Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform
Summary
Denne protokollen demonstrerer metoder for å muliggjøre utvidet in vitro kultur av pasientavledede xenografts (PDX). Ett trinn forbedrer den generelle levedyktigheten til flercellede klyngekulturer i 3D-hydrogeler, gjennom enkel fjerning av ikke-levedyktige enkeltceller. Et sekundært trinn viser beste praksis for PDX-kultur i en perfundert mikrofluidisk plattform.
Abstract
Pasientavledede xenografter (PDX), generert når resected pasient tumorvev er engrafted direkte inn i immunkompromitterte mus, forblir biologisk stabil, og dermed bevare molekylære, genetiske, og histologiske egenskaper, samt heterogenitet av den opprinnelige svulsten. Men å bruke disse modellene til å utføre en rekke eksperimenter, inkludert narkotikascreening, er uoverkommelig både når det gjelder kostnader og tid. Tredimensjonale (3D) kultursystemer er viden sett på som plattformer der kreftceller beholder sin biologiske integritet gjennom biokjemiske interaksjