Summary
本プロトコルは、患者由来異種移植片(PDX)の拡張in vitro培養を可能にする方法を示す。1つのステップは、非生存可能な単一細胞を簡単に除去することで、3Dヒドロゲルにおける多細胞クラスター培養の全体的な生存率を高めます。二次ステップは、パーフューズされたマイクロ流体プラットフォームにおけるPDX培養のベストプラクティスを示します。
Abstract
切除された患者の腫瘍組織が免疫不全マウスに直接生じたときに生成される患者由来の異種移植片(PDX)は、生物学的に安定なままであり、それによって、分子、遺伝的、および組織学的特徴、ならびに元の腫瘍の不均一性を維持する。しかし、これらのモデルを使用して薬物スクリーニングを含む多数の実験を行うことは、コストと時間の両方の面で非常に高い。3次元(3D)培養システムは、がん細胞が生化学的相互作用、形態、建築を通じて生物学的完全性を保持するプラットフォームとして広く見られている。当社のチームは、ヒアルロン酸(HA)で構成された3Dマトリックスを用いて、インビトロでPDX細胞を培養した豊富な経験を持っています。PDXに関連するマウス線維芽細胞間質細胞を分離するために、我々は回転細胞が組織培養処理プレートの表面に付着し、PDX腫瘍細胞を浮遊させ、多細胞クラスターに自己関連付ける回転培養を使用する。また、上清に浮遊する単一の死細胞は、3D細胞培養のためのヒドロゲルへの下流カプセル化のための実行可能なPDXクラスターを収集する際に課題を提示する。これらの単一細胞を生細胞クラスターから分離するために、我々は密度ステップ勾配遠心分離を採用した。ここで説明するプロトコルは、さらなるインビトロ実験に使用される細胞クラスターの健全な集団からの非生存可能な単一細胞の枯渇を可能にする。我々の研究では、培養中の培地灌流を可能にするマイクロ流体プレートに3D培養を組み込む。精製細胞と非精製細胞の蛍光画像ベースの生存アッセイを用いて得られた培養物を評価した結果、この追加分離ステップが、我々の培養物からの非生存細胞の数を大幅に減少させたことを示した。
Introduction
過去10年間、がん研究の分野は、がん細胞経路の依存性および薬物感受性を評価するためのツールとして、患者由来の異種移植片(PDXs)に対する新たな熱意を示してきた。最も一般的なPDXモデルは、ヒト腫瘍細胞の皮下または異形移植(腫瘍断片、解離された腫瘍由来細胞のクラスター、または単離循環腫瘍細胞(CTC)のサンプル)によってげっ歯類宿主に確立される。腫瘍の「テイク」が成功した場合、異種移植細胞は増殖し、血管化し、そうでなければ宿主組織と相互作用して腫瘍を作り出し、最適なサイズで収穫し、細分化し、他の宿主に再移植することができる。モデルシステムとしてのそれらの多くの利点の中で、PDXsは典型的には、天然腫瘍細胞集団の不均一性のかなりの部分を保持し、ヒト特異的経路および細胞応答の評価を可能にする22、3。3in vivoコンテキストは、血管系および他の隣接する間質との腫瘍相互作用を可能にし、薬物拡散ダイナミクス、酸素張力、および生物学的および機械的に腫瘍の進行に影響を与える細胞外マトリックスの影響などの組織特性を再現する。PDXの否定的な側面は、腫瘍の拡大と最終的には仮説検査の両方に対するげっ歯類宿主への依存である。多くのPDXは、望ましい特性の多くを失うことなく、組織培養ポリスチレンの伝統的な2次元(2D)培養に適応できないため、この比較的制御されたインビトロ法と、生体内PDX使用の費用、施設、および時間要件の大幅な増加の間に研究者のための最小限の中間地点がありました。
我々は、支持的なマトリックス内で3D細胞培養を実施する複数のインビトロモデルを説明し、最近、骨髄由来線維芽細胞44,55と共培養する単独で、また骨髄由来のPDXと共培養して、複数の前立腺癌(PCa)由来PDXのエクスビボ培養を実証する作業を拡大した。ヒアルロン酸(HA)ベースのヒドロゲルマトリックスは、ヒドロゲル深度6を介したイメージングのためのヒドロゲル特性および光学的明瞭性を簡単に制御して、両方の細胞タイプにカスタマイズ可能かつ生物学的に関連するサポートを提供する。
成熟したPDX腫瘍組織は、異種ヒト癌細胞とマウス間質(線維芽細胞、内皮細胞など)の可変混合物を含む。インビトロで腫瘍進行に対する細胞型特異的な寄与を研究するために、腫瘍を解離し、細胞集団を分離し、それらを組織的に組み込んで細胞間コミュニケーションの経路を解剖することが有利である。組織のデジエステート内の混合細胞集団は、特定の培養条件との相性が異なる。例えば、腫瘍関連線維芽細胞の生存率は、インテグリンリガンドで機能する表面付着または3Dマトリックスのいずれかを必要とし、上皮由来PDX細胞は通常これらの要件を有せず、代わりに細胞細胞相互作用を好む。これらの違いは、PDX細胞を汚染するマウス間質細胞からの効果的な分離を達成するために利用することができる。組織デジエステートの回転培養により、細胞細胞の接着が組織培養表面に付着し、細胞-細胞接着は回転培養表面の上に浮遊するPDX細胞を駆動し、上清中に24〜48時間で多細胞クラスターを形成する。これらのクラスターの特定の特性は、PDX(例えば、大きく、タイトで、球状の高いクラスターまたはブドウの束に似たより緩い凝集体)によって異なりますが、通常は生物学的に関連するサイズ(50-250 μm直径)であり、細胞間接触に依存する細胞相互作用を評価するのに十分です。
