorecen las interacciones entre células células. Estas diferencias se pueden aprovechar para lograr una separación efectiva de las células PDX de contaminar las células estromales del ratón. El cultivo de rotación de digestatos tisulares permite la adherencia de células estromales a la superficie de cultivo del tejido, mientras que las adherencias de células celulares impulsan las células PDX que flotan sobre la superficie de cultivo giratoria para formar cúmulos multicelulares en el sobrenadante en 24-48 h. Las características específicas de estos racimos varían con el PDX (por ejemplo, racimos grandes, apretados, altamente esféricos o agregados más pequeños y más sueltos que se asemejan a racimos de uva), pero suelen tener tamaños biológicamente relevantes (diámetro de 50 a 250 m), suficiente para evaluar las interacciones celulares que se basan en contactos intercelulares.

La recuperación y el procesamiento de tumores inevitablemente dan lugar a algún grado de muerte celular colateral, ya sea debido a daños a corto plazo por perturbación mecánica/enzimática, o incompatibilidad a largo plazo de subpoblaciones con las condiciones de cultivo elegidas. A pesar de la utilidad del cultivo de rotación como separación a granel inicial, las células muertas o moribundas inevitablemente se transfieren con los clústeres PDX y pueden influir en el cultivo resultante. Estas células muertas son a menudo células PDX individuales que no se integraron en un grupo, fibroblastos estromales de ratón que no pueden sobrevivir en condiciones de cultivo seleccionadas, o particularmente células endoteliales frágiles. Estas células moribundas pueden influir en los resultados experimentales de los "supervivientes" y pueden afectar sustancialmente a la cuantificación, por ejemplo, a través de ensayos de cribado de viabilidad basados en imágenes fluorescentes. Para mejorar la selección de células PDX vivas de este método, adaptamos los métodos de centrifugación con pasos de densidad para eliminar fácilmente las células muertas/moribundas individuales de las mezclas PDX y retener predominantemente cúmulos multicelulares vivos.

Para mejorar el estudio de los clusters derivados de PDX resultantes en el cultivo 3D, utilizamos una plataforma de cultivo de perfusión basada en microfluidos, la OrganoPlate (Figura 1), que es una plataforma de órgano en chip de alto rendimiento que permite el cultivo simultáneo de hasta 96 cultivos 3D perfundidos individuales en una base de microtíter de 384 potes(Figura 1A)7,8. En la placa microfluídica de 2 carriles, un solo chip de tejido está conectado por dos canales microfluídicos(Figura 1B,canal de gel: rojo, canal de perfusión: azul) que abarcan cuatro pozos seguidos. Los dos canales microfluídicos están separados por una cresta de plástico corta llamada Phaseguide que evita el desbordamiento de un canal en su canal vecino adyacente, y simultáneamente permite una interfaz libre de membrana entre el contenido del gel y el canal de perfusión9. Debido a que la parte inferior de la placa microfluídica se compone de vidrio de grado microscopio, los cultivos se pueden ver en la ventana de observación a través de la parte inferior de la placa con un microscopio estándar o automatizado. La perfusión se establece en la placa microfluídica con un balancín programable, utilizando la gravedad para conducir medios a través de los canales microfluídicos, entre pozos de depósito (Figura 1C). El flujo de perfusión-imitación más estrechamente recapitula el microambiente tumoral que el cultivo estático, lo que permite la incorporación de estrés de cizallamiento y una mejor distribución de gases y nutrientes. Los beneficios de mantener un cultivo celular de cáncer perfundido en la placa microfluídica se han descrito previamente como cultivos perfundidos de cáncer de mama exhibieron una viabilidad óptima en comparación con un cultivo estático en 3D de las mismas células7.

El presente informe describe un método de centrifugación de gradiente de densidad adaptado para aislar los racimos de PDX multicelulares en vivo y demuestra su utilidad para establecer cultivos 3D PDX dentro de placas microfluídicas perfuibles. Debido a que un número cada vez mayor de laboratorios de investigación están buscando métodos para facilitar el uso de PDX, anticipamos que los protocolos presentados aquí serán de utilidad inmediata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El tejido tumoral se obtuvo con el consentimiento del paciente y de acuerdo con un protocolo aprobado de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los xenoinjertos fueron implantados, cultivados y cosechados de acuerdo con un protocolo aceptado del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC).

NOTA: Todo el trabajo debe realizarse en un armario de seguridad biológica estéril para mantener la esterilidad. Todos los pasos deben llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.

1. Preparación de materiales para el procesamiento DE PDX

  1. Fórceps de autoclave y mango de bisturí o cuchillas de afeitar.
  2. Solución enzimática de disociación de descongelación a 4oC durante la noche o a temperatura ambiente el mismo día que la disociación de tejidos.
    NOTA: No se recomienda descongelar a 37 oC, ya que esto puede inactivar algunas enzimas de disociación.
  3. Preparar al menos 100 ml de medio de cultivo PDX (mezcla de nutriente medio Eagle modificada de Dulbecco F-12 [DMEM-F12] con penicilina de 100 U/ml y estreptomicina y 30% de suero bovino fetal [FBS]), y al menos 25 ml de medio de procesamiento PDX (DMEM-F12 con 100 U/ml de penicilina y estreptomicina y sin FBS). Conservar a 4oC hasta que esté listo para usar.