腫瘍の検索と処理は、機械的/酵素的破壊による短期的な損傷、または選択された培養条件との亜集団の長期的な不適合性のいずれかによる、ある程度の担保細胞死をもたらす。初期のバルク分離としての回転培養の有用性にもかかわらず、死細胞または死死細胞は必然的にPDXクラスターと共に移され、結果として生じる培養に影響を与える可能性がある。これらの死細胞は、クラスターに統合されなかった個々のPDX細胞、選択した培養条件で生き残ることができないマウス間質線維芽細胞、または特に脆弱な内皮細胞である。このような死細胞は、「生存者」からの実験結果に影響を及ぼし、例えば蛍光画像ベースの生存率スクリーニングアッセイを介して定量に実質的に影響を与える可能性がある。この方法から生きたPDX細胞の選択を改善するために、我々は容易にPDX混合物から個々の死滅/死細胞を除去し、主に生きている多細胞クラスターを保持するために密度ステップを有する遠心分離法を適応した。
3D培養における結果として得られるPDX由来クラスターの研究を強化するために、我々はマイクロ流体ベースの灌流培養プラットフォームであるOrganoPlate(図1)を利用し、384マイクロウェルチタープレートベース上で最大96個のパーフュード3D培養を同時培養できる高スループットのオルガン・オン・チップ・プラットフォームである(図1A)77.82レーンマイクロ流体プレートでは、1つの組織チップが2つのマイクロ流体チャネル(図1B、ゲルチャネル:赤、灌流チャネル:青)によって接続され、4つのウェルが連続して広がります。2つのマイクロ流体チャネルは、隣接する隣接チャネルへの1つのチャネルのオーバーフローを防止するフェーズガイドと呼ばれる短いプラスチック製の尾根によって分離され、同時にゲルの内容物と灌流チャネル9との間の膜のない界面を可能にする。マイクロ流体プレートの底部は顕微鏡グレードのガラスで構成されているため、標準的な顕微鏡または自動顕微鏡でプレートの底を通して観察窓で培養を見ることができます。灌流は、マイクロ流体チャネルを介して媒体を駆動するために重力を使用して、貯蔵井戸の間に、プログラム可能なロッカーとマイクロ流体プレートに確立される(図1C)。灌流フロー模倣は、静的培養よりも腫瘍微小環境をより密接に再現し、せん断応力の取り込みとガスおよび栄養素の分布の強化を可能にする。マイクロ流体プレートにおけるパーフューズド癌細胞培養を維持する利点は、同じ細胞の静的3D培養と比較して最適な生存率を示したパーフューズド乳癌培養物として以前に記載されている7。
本報告書は、生きた多細胞PDXクラスターを単離するための適応密度勾配遠心分離法を説明し、透過性マイクロ流体プレート内で3D PDX培養を確立する際にその有用性を示す。PDXの使用を容易にする方法を求めている研究所が増えているため、ここで紹介するプロトコルは即時に役立つと予想しています。
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Protocol
腫瘍組織は患者の同意を得て、承認された機関審査委員会(IRB)プロトコルに従って得られた。異種移植片は、受け入れられた制度的動物管理使用委員会(IACUC)プロトコルに従って移植、成長、収穫された。
注:すべての作業は、無菌性を維持するために無菌生物学的安全キャビネットで行われることです。特に指定がない限り、すべてのステップは室温で行う必要があります。
1. PDX処理用材料の製造
- オートクレーブ鉗子とメスのハンドルまたはカミソリの刃。
- 組織解離と同日、一晩または室温で解離酵素液を溶解する。
注:37°Cでの解凍は、いくつかの解離酵素を不活性化することができるので、お勧めしません。 - PDX培養培地(ダルベックの修飾イーグル培地栄養混合物F-12[DMEM-F12]を100 U/mLペニシリンおよびストレプトマイシンで少なくとも100 mL用意 30%のウシ血清[FBS])、およびPDX処理媒体の少なくとも25 mL(100 U/mLペニシリンおよびストレプトマイシンおよびFBSなしのDMEM-F12)。4°Cで使用できる状態になるまで保管してください。
2. PDX解離と間質成分の初期精製
- オートクレーブ調理器具、70 μm細胞ストレーナー(2-3)、60mm丸組織培養皿(2)、6ウェル組織培養プレート、無菌50 mL円錐形遠心分離管、無菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を収集します。温温培養培地を37°Cにし、解離酵素液を室温に戻す。
- PDX組織がマウス宿主で直径1.0−1.5cmに達した場合、標準的手段(例えば、受け入れられた麻酔下)によってマウスから腫瘍を外科的に取り除き、PDX培養培地を用いた50mLチューブに氷上で保存する(図2A)。下のステップを経て、収穫後1〜2時間以内の細胞生存率を最大化するために、組織を速やかに処理する。
- 腫瘍組織を予め秤量した無菌50 mL円錐管に移す。血液および汚染物質を除去するために30 mLの無菌PBSで6xをすすいでください。できるだけ多くの液体を取り出し、腫瘍組織を秤量する。
- 滅菌カミソリの刃またはメスを使用して、腫瘍組織を60mmの3丸い組織培養皿に移し、ミンチを〜1mm3個に移す。
- PDX処理媒体の5 mLを加えて腫瘍スラリーを採取し、新しい滅菌50 mLチューブに移します。培養皿をPDX処理培地の別の5 mLでリンスし、次に解離酵素溶液(10 mL/g腫瘍、少なくとも5 mL)で、50 mLチューブにすべてのリンスを加える。
- 穏やかな揺れで37°Cで20分インキュベート。インキュベーション時間の途中でチューブをそっと旋回します。
- ピペットは、塊を分割するために血清学的ピペットで穏やかに上下にピペット。70 μmの細胞ストレーナーを新しい滅菌50 mLチューブの上に置いたフィルターセル。
注: 複数のストレーナーが必要な場合があります。 - 200 x g でペレット細胞に 5 分間遠心分離します。PDX培地の2-3 mLで上清を除去し、再中断します。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。
- 表1を使用して、チップ当たりの所望の細胞密度を達成するために必要な解約PDX由来細胞の数を推定する。
注: 表 1 の値は、開始点として使用されます。実際の値は、凍結/回復による組織の生存率/細胞性および細胞損失によって異なります。PDX腫瘍は、特定の癌タイプ内であっても個体であるため、これらの値は経験的に調整されるべきである。 - ステップ2.9で計算した数のうち、プレート1−2×106細胞を6ウェル組織培養板のウェル当たりPDX培養培地5mLで1−2×106細胞とする。クラスター形成を促進するために穏やかな揺れ(50-55 rpm)で48時間インキュベート(37°C、5%CO2、95%湿度)をインキュベートする(図2B)。2クラスターが形成されたら、遠心分離のためにセクション 3 に進みます。
- 未使用PDX細胞を50%FBS+40%DMEM-F12+10%ジメチルスルホキシド(DMSO)または市販の一次細胞凍結培地で初期解離から凍結保存する。
注:接着マウス間質細胞はまた、必要に応じて、培養培地で短時間すすいで標準的な手段によって膨張することによって、組織板表面から回収することができる。 - 後で凍結保存PDX腫瘍細胞/マウス間質を使用するため、37°Cの水浴中の細胞を解凍して2分間行う。セクション3に進む前にステップ2.10に記載されているように、6ウェル組織培養プレート内のプレートとをカウントする。凍結保存による生存率の損失に対応するため、PDX細胞の数を約20%増やします。
PDX由来クラスターを単一細胞から濃度勾配遠心分離に基づく
- 18 mLの密度勾配遠心分離液と2 mLの無菌10xハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を無菌50 mLの円錐管に十分に混合して、20 mLの100%濃度勾配溶液を調製します。滅菌1x HBSSでこの100%溶液を希釈し、よく混合することにより、20%、30%、40%、および55%の密度勾配溶液をそれぞれ10 mLにします。
注:これらのボリュームは、〜15 x 106 セルをそれぞれ分離するために使用できる2つの15 mL勾配に十分です。分離するセルが 15 x 106 未満の場合、第 2 のグラデーションは遠心分離のバランスとして使用する必要があります。 - 15 mL円錐管の底部に55%の密度勾配の溶液の3 mLを加える。チューブを斜めに保持し、55%層の上に40%密度勾配溶液の3mLを非常に穏やかに層し、層を混合することを避けるために、チューブの斜め側にゆっくりと液体を分配する。30% の密度勾配解法を繰り返します。
- PDX回転培養物の上清を5mLの血清ピペットで回収し、プレート表面を優しくすすります。200 x g でペレット細胞に 2 分間の遠心分離機。
- 上清を除去し、細胞を分離するために必要な勾配の数に応じて20%の密度勾配溶液の3 mLで細胞ペレットを再懸濁します。20% の密度勾配溶液を慎重にレイヤー化し、セルをグラデーションの上部に置きます。セルに 1 つの勾配チューブのみを使用する場合は、セルフリー 20% 密度勾配ソリューションでバランス 勾配チューブを上に配置します。
- 4°C、2,000 x g、および0ブレーキで30分間、スイングバケットローター遠心分離機にチューブと遠心分離機をキャップします。
- 遠心分離後、分数が表示されます (図 2C)。2~3 mLの分数を新鮮な15 mLチューブに集めろ。各分数に3〜4ボリュームの無菌1x HBSSを追加し、完全に混ぜ合わせるために反転します。
- 遠心分離機を1,000xgで3分間ペレット細胞に対して行う。 gPDX処理媒体の1-2 mLで上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁します。