2. Disociación PDX y purificación inicial de componentes estromales

  1. Reunir utensilios autoclavedos, coladores celulares de 70 m (2 x 3), platos de cultivo de tejido redondo de 60 mm (2), placas de cultivo de tejido de 6 pocillos, tubos estériles de centrífuga cónica de 50 ml y solución salina estéril 1x tamponada fosfato (PBS). Cultivo cálido medio a 37 oC y permitir que la solución enzimática de disociación llegue a temperatura ambiente.
  2. Cuando el tejido PDX haya alcanzado un diámetro de 1,0 x 1,5 cm en un huésped del ratón, extraiga quirúrgicamente el tumor del ratón por medios estándar (por ejemplo, bajo anestesia aceptada) y guárdelo sobre hielo en un tubo de 50 ml con medio de cultivo PDX (Figura 2A). Procesar el tejido con prontitud, a través de los pasos a continuación, para maximizar la viabilidad celular, preferiblemente dentro de 1 a 2 h después de la cosecha.
  3. Transfiera el tejido tumoral a un tubo cónico estéril de 50 ml prepesado. Enjuague 6x con 30 ml de PBS estéril para eliminar sangre y contaminantes. Retire tanto líquido como sea posible y pese el tejido tumoral.
  4. Transfiera el tejido tumoral a un plato de cultivo de tejido redondo de 60 mm y mince en trozos de 1 mm3 utilizando una cuchilla de afeitar estéril o bisturí.
  5. Añadir 5 ml de medio de procesamiento PDX para recoger la suspensión tumoral y transferir a un nuevo tubo estéril de 50 ml. Enjuague el plato de cultivo con otros 5 ml de medio de procesamiento DE PDX, luego con solución enzimática de disociación (tumor de 10 ml/g, al menos 5 ml), añadiendo todos los enjuagues al tubo de 50 ml.
  6. Incubar 20 min a 37oC con un suave temblor. Gire suavemente el tubo a mitad del tiempo de incubación.
  7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente con una pipeta serológica para romper los grumos. Filtrar las células con un colador celular de 70 m colocado sobre un nuevo tubo estéril de 50 ml.
    NOTA: Puede ser necesario más de un colador.
  8. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a células de pellet. Retire el sobrenadante y el resuspend en 2 x 3 ml del medio de cultivo PDX. Cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador automático de células.
  9. Utilice la Tabla 1 para estimar el número requerido de células derivadas de PDX disociadas necesarias para lograr la densidad de celdas deseada por chip.
    NOTA: Los valores de la Tabla 1 están pensados para ser un punto de partida. Los valores reales variarán debido a la viabilidad/celularidad del tejido y a la pérdida celular por congelación/recuperación. Los tumores PDX son individuos incluso dentro de un tipo de cáncer determinado, por lo que estos valores deben ajustarse empíricamente.
  10. Del número calculado en el paso 2.9, placa 1-2 x 106 células en 5 ml de medio de cultivo PDX por pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos. Incubar (37oC, 5% CO2,95% de humedad) durante 48 h con agitación suave (50-55 rpm) para promover la formación del racimo(Figura 2B). Después de que se hayan formado el racimo, proceda a la sección 3 para la centrifugación.
  11. Cryopreserve células PDX no utilizadas de la disociación inicial en 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% sulfóxido de dimetil (DMSO) o un medio de congelación de células primarias disponible comercialmente.
    NOTA: Las células estromales de ratón adherentes también se pueden recuperar de la superficie de la placa de tejido, si se desea, enjuagando brevemente con medio de cultivo y expandiéndose por medios estándar.
  12. Para el uso posterior de células tumorales PDX crioconservadas/estroma de ratón, descongelar las células en un baño de agua de 37 oC durante 2 minutos. Recuento y placa en una placa de cultivo de tejido de 6 pozos como se describe en el paso 2.10 antes de proceder a la sección 3. Aumente el número de células PDX en un 20 % para acomodar las pérdidas de viabilidad por criopreservación.