注: 実行可能な PDX 細胞クラスターは、通常、40-55% 密度勾配ソリューション インターフェイス (図 2D)にあり、テスト対象の PDX のほとんどの場合、20-40% 密度勾配ソリューション インターフェイスに単一の死死細胞/死細胞が蓄積されています。 - クラスター化された細胞懸濁液中の細胞数を評価するために、同量の解離酵素溶液と再解離するための小さな代表的なアリコート(50-100 μL)を取り除きます。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを持つセルをカウントします。
4. ヒドロゲル調製およびマイクロ流体プレートの播種
- HA ヒドロゲル溶液(チオール修飾HA、HA-SH;チオール反応性ポリエチレングリコールジアクリレート、PEGDA)をメーカーの指示に従って再構成します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、2車線のマイクロ流体プレートの観測窓列(列3、7、11、15、19、23)のすべてのウェルに50μLのHBSSを加え、培養湿度と最適なイメージング条件を維持します。
- 所望の細胞密度(すなわち、5,000細胞/μL)でヒドロゲルの50 μLに必要なセクション3からの細胞懸濁液の容積を計算する。1つのマイクロ流体プレートを播種する場合、計算された体積を4つの無菌1.5 mL遠心分離管のそれぞれにアリコートする。
注意:HAヒドロゲルはゲル化に一定の時間を有する。早期のゲル化が発生した場合は、塗布時のユーザ効率のためにゲル溶液アリコートの量を調整します。 - HA-SH溶液のpHを、使用直前の1 N NaOHで8.0に調整します。40 μL の HA-SH と 10 μL の PEGDA を混合し、時間の経過に伴うゲル化をモニタリングすることで、テストゲル化を行います。通常、ゲル化は、PEGDA架橋器とHA-SHを混合した後、5〜8分開始します。
- 遠心分離細胞懸濁液はペレット細胞に2分間(200xg、室温)する。 g慎重に上清を除去し、HA-SHの適切な体積の細胞を再懸濁します。
注:最終ヒドロゲルは4:1 HA-SH:PEGDA溶液(体積別)であるため、細胞は50 μLの最終体積のためにHA-SHの40 μLで再懸濁する必要があります。 - HAの細胞の1アリコートにPEGDAの10 μLを加える。マイクロ流体プレートを播種する前に、よく混ぜて1〜3分待ちます(ステップ4.4からのゲル化時間に応じて)。
注:シード処理の前に開始のゲル化反応を許可することは、細胞の沈降を最小限に抑えるのに役立ちます。 - 1.5 μLの容積を単一のチャネル反復ピペットに分配するための先端を貼り付け、HAヒドロゲル溶液のセルを使用して負荷を出します。ヒドロゲルアリコートを十分に混合して細胞分布を確保することを忘れないでください。
- マイクロ流体プレートをシードするには、ピペットチップをプレートに垂直に位置合わせし、先端をゲル入口の中央(柱1、5、9、13、17、21)にそっと配置し、ヒドロゲル溶液を分配する際に接触を確保しますが、圧力を加えないようにします。早期のヒドロゲル凝固を防ぐために迅速に働き、各ゲル注入口に1.5 μLのゲル溶液を分配します。
- マイクロ流体チャネルの充填状態を、プレートの上部、プレートの底面、または顕微鏡で観察し、負荷を評価し、 図3 をガイドとして使用して( 図3Aでのロードに成功、 図3Bのピペット測位ガイダンス、 図3Cでの読み込みに欠損、 図3Dで終点に満たさない、 図3Eのオーバーフロー)次のチップの充填成功を改善する可能性のある技術に必要な調整を特定します (トラブルシューティングのヒントについては、「解説」を参照)。
- HA溶液の残りの3つのアリコートでステップ4.6-4.9を繰り返します。次のアリコートを準備しながらプレートを反転させます(〜1分)。
注:プレートの1分の待ち時間と反転は、ゲル化が起こるにつれて細胞の沈降を減少させることによって細胞の3D分布を改善する。 - すべてのチップを充填した後、37°Cのプレートを加湿インキュベーターで、ゲル化が完了するまで(〜45分)インキュベートします。
- 付属のマニュアルを使用して、灌流ロッカーが正しい灌流設定(14°角度、4分間隔)で細胞培養インキュベーターに取り付けられていることを確認してください。
- PDX培養培地を50μLを全ての培地入口(列2、6、10、14、18、22)に加え、プレートを反転してチャンネルが正しく充填されているか確認します。プレートを表面にそっとタップして、マイクロ流体チャネルを満たす液体を促します。
- すべての中型アウトレット(列4、8、12、16、20、24)に対して、DMEM-F12(10%FBS)を50 μL追加します。もし、空気泡が灌流流に閉じ込められている場合は、プレートを表面にそっと叩いて取り除きます。
- 顕微鏡とプレートレイアウトフォーム(補足図1)を使用して、チップ充填の成功を記録します。不適切に充填されたチップを、さらなる実験的使用から除外する。
- 14°の傾きと4分のサイクルに設定されたチルトロッカーにプレートを置き、灌流を開始します。PDX培養培地は2日ごとに交換してください(入口では最初の50 μL、次に出口では50 μL)。
5. 細胞染色、イメージング、画像定量
- 3つの蛍光色素を含有する細胞生存アッセイ溶液を調製する(Hoechst 33342、エチジウムホモジマー-1、カルセインアセトキシメチル[AM])。
- 各染料のストック溶液を次のように準備します: 脱イオン水で1.6 mM(1 mg/mL)でHoechst 33342;無水DMSOで4 mMでカルセインAM;DMSO/H22 O (1:4、v/v) で 2 mM のエチジウム ホモジマー-1。
注: ストックカルセイン AM およびエチジウム ホモジマー-1 ソリューションは、 材料表のキットに記載されています。 - HBSSまたはフェノールレッドフリー培地で、3つの色素すべてを含む単一の作業溶液を調製します。各細胞タイプおよびマトリックスの最終作業濃度を、Hoechst 33342の場合は1.6-8.0 μM、カルセインAMの場合は0.1-10 μM、エチジウムホモジマー-1の場合は0.1~10 μMの範囲内で最適化します。
- 各染料のストック溶液を次のように準備します: 脱イオン水で1.6 mM(1 mg/mL)でHoechst 33342;無水DMSOで4 mMでカルセインAM;DMSO/H22 O (1:4、v/v) で 2 mM のエチジウム ホモジマー-1。
- 培養培地を除去し、必要なマイクロ流体チップ(流入口に75 μL、出口に25μL)に働く生き生き性色素溶液を塗布し、細胞培養インキュベーター内の灌流ロッカーに1時間戻します。
- 手動または自動共焦点顕微鏡(材料表)と蛍光フィルター(励起/発光波長として記載されています、nm)を使用して染色された培養物の観察窓を画像化し、すべての核(Hoechst 33342、350/461)、死細胞核(エチジウムホモジマー-1、528/617)、および生きた細胞質を観察します。
- 20x空気の目的を使用して、ステップサイズ≤1 μmの140 μm Zスタックをキャプチャします。マイクロチャネル全体を少量のオーバーラップでイメージ化するには、3つの視野が必要です。二重サンプリングを避けるために、チップごとに2つの視野のみを画像化します。
注: イメージの条件は、適切な NyQuist サンプリングを確保するために最適化する必要があります。著者の経験では、従来のエピ蛍光源または共振走査モードのデコンボリューションに基づく高速イメージングシステムは、3つのレーザー色を持つ完全なZスタックを合理的な時間内にプレート上の96チップにわたって完全にアッセイする必要があります(セットアップを含む自動イメージングを含む約3.5時間)。 - 画像解析ソフトウェアを使用して、Zスタック画像を、形態、凝集状態、またはその他の特徴などの所望の定量データに対してアッセイする。細胞生存率を定量化するには、死細胞(赤)と全細胞核(青)の数を数えます。
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Representative Results
プログラム可能な灌流ロッカーを標準的な水ジャッキ細胞培養器で調製し、2車線のマイクロ流体プレートをローディング用の標準的なバイオセーフティキャビネットに用意した(図1)。MDA-PCA-118b PDX腫瘍は、インビボで拡大し、最大サイズに達したときに収穫し、プロトコルセクション2に記載されているように解離して細胞のスラリー懸濁を作り出し、ほぼ単一細胞状態で(図2A)。スラリーを6ウェル組織培養プレートに分配し、記載されているようにXY回転器の上に48時間置いた。組織培養板の底部に付着したマウス間質は、前述のように、ヒトPDX細胞が培地に浮遊したまま、クラスターに集まった(図2B)。組み立てられていない単一の細胞も、溶液全体に見えました。
ステップ密度勾配は、プロトコルセクション3の方法を用いて遠心管に確立された。PDX細胞の上清懸濁液をマルチウェルプレートから穏やかに吸引し、ステップ勾配にロードし、説明したように遠心分離した。遠心分離後、PDXクラスタを含むかすんだバンドを、画分2と3の間の界面付近に見え、単一細胞を画分1と2の間の界面で同定した(図2D)。画分は、記載されているように採取し、HBSSでさらに希釈し、再び遠心分離して、密度勾配溶液を除去した。上清を吸引し、得られた細胞ペレットをPDX処理媒体で再懸濁した。各処理された分率の小さなアリコートを顕微鏡で評価し、予想される分数がPDXクラスターを含み、別々の分画が主に単一細胞を含んでいたことを確認した。
HAヒドロゲル溶液は、プロトコルセクション4に記載されているように再構成し、PDXクラスターをヒドロゲル溶液中で再懸濁した。PDX溶液はマイクロ流体プレート上のチップにロードされ、正常な負荷を評価した(図3)。ほとんどの場合、>90%のチップは、ボリュームのロードのテクニックと調整を行った後、正常にロードされました。所望のチップ数をロードした後、記載されているようにゲル化のためのインキュベート、PDX培養培地をマイクロ流体プレートに添加し、プレートを灌流で培養した。
プロトコルセクション5の蛍光色素と方法、および共焦点顕微鏡法を用いて、3D微小流体PDX培養の生存率および形態は、分離されていないと密度の両方の勾配遠心分離条件で評価した(図4A)。これらのプレートの画像を共焦点顕微鏡上でZスタックとして記録し、画像解析ソフトウェアにおける細胞生存率を評価した。1日目、分離法を経た培養物は、分離されていない培養物と比較して、単一の死細胞(赤)を10倍少なく示した(図4B)。重要なことに、分離されたクラスターは主に生細胞(緑色)で構成されていました。クラスターサイズ分布について統計的に有意な差は認められなかった (図 4C)。