3. Separación basada en la centrifugación de gradiente de densidad de racimos derivados de PDX de células individuales

  1. Preparar 20 ml de solución de gradiente de densidad 100% mezclando a fondo 18 ml de solución de centrifugación de gradiente de densidad con 2 ml de solución de sal equilibrada (HBSS) de 10x Hanks estéril en un tubo cónico estéril de 50 ml. Haga soluciones de gradiente de densidad de 10 ml cada una de 20%, 30%, 40% y 55% al diluir esta solución del 100% con HBSS estéril 1x y mezclar bien.
    NOTA: Estos volúmenes son suficientes para dos gradientes de 15 ml que se pueden utilizar para separar 15 x 106 celdas cada uno. Si se separan menos de 15 x 106 celdas, el segundo gradiente se debe utilizar como equilibrio para la centrifugación.
  2. Añadir 3 ml de solución de gradiente de densidad del 55% en la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml. Sosteniendo el tubo en un ángulo, muy suavemente capa 3 mL de 40% solución de gradiente de densidad en la parte superior de la capa del 55%, dispensando lentamente el líquido en el lado angular del tubo para evitar mezclar las capas. Repita con la solución de gradiente de densidad del 30%.
  3. Recoger el sobrenadante de cultivos de rotación PDX con una pipeta serológica de 5 ml, superficie de la placa de enjuague suavemente. Centrifugar a 200 x g durante 2 min a células de pellet.
  4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3 ml de 20% solución de gradiente de densidad de acuerdo con el número de gradientes necesarios para separar las células. Capa cuidadosamente 20% solución de gradiente de densidad con celdas en la parte superior de los degradados. Si solo utiliza un tubo de degradado para las células, encima del tubo de gradiente de equilibrio con una solución de gradiente de densidad del 20% libre de células.
  5. Tapar los tubos y centrífuga en una centrífuga de rotor de cucharón oscilante durante 30 minutos a 4 oC, 2.000 x gy 0 freno.
  6. Después de la centrifugación, las fracciones serán visibles(Figura 2C). Recoger 2 x 3 ml de fracciones en tubos frescos de 15 ml. Agregue 3 x 4 volúmenes de 1 hbSS estéril a cada fracción e invierta para mezclar a fondo.
  7. Centrifugar a 1.000 g durante 3 min a células de pellet. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en 1 x 2 ml del medio de procesamiento PDX.
    NOTA: Los clústeres de células PDX viables se encuentran típicamente en la interfaz de solución de gradiente de densidad de 40-55% (Figura 2D) con células muertas/moribundas únicas que se acumulan en la interfaz de solución de gradiente de densidad de 20 x 40% para la mayoría de los PDX probados.
  8. Retire una alícuota pequeña y representativa (50-100 l) para la re-disociación con un volumen igual de solución enzimática de disociación para evaluar el número de células en la suspensión celular agrupada. Recuento de células con un hemocitoómetro o un contador de células automatizado.

4. Preparación de hidrogeles y siembra de placas microfluídicas

  1. Reconstituir soluciones de hidrogel HA (HA modificado con tiol, HA-SH; diacrilato de polietilenglicol de tiol reactiva, PEGDA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Usando una pipeta multicanal, agregue 50 l de HBSS a todos los pocillos en columnas de ventanas de observación (columna 3, 7, 11, 15, 19, 23) de una placa microfluídica de 2 carriles para mantener la humedad del cultivo y las condiciones óptimas de imagen.
  3. Calcule el volumen de la suspensión celular a partir de la sección 3 necesaria para 50 ml de hidrogel con la densidad celular deseada (es decir, 5.000 células/L). Para sembrar una placa microfluídica, aliquot el volumen calculado en cada uno de 4 tubos estériles de centrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Los hidrogeles HA tienen un tiempo fijo para la gelización. Ajuste el volumen de las alícuotas de la solución de gel para la eficiencia del usuario en la dosificación si se produce una gelación prematura.
  4. Ajuste el pH de la solución HA-SH a 8.0 con 1 N NaOH inmediatamente antes de su uso. Realice una gelificación de prueba mezclando 40 s de HA-SH con 10 ml de PEGDA y controlando la gelización a lo largo del tiempo. La geleración normalmente comienza de 5 a 8 minutos después de mezclar HA-SH con el reticulante PEGDA.
  5. Alícuotas de suspensión de células centrífugas durante 2 min (200 x g,temperatura ambiente) a células de pellet. Retire cuidadosamente las células sobrenadantes y resuspendidas en el volumen adecuado de HA-SH.
    NOTA: El hidrogel final es una solución HA-SH:PEGDA de 4:1 (por volumen), por lo que las células deben ser resuspendidas en 40 oL de HA-SH para un volumen final de 50 l.
  6. Añadir 10 l de PEGDA a una alícuota de células en HA. Mezclar bien y esperar de 1 a 3 min (dependiendo del tiempo de gelización del paso 4.4) antes de sembrar la placa microfluídica.
    NOTA: Permitir la reacción de gelización del inicio antes de la siembra ayuda a minimizar la sedimentación celular.
  7. Fije una punta para dispensar volúmenes de 1,5 ml a una pipeta de repetición de un solo canal y cargue con células en la solución de hidrogel HA. Recuerde mantener la alícuota de hidrogel bien mezclada para asegurar una distribución uniforme de la célula.
  8. Para sembrar la placa microfluídica, alinee la punta de la pipeta perpendicular a la placa mientras coloca suavemente la punta en el centro de la entrada de gel (columnas 1, 5, 9, 13, 17, 21) para garantizar el contacto pero sin presión al dispensar la solución de hidrogel. Trabajando rápidamente para prevenir la solidificación prematura de hidrogeles, dispensar 1,5 l de solución de gel en cada entrada de gel.
  9. Observe el estado de llenado de los canales microfluídicos visualizando desde la parte superior de la placa, la parte inferior de la placa o por microscopio, y evalúe la carga, utilizando la Figura 3 como guía (carga exitosa en la Figura 3A, guía de posicionamiento de pipetas en la Figura 3B, carga perdida en la Figura 3C, no rellenada para terminar en la Figura 3D, desbordamiento en la Figura 3E). Identifique los ajustes necesarios en la técnica que puedan mejorar el éxito de llenado para la siguiente ronda de chips (consulte la discusión para obtener consejos de solución de problemas).
  10. Repita los pasos 4.6 a 4.9 con las 3 alícuotas restantes de las celdas en la solución HA. Invierta la placa mientras prepara la siguiente alícuota (1 min).
    NOTA: El tiempo de espera de 1 minuto y la inversión de la placa mejoran la distribución 3D de las células al reducir la sedimentación celular a medida que se produce la geleración.
  11. Una vez llenados todos los chips, incubar la placa a 37oC en una incubadora humidificada hasta que se complete la geleración (45 min).
  12. Utilizando el manual suministrado, asegúrese de que el balancín de perfusión esté instalado en la incubadora de cultivo celular con los ajustes de perfusión correctos (ángulo de 14o, intervalos de 4 min).
  13. Agregue 50 l de medio de cultivo PDX a todas las entradas medianas (columnas 2, 6, 10, 14, 18, 22) y compruebe si los canales se llenaron correctamente volteando la placa. Toque suavemente la placa contra una superficie para animar al líquido a llenar los canales microfluídicos.
  14. Añadir 50 l de DMEM-F12 (10% FBS) para todos los puntos de venta medios (columna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Si alguna burbuja de aire está atrapada en el canal de perfusión, retírela tocando suavemente la placa contra una superficie.
  15. Usando un microscopio y una forma de diseño de placa(Figura Suplementaria 1),registre el éxito del llenado de virutas. Excluya las virutas mal rellenadas del uso experimental adicional.
  16. Coloque la placa sobre un balancín basculante en una inclinación de 14o y un ciclo de 4 minutos para comenzar la perfusión. Reemplazar el medio de cultivo PDX cada 2 días (primero 50 ml en la entrada, luego 50 l en la salida).