培養液は、マイクロ流体プレート内で7日間さらに維持された(図5A)。サンプルは、上記と同様のイメージング法および定量方法を用いて、定期的に評価した。生細胞の総数は一貫したままであり、クラスターは培養の寿命にわたって生存率が80%(図5C)を保持した。分離されていない状態の細胞密度は、単一の細胞が細胞カウント中に生きているが、ヒドロゲル内ですぐに死ぬので、分離された状態のおよそ3分の1である。密度勾配分離を伴わないクラスタ サイズの変動性も高くなります。
図1:2車線透過性マイクロ流体プレート。(A)2車線マイクロ流体プレートは、ガラス板の間にマイクロ流体チャネルが埋め込まれた修正された底を備えた標準の384ウェルマイクロティタープレートです。各プレートは、3D細胞培養のための96のティッシュチップから成ります。(B)プレートの上から見ると、単一の2レーンマイクロ流体チップは、ゲルチャネル(赤)と灌流チャネル(青)で接続された行の4つのウェルで構成されています。ゲル入口、灌流注入口、観察窓、および灌流出口。(C)灌流は、重力を使用して、メディアリザーバである灌流注入と出口井戸の間の媒体を駆動するプログラム可能なロッカーを備えたマイクロ流体プレートで達成される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: PDX クラスター分離(A)一次PDX組織を解剖し、ヒトPCa細胞とマウス腫瘍間質の両方を含む単一細胞懸濁液に解離する。凍結保存解除細胞混合物または(B)腫瘍細胞を再クラスター化し、マウス間質細胞が組織培養プレート(48時間)に付着することを可能にする回転培養に加える。(C) 密度勾配遠心分離を使用して残留死んだ単一細胞を除去し、 (D) 密度勾配層 40% と 55% (赤色の破線ボックス) の間のインターフェースで実行可能な PDX クラスターを収集します。(E)PDXクラスタを回収し、ヒドロゲル前駆体溶液で再懸濁し、繰り返しピペットでプレートに分配する。(F)表1に対応する計算例は、プレート全体ですべてのチップに対して最終的に望ましいセル濃度に到達するために必要な初期細胞数を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロ流体プレートの負荷を監視する。 負荷の成功およびエラーは、顕微鏡による確認と(上および下のビューで)目で評価することができる。(A) 正常な荷重は、上と下のビューで開いた(明るい)灌流レーンと、下部ビューの少し暗いゲルレーンによって識別されます。顕微鏡による可視化は、ゲルレーンが隣接するレーンにこぼれることなく、細胞およびゲル前駆体で完全に満たされたことを確認する。(B)ゲル塗布中に正しいピペットチップの配置を示す漫画、正しい配置が入口ポートのすぐ上(左)であり、誤った配置が中心外(中央)であるか、または入口ポート(右)に力を加える。(C)すべてのビューの明るい車線は、ピペットチップがゲル入口内に正しく配置されないことを示唆し、負荷が欠けたことを示します。(D) ゲルレーンの部分的な充填(端まで充填されていない)は赤い矢印によって識別され、前進するゲル溶液の前面が、閉じ込められた気泡またはローディング中の早期休止によって中断された場所を示す。顕微鏡ビューの赤い矢印は同じ場所を識別します。(E)ゲルレーンの内容物がPhaseGuideをオーバーフローし、灌流レーンにこぼれ、最終的にブロックした。このオーバーフローは、ゲルと灌流の両方の車線の暗い外観によってボトムビューで見えます。スケールバー= 200 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マイクロ流体プレートにおける細胞染色および生存率評価。(A)蛍光染色剤を用いて、マイクロ流体プレートに播種された分離されていない分離PCa細胞クラスターで生存率を評価した(すべての核:Hoechst 33342、青;死細胞:エチジウムホモジマー-1、赤、生細胞:カルセインAM、グリーン)。スケールバー= 50 μm(B)全死細胞を培養1日目に定量し、分離したMDA-PCa-118b PDX培養は、死細胞数の有意な減少を示した。(C)PCa PDXのクラスタサイズの定量化は、分離培養および分離されていない培養において、わずかな増加を示したが、統計的に有意な差は示さなかった。パネル B のバーと誤差範囲は、条件ごとに 4 つの画像の平均値と標準偏差を表します (2 つのチップと 2 つのイメージ/チップ)。アスタリスク (*) は、学生の t 検定を使用した分離されていない状態と比較して、統計的に有意な差 (p < 0.05) を表します。パネル C のボックスとウィスカーのプロットの場合、クロス アイコンは平均を示し、水平線は条件ごとに 4 つの画像 (2 つのイメージ/チップを持つ 2 つのチップ) の中央値を表します。ボックスにはデータの 50% が含まれ、ウィスカは各条件の最小および最大クラスター直径まで拡張されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マイクロ流体プレート内で分離されたMDA-PCa-118bの特性評価(A)分離(左)と分離されていない(右)PCa癌細胞クラスターをマイクロ流体プレートに播種し、最大7日間浸透させた。培養物は、全ての核に特異的な3つの色素(Hoechst 33342、青)、死細胞(エチジウムホモジマー-1、赤)、生細胞(カルセインAM、グリーン)で染色した。スケールバー = 50 μm(B,C)8,000細胞/μLの播種密度での培養1週間にわたる細胞数と培養生き残り率を定量化します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| シングルチップ(セル/μL)における最終的な望ましい細胞密度 | チップあたりのボリュームロード(μL) | マイクロ流体プレート上のチップ数 | 余分なボリュームのためのムティプリアー | 図2C:フルマイクロウェルプレートに必要な分離細胞数(ステップ3.8) | 乗数の対象 細胞の損失 (間質除去、 細胞死) |
図 2B: プロトコルの解約 PDX セルの開始番号 (ステップ 2.8) |
| 2,500 | 1.5 | 96 | 1.3 | 4.7E+05 | 3 | 1.4E+06 |
| 5,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 9.4E+05 | 3 | 2.8E+06 |
| 10,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 1.9E+06 | 3 | 5.7E+06 |
| 20,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 3.7E+06 | 3 | 1.1E+07 |
表1:単一の2車線マイクロ流体プレートを積み込むために必要な初期および最終PDX材料の概算。
補足図1:2車線マイクロ流体プレートレイアウト。 マイクロ流体プレートをシードした後、2車線のプレートレイアウトを使用して、個々のチップのロード成功(成功、ローディングの失敗、端に充填されない、またはオーバーフロー)を記録します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、高スループットの3D培養システムにおける生き生きとPDX由来腫瘍細胞の処理および培養方法について説明する。このプロトコルはPCa PDX組織を利用するが、他の上皮由来腫瘍にも同様に有効である。腫瘍の特徴は、同じ起源の組織(前立腺、乳房など)内であっても、個々のPDXライン間で変化する。いくつかの PCa PDX ラインは、より繊維性および他の細胞がより細胞性である間から生存細胞を分離することは困難です。.ここで示される腫瘍のサイズは、特に低収量の腫瘍に対してより多くの組織を提供するためにIACUCガイドライン内で変化させることができる。さらに、腫瘍断片は、ステップ2.7の後に収集され、再消化され、収量を増加させるために最初の消化とプールすることができる。これは、より多くの細胞外マトリックス重い腫瘍のために特に有用です.2つを超える消化の追加ラウンドは、通常、低生存率と低収率をもたらし、推奨されません。
PDX由来集団の精製は、死んでいる/死んでいる細胞または汚染された宿主細胞を除去するために、所望の癌細胞の拡張された3D培養および定量化のために有益である。ここで説明する精製の最初のステップは、比較的大量の媒体中の懸濁液培養と中程度の速度でのXY回転と共に、1)接着性の高い細胞の選択的抽出を促進し、典型的にはマウス間質線維芽細胞、および2)細胞凝集体を形成して生存前細胞細胞接触を供給する。48時間のXY回転工程中に宿主由来マウス線維芽細胞を抽出する効率は、Fongら.5に記載されているように非常に高い。意図的なPCa線維芽細胞の共培養は、我々が示したように、確かに実現可能であるが、(マトリックスに線維芽細胞の接着をサポートするために)調整されたマトリックスと繊維芽細胞のより大きな割合を必要とする。時折PDXは、通常、より多くの間葉特性を有するもので、48時間回転培養工程中に組織培養表面により容易に付着する。PDX線は、このプロトコルが初めて実施された時に注意深く監視されるべきであり、かつ、HNAに対する免疫染色は、付着性および非接着集団におけるヒト細胞の割合を同定する。非組織培養処理プレートは、これらのPDXでのクラスター形成に使用する必要があります。マウス間質細胞は最終的に表面に付着しますが、分離は効率的ではありません。