5. Tinción celular, imágenes y cuantificación de imágenes

  1. Preparar una solución de ensayo de viabilidad celular que contenga tres colorantes fluorescentes (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
    1. Preparar las soluciones de stock de cada tinte de la siguiente manera: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/ml) en agua desionizada; calceína AM a 4 mM en DMSO anhidro; ethidium homodimer-1 a 2 mM en DMSO/H2O (1:4, v/v).
      NOTA: Las soluciones de calceína AM y ethidium homodimer-1 se proporcionan en el kit señalado en Tabla de materiales.
    2. Preparar una única solución de trabajo en HBSS o medio libre de fenol, que contenga los tres tintes. Optimice la concentración de trabajo final para cada tipo de célula y matriz, dentro de los rangos de 1,6 a 8,0 m para Hoechst 33342, 0,1 a 10 m para la calceína AM y de 0,1 a 10 m para el homodimermer de etitio-1.
  2. Retire el medio de cultivo y aplique la solución de tinte de viabilidad de trabajo a los chips microfluídicos deseados (75 ml en la entrada, 25 l en la salida) y vuelva a colocar en el balancín de perfusión en la incubadora de cultivo celular durante 1 h.
  3. Imagen de las ventanas de observación de los cultivos manchados utilizando un microscopio confocal manual o automatizado (Tabla de materiales) con filtros fluorescentes (listados como longitudes de onda de excitación/emisión, en nm) observar todos los núcleos (Hoechst 33342, 350/461), núcleos de células muertas (ethidium homodimer-1, 528/617) y citoplasma de células vivas (calcein AM, 494/517).
  4. Captura pilas Z de 140 m con un tamaño de paso de ≤1 m utilizando un objetivo de aire de 20x. Se necesitan tres campos de visión para poner en imagen todo el microcanal con una pequeña cantidad de superposición. Para evitar el doble muestreo, imagine solo dos campos de visión por chip.
    NOTA: Las condiciones de imagen deben optimizarse para garantizar un muestreo adecuado de NyQuist. En la experiencia de los autores, un sistema de imagen rápido, basado en la desconvolución de una fuente convencional de epifluorescencia o modo de escaneo de resonancia en un confocal, es necesario para ensayar completamente una pila Z completa, con tres colores láser, a través de 96 chips en una placa dentro de una cantidad razonable de tiempo (aproximadamente 3,5 h con imágenes automatizadas, incluida la configuración).
  5. Mediante el software de análisis de imágenes, anba las imágenes de la pila Z para los datos cuantificados deseados, como morfología, estado de agregación u otras características. Para cuantificar la viabilidad celular, cuente el número de células muertas (rojo) y los núcleos celulares totales (azul).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se preparó un balancín de perfusión programable en una incubadora de cultivo celular de agua estándar, y se prepararon placas microfluídicas de dos carriles en un gabinete de bioseguridad estándar para la carga (Figura 1). Un tumor MDA-PCA-118b PDX se amplió in vivo, se recolectó cuando había alcanzado un tamaño máximo, y se disociaba como se describe en la sección 2 del protocolo para crear una suspensión de lodos de las células, en aproximadamente un estado de una sola célula (Figura 2A). La suspensión se dispensaba en placas de cultivo de tejido de 6 pozos, y se colocaba en un rotador XY como se describe, durante 48 h. Estroma de ratón unido a la parte inferior de la placa de cultivo de tejido, como se ha descrito anteriormente, y las células PDX humanas permanecieron flotando en el medio, ensamblados en racimos (Figura 2B). Las células individuales sin montar también eran visibles en toda la solución.

Se estableció un gradiente de densidad escalonada en un tubo centrífugo utilizando los métodos de la sección 3 del protocolo. La suspensión sobrenadante de las células PDX se aspiraba suavemente desde la placa multipocillos, se cargaba en el gradiente de paso y se centrifugaba como se describe. Después de la centrifugación, una banda brumosa, que contenía los racimos PDX, era visible cerca de la interfaz entre las fracciones 2 y 3, y se identificaron células individuales en la interfaz entre las fracciones 1 y 2 (Figura 2D). Las fracciones se recogieron como se describe, se diluyeron aún más en HBSS y se centrifugaron de nuevo para eliminar la solución de gradiente de densidad. El sobrenadante fue aspirado, y los pellets celulares resultantes fueron resuspended en el medio de procesamiento PDX. Una pequeña alícuota de cada fracción procesada fue evaluada por microscopio, para confirmar que la fracción esperada contenía racimo PDX, y que la fracción separada contenía principalmente células individuales.

Las soluciones de hidrogel HA se reconstituyeron como se describe en la sección 4 del protocolo, y los racimos de PDX se resuspendieron en la solución de hidrogel. Las soluciones PDX se cargaron en chips en la placa microfluídica y se evaluaron para una carga exitosa (Figura 3). En la mayoría de los casos, >90% de los chips se cargaron con éxito después de alguna práctica con la técnica y el ajuste de los volúmenes de carga. Después de cargar el número deseado de virutas, y la incubación para gelización como se describe, se añadió un medio de cultivo PDX a la placa microfluídica, y la placa se culta con perfusión.

Utilizando colorantes fluorescentes y los métodos de la sección 5 del protocolo y la microscopía confocal, se evaluó la viabilidad y morfología del cultivo PDX microfluídico 3D tanto en condiciones separadas por centrifugación sin separación como en la centrifugación de gradiente de densidad(Figura 4A). Las imágenes de estas placas se registraron como pilas Z en el microscopio confocal y se evaluaron para la viabilidad celular en el software de análisis de imágenes. En el día 1, aquellos cultivos que se sometieron al método de separación exhibieron 10 veces menos células muertas individuales (rojos), en comparación con los cultivos no clasificados (Figura 4B). Es importante destacar que los clústeres separados consistían principalmente en celdas vivas (verdes). No se identificó ninguna diferencia estadísticamente significativa para la distribución del tamaño del clúster(Figura 4C).

Los cultivos se mantuvieron aún más en la placa microfluídica durante siete días(Figura 5A). Las muestras se evaluaron periódicamente, utilizando los mismos métodos de diagnóstico por imágenes y cuantificación que los anteriores. El número total de celdas vivas se mantuvo coherente (Figura 5B) y los clústeres retuvieron una viabilidad del 80 %(Figura 5C)durante la vida del cultivo. La densidad celular en la condición no separada es aproximadamente un tercio de la condición separada porque las células individuales están vivas durante el conteo celular, pero mueren rápidamente dentro del hidrogel. También hay más variabilidad en el tamaño del clúster sin la separación del gradiente de densidad.