次の回転培養は、非付着母集団を含む上清を、記載された濃度勾配遠心分離法を通じて処理される。ここで報告されるプロトコルは、少なくとも1つの密度ステップを除外するように単純化することができます(例えば、20%、40%、55%の溶液のみを使用する)が、新しいPDXごとにこの方法を確立する際には4つすべてを使用する必要があります。多細胞クラスターは、この方法によって個々の細胞から容易に分離され、その大部分は、それらのクラスター化された表現型および他の特性を保持する。廃棄された単一細胞集団は、(a)48時間の回転ステップの前に死んでいた/死んでいた細胞、したがってクラスターに統合されたことがない細胞、または(b)48時間の回転後も生き続けたが、まだクラスターに統合されなかった細胞を表す。グループ(b)には、一部の研究者が望ましいと思う細胞が含まれている可能性があることに注意することが重要です。例えば、いくつかの報告は、初期のステム/前駆細胞を含む一次細胞培養、または薬剤耐性細胞を、そうでなければ付着性の集団10以上の接着性の低い単一細胞として上清内に浮遊する。癌研究に関連して、循環腫瘍細胞(CTCs)、腫瘍開始細胞(TIC)、または他の同様の転移促進細胞タイプは、この単一細胞集団の一部であり得る。したがって、私たちのプロトコルを使用する研究者は、関心のある細胞が失われていないことを確認するために、廃棄された単一細胞集団を慎重に分析する必要があります。私たちの手の中では、これらの単一細胞の大部分は、最初の組織解離プロトコルのために死んでいる/死んでいる癌細胞のごく一部、またはすでにアノイキスを通して進行しているげっ歯類線維芽細胞のいずれかです。
限られた貴重なPDX材料で作業する際に成功を確実にするために、あまり貴重な細胞でマイクロ流体プレートを播種する技術を実践することを強くお勧めします。不適切なテクニックは、負荷中に圧力が加えられると1)オーバーフロー、またはチップが入口ポートの上に中央に配置されていない場合は、2)空または部分的に充填されたチャネルをもたらす可能性が高いので、塗布中のチップの配置に注意してください。早期のゲル化はまた、チャネルが最後まで満たされない原因となります。これが発生した場合は、PEGDA架橋剤の添加とゲル溶液の塗布の間の待ち時間を短くするか、または一度にゲル溶液のより小さなアリコートで作業します。このプロトコルで使用される分配の容積はHAヒドロゲルの成功のために十分に合った。このシステムでMatrigelのようなより粘性のあるソリューションを使用するには、マイクロ流体チャネルを適切に充填するために、分配量を〜2 μLに増加させる必要があります。また、ステップ4.3で50μL増分を選択し、この同じステップで4つの細胞ペレットを調製し、ステップ4.10で繰り返し再懸濁が意図的であることにも注意してください。彼らは必要以上に多くの材料を得るが、彼らはまた、繰り返しピペットからの損失を考慮するために過大を提供します。
なお、各PDXは、この3D培養モデル内で固有の形態およびサイズ分布を有する可能性が高い。ある意味では、これは、患者病、組織の歴史、マトリックスパラメータ、および他の多くの要因の多様性のために、期待される。マトリゲルにおける複数の前立腺癌ラインの広範な評価は、この潜在的な多様性11を実証した。それでも、研究者は上記のパラメータの大きなバリエーションを見つけて驚くかもしれません。準備中の原稿では、この文化プラットフォーム上のいくつかのPDXについて広く見ています。細胞は各PDXタイプ内で一貫した応答を維持するが、標本によって大きく異なる可能性があり、その結果、クラスター当たりの細胞密度が高い、またはより小さいクラスターが細胞間接続を緩くする。各PDXの特定の挙動は、予測可能で特徴的な形態を確認するために、複数の試験にわたって研究者によって評価されるべきである。研究者は、この論文で概説されている一般的な行動に標本が従うことを期待できる。
要約すると、提示されたプロトコルは、培養条件の微調整と組織特異的細胞外マトリックス(ECM)および灌流流などの関連する3D環境キューを組み込むことを可能にするプラットフォームでPDXs ex vivoを採用するための新しい方法を研究者に提供し、数日または数週間にわたって細胞生存を延長することを可能にする。これらの文化の詳細な特徴付けは、ここで示した染色および形態学的解析によって達成された。さらに、必要に応じて、培養物をプレートリーダーベースのアッセイ、免疫蛍光標識、またはさらなる分子特性を可能にするライセートの調製に使用することができる。これまで、ヒドロゲル内でPDX 3D培養の要素をいくつか発表しましたが、この多段階精製の応用は新しく、標準的な実験室で採用しやすく、高生存性の代表的な文化を保持することに成功しています。OrganoPlateプラットフォームは、2車線および3車線の品種で、組織灌流のモデルを通じてさらなる複雑さを提供し、実験ごとにさらに少ない細胞を使用する重要な機会を提供します。当社の以前のモデルと比較して、マイクロ流体プラットフォームは、ほとんどの実験室でPDX腫瘍組織の可用性が乏しいため、実験ごとに細胞要件を〜30倍に減少させました。マイクロ流体システムは、十分な大きさの細胞集団(n =〜2,000-4,000細胞/イメージングウィンドウ)を介して拡張イメージング、免疫染色、およびファシリティイメージングを可能にし、空間組織の文脈内で表現型の定量を可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所SBIRフェーズI(HHSN26120700015C)およびP01CACA098912によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
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