Figure 1
Figura 1: La placa microfluídica perfumada de 2 carriles. (A) La placa microfluídica de 2 carriles es una placa microtíter estándar de 384 pozos con un fondo modificado que consta de canales microfluídicos incrustados entre placas de vidrio. Cada placa consta de 96 chips de tejido para el cultivo celular 3D. (B) Como se ve desde la parte superior de la placa, un solo chip microfluídico de 2 carriles se compone de 4 pozos en una fila conectados por el canal de gel (rojo) y el canal de perfusión (azul); la entrada de gel, la entrada de perfusión, la ventana de observación y la salida de perfusión. (C) La perfusión se logra en la placa microfluídica con un balancín programable que utiliza la gravedad para conducir medios entre los pozos de entrada y salida de perfusión que son depósitos de medios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Aislamiento del clúster PDX. (A) Disecciona el tejido PDX primario y disocia en una sola suspensión celular que contenga tanto células PCa humanas como estroma tumoral de ratón. Ya sea criopreservar mezcla celular disociada o (B) añadir al cultivo de rotación para recluster las células tumorales y permitir que las células estromales del ratón se adhieran a la placa de cultivo de tejido (48 h). (C) Utilice la centrifugación de gradiente de densidad para eliminar celdas individuales muertas residuales y (D) recopile clústeres PDX viables en la interfaz entre las capas de degradado de densidad 40% y 55% (caja discontinua roja). (E) Recuperar racimos de PDX, resuspend en solución precursora de hidrogel, y dispensar en la placa con una pipeta repetitiva. (F) Los cálculos de ejemplo, correspondientes a la Tabla 1, demuestran los números de celda iniciales necesarios necesarios para alcanzar una concentración celular final deseada para todas las virutas a través de una placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Monitoreo de la carga de placas microfluídicas. Cargando el éxito y los errores, se puede evaluar a simple vista (en vistas superior e inferior), con confirmación por microscopio. (A) La carga correcta se identifica mediante un carril de perfusión abierto (brillante) en las vistas superior e inferior, y un carril de gel ligeramente más oscuro en la vista inferior. La visualización por microscopio confirma que el carril de gel se llenó completamente con células y precursor de gel, sin derramarse en el carril adyacente. (B) Dibujos animados que demuestran la correcta colocación de la punta de la tubería durante la dosificación del gel, con la colocación correcta justo encima del puerto de entrada (izquierda) y la colocación incorrecta fuera de centro (medio) o aplicando fuerza al puerto de entrada (derecha). (C) Los carriles brillantes en todas las vistas indican una carga perdida, lo que sugiere que la punta de la tubería no se colocó correctamente dentro de la entrada de gel. (D) Un relleno parcial del carril de gel (no lleno hasta el final) se identifica por la flecha roja, que muestra dónde se interrumpió el frente de la solución de gel que avanzaba, ya sea por una burbuja de aire atrapada, o una pausa prematura en la carga. La flecha roja de la vista del microscopio identifica la misma ubicación. (E) El contenido del carril de gel desbordó la PhaseGuide, derramándose en el carril de perfusión y, en última instancia, bloqueándolo. Este desbordamiento es visible en la vista inferior por la apariencia oscura de los carriles de gel y perfusión. Barra de escala de 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tinción celular y evaluación de la viabilidad en la placa microfluídica. (A) Utilizando manchas fluorescentes, la viabilidad se evaluó en racimos celulares PCa separados y no separados sembrados en la placa microfluídica (todos los núcleos: Hoechst 33342, azul; células muertas: ethidium homodimer-1, rojo; y células vivas: calceína AM, verde). Barra de escala de 50 m. (B) Las células muertas totales se cuantificaron en el día 1 del cultivo y los cultivos DE PDX MDA-PCa-118b separados demostraron una disminución significativa en el número de células muertas. (C) La cuantificación del tamaño del clúster para las PX, en cultivos separados y no separados, mostró un ligero aumento, pero ninguna diferencia estadísticamente significativa. Las barras y barras de error en el panel B representan la media y la desviación estándar de 4 imágenes por condición (2 chips con 2 imágenes/chip). El asterisco (*) representa diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05) en comparación con la condición no separadoda usando la prueba t de un estudiante. Para la gráfica de caja y bigote en el panel C, el icono de cruz indica la media, y la línea horizontal representa la mediana, de 4 imágenes por condición (2 chips con 2 imágenes/chip). La caja contiene el 50% de los datos, mientras que los bigotes se extienden al diámetro mínimo y máximo del clúster para cada condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Caracterización de MDA-PCa-118b separado en la placa microfluídica. (A) Los cúmulos de células cancerosas de PCa separados (izquierda) y no separados (derecha) se siembran en la placa microfluídica y se perfundieron durante un máximo de siete días. Los cultivos se teñiron con tres tintes específicos para todos los núcleos (Hoechst 33342, azul), células muertas (ethidium homodimer-1, rojo) y células vivas (calceína AM, verde). Barra de escala a 50 m. (B,C) La cantidad del número de celdas y la viabilidad del cultivo de las imágenes a lo largo de una semana de cultivo a una densidad de siembra de 8.000 celdas/L. Las barras y barras de error representan la media y la desviación estándar de cuatro imágenes por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Densidad de celda final deseada en un solo chip (células/L) Volumen cargado por chip (L) Número de chips en placa microfluídica Mutiplier para un volumen extra Figura 2C: Número de celdas separadas necesarias para una placa de micropocillos completa (paso 3.8) Multiplicador para
pérdidas celulares (extirpación de estroma, muerte celular)		 Figura 2B: Inicio de las células PDX disociadas para el protocolo (paso 2.8)
2,500 1.5 96 1.3 4.7E+05 3 1.4E+06
5,000 1.5 96 1.3 9.4E+05 3 2.8E+06
10,000 1.5 96 1.3 1.9E+06 3 5.7E+06
20,000 1.5 96 1.3 3.7E+06 3 1.1E+07

Tabla 1: Se requiere material PDX inicial y final aproximado para cargar una sola placa microfluídica de 2 carriles.

Supplemental Figure 1
Figura suplementaria 1: El diseño de placa microfluídica de 2 carriles. Después de sembrar la placa microfluídica, registre el éxito de carga individual de la viruta (éxito, carga perdida, no llenado hasta el final o desbordamiento) utilizando el diseño de la placa de 2 carriles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí describimos un método para procesar y cultivar células tumorales derivadas de PDX viables en un sistema de cultivo 3D perfundido y de alto rendimiento. Mientras que este protocolo utiliza tejido PCa PDX, es igualmente eficaz para otros tumores de origen epitelial. Las características tumorales varían entre las líneas PDX individuales incluso dentro del mismo tejido de origen (próstata, mama, etc.). Algunas líneas PCa PDX son más fibrosas y difíciles de aislar las células viables, mientras que otras son más celulares. El tamaño del tumor que se observa aquí puede variar dentro de las directrices de la CIAIC para proporcionar más tejido para tumores particularmente de bajo rendimiento. Además, los fragmentos de tumor se pueden recoger después del paso 2.7, volver a digerirse y agruparse con la digestión inicial para aumentar el rendimiento. Esto es especialmente útil para tumores más extracelulares con matriz pesada. Las rondas adicionales de digestión más allá de dos típicamente resultan en baja viabilidad y bajo rendimiento y no se recomiendan.

La purificación de las poblaciones derivadas de PDX, para eliminar células muertas/moribundas o células huésped contaminantes, es beneficiosa para el cultivo 3D extendido y la cuantificación de las células cancerosas deseadas. El primer paso de la purificación descrito aquí —cultivo de suspensión en un volumen relativamente grande de medios junto con rotación XY a velocidades moderadas— promueve 1) la extracción selectiva de células altamente dependientes de la adhesión, fibroblastos estromales típicamente ratón, y 2) la formación de agregados celulares para proporcionar contacto celular-célula pro-supervivencia. La eficiencia de la extracción de fibroblastos de ratón derivados del host durante el paso de rotación XY de 48 h es muy alta, como se describe en Fong et al.5. Los co-cultivos intencionales de PCa-fibroblast son ciertamente factibles, como hemos demostrado, pero requieren una matriz sintonizada (para apoyar la adhesión de fibroblastos a la matriz) y una mayor proporción de fibroblastos. El PDX ocasional, generalmente aquellos con características más mesenquimales, se adhiere más fácilmente a las superficies de cultivo de tejidos durante el paso de cultivo de rotación de 48 horas. Las líneas PDX deben ser monitoreadas de cerca la primera vez que se realiza este protocolo, e inmunosuficionadas para el HNA, para identificar la proporción de células humanas en las poblaciones adherentes y no adherentes. Las placas tratadas de cultivo no tisular se deben utilizar para la formación de racimos con estos PDX. Las células estromales del ratón todavía se adhieren eventualmente a la superficie, pero la separación no será tan eficiente.

Después del cultivo de rotación, el sobrenadante que contiene la población no adherente se procesa a través del método de centrifugación de gradiente de densidad descrito. El protocolo notificado aquí se puede simplificar para excluir al menos un paso de densidad (por ejemplo, utilizando sólo las soluciones 20%, 40% y 55%), pero los cuatro deben utilizarse al establecer este método con cada nuevo PDX. Los cúmulos multicelulares se separan fácilmente de las células individuales mediante este método y conservan en gran medida su fenotipo agrupado y otras características. La población de una sola célula descartada representa (a) células que estaban muertas/moribundas antes del paso de rotación de 48 h, y por lo tanto nunca se integraron en un clúster, o (b) células que permanecieron vivas después de la rotación de 48 h, pero que todavía no se integraron en clústeres. Es importante tener en cuenta que el grupo (b) puede incluir células que algunos investigadores encuentran deseables; por ejemplo, algunos informes han descrito cultivos celulares primarios que contienen células madre/progenitoras tempranas, o células farmacorresistentes, que flotan dentro de los sobrenadantes como células únicas mal adheridas por encima de una población de otro modo adherente10. Relevantes para estudios de cáncer, células tumorales circulantes (CTC), células que inician tumores (TC) u otros tipos similares de células que promueven la metástasis podrían formar parte de esta población de células únicas. Por lo tanto, los investigadores que utilizan nuestro protocolo deben analizar cuidadosamente la población de una sola célula descartada para asegurarse de que no se han perdido células de interés. En nuestras manos, la gran mayoría de estas células individuales son una pequeña fracción de las células cancerosas que están muertas/moribundas debido al protocolo inicial de disociación tisular, o fibroblastos de roedores que ya están procediendo a través de anoikis.

Se recomienda encarecidamente practicar la técnica de siembra de la placa microfluídica con células menos preciosas para asegurar el éxito cuando se trabaja con material PDX limitado y valioso. Tenga en cuenta la colocación de la punta durante la dosificación, ya que es probable que la técnica incorrecta dé lugar a 1) un desbordamiento si se aplica presión durante la carga, o 2) canales vacíos o parcialmente llenos si la punta no está centrada sobre el puerto de entrada. La geleración prematura también hará que los canales no se llenen hasta el final. Si esto ocurre, disminuya el tiempo de espera entre la adición del reticulante PEGDA y la dosificación de la solución de gel, o trabaje con alícuotas más pequeñas de solución de gel a la vez. Los volúmenes de dosificación utilizados en este protocolo están bien optimizados para el éxito con los hidrogeles HA. El uso de soluciones más viscosas como Matrigel en este sistema requiere un aumento en el volumen de dosificación a 2 oL para el llenado adecuado de los canales microfluídicos. Tenga en cuenta también que la elección de incrementos de 50 l en el paso 4.3, la preparación de cuatro pellets celulares en este mismo paso, y las resuspensiones repetidas en el paso 4.10 son deliberadas; aunque producen más material del necesario, también proporcionan un exceso para tener en cuenta las pérdidas de la pipeta repetitiva.

Cabe señalar que es probable que cada PDX tenga una morfología única y distribución de tamaño dentro de este modelo de referencia cultural 3D. En un sentido, esto se espera, debido a la diversidad de la enfermedad del paciente, la historia del tejido, los parámetros de la matriz y muchos otros factores. Una evaluación expansiva de múltiples líneas de cáncer de próstata en Matrigel demostró esta diversidad potencial11. Aún así, los investigadores pueden sorprenderse al encontrar una amplia variación en los parámetros anteriores. En un manuscrito en preparación, presentamos una mirada amplia a varios PDX en esta plataforma de cultivo; las células mantienen una respuesta consistente dentro de cada tipo PDX, pero pueden variar sustancialmente entre especímenes, lo que resulta en clusters que son, por ejemplo, grandes con alta densidad celular por grupo, o más pequeños, con conexiones intercelulares más sueltas. El comportamiento específico de cada PDX debe ser evaluado por los investigadores a través de múltiples ensayos, para confirmar una morfología predecible y característica. Los investigadores pueden esperar que los especímenes sigan los comportamientos generales descritos en este documento.

En resumen, el protocolo presentado ofrece a los investigadores un nuevo método para emplear PDX ex vivo en una plataforma que permite la afinación de las condiciones de cultivo y la incorporación de señales ambientales 3D relevantes como la matriz extracelular específica de tejido (ECM) y el flujo de perfusión, lo que permite una supervivencia celular prolongada durante varios días o semanas. La caracterización detallada de estos cultivos se logró mediante la tinción y los análisis morfológicos que se han demostrado aquí. Además, si es necesario, los cultivos se pueden someter a ensayos basados en lectores de placas, etiquetado inmunofluorescente o utilizarse para la preparación de licastos que permitan una mayor caracterización molecular. Aunque hemos publicado anteriormente algunos elementos del cultivo PDX 3D dentro de los hidrogeles, esta aplicación de purificación multipaso es nueva, fácil de emplear en un laboratorio estándar, y tiene éxito en la retención de cultivos representativos de alta viabilidad. La plataforma OrganoPlate, en sus variedades de 2 y 3 carriles, ofrece mayor complejidad a través de su modelo de perfusión tisular, y una oportunidad clave para utilizar aún menos células por experimento. En comparación con nuestros modelos anteriores, la plataforma microfluídica redujo los requisitos celulares en un factor de 30 euros, por experimento, lo que es un enorme beneficio, dada la escasa disponibilidad de tejido tumoral PDX en la mayoría de los laboratorios. El sistema microfluídico permite obtener imágenes, inmunosuferencia e imágenes fáciles, a través de una población celular lo suficientemente grande (n s 2.000 a 4.000 células por ventana de imágenes) para permitir la cuantificación del fenotipo en el contexto de la organización espacial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional del Cáncer SBIR Fase I (HHSN26120700015C) y P01CA098912.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1N NaOH any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes any suitable
6-well tissue culture plates any suitable
70 µm cell strainers Corning 431751 or equivalent
Centrifuge Eppendorf 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes or equivalent
Density gradient centrifugation solution Millipore Sigma P1644 Percoll
Dimethylsulfoxide any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution StemCell Technologies 07921 ACCUMAX
DMEM-F12 ThermoFisher Scientific 11039021 or equivalent
Forceps any suitable
HA hydrogel kit ESI BIO GS311 HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution Lonza 10-527F or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-51B Hausser BrightLine or equivalent
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H1398 or equivalent
Image processing software Oxford Instruments Imaris 9.3 or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) ThermoFisher Scientific L3224 or equivalent
Microfluidic culture plate Mimetas 9603-400-B 2-lane OrganoPlate
Microscope Nikon A1R or equivalent
Multichannel pipette Eppendorf 3125000036 or equivalent
PDX-derived tumor tissue obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 or equivalent
Perfusion rocker Mimetas OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9) any suitable
Phosphate-buffered saline solution Lonza 17-516F or equivalent
Razor blades any suitable
Rotating xy-shaker VWR Advanced 3500 Orbital Shaker or equivalent
Scalpel handle any suitable
Single channel repeating pipette Eppendorf 22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes any suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
  2. Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
  3. Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
  4. Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
  5. Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
  6. Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
  7. Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
  8. Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
  9. Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
  10. Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).

Tags

Cancer Research Número 166 cultivo 3D hidrogeles microfluídicos xenoinjertos derivados del paciente cáncer de próstata modelos de cáncer in vitro cribado de fármacos de alto rendimiento perfusión
Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sablatura, L. K., Bircsak, K. M.,… More

Sablatura, L. K., Bircsak, K. M., Shepherd, P., Queiroz, K., Farach-Carson, M. C., Constantinou, P. E., Saleh, A., Navone, N., Harrington, D. A. Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (166), e60872, doi:10.3791/60872 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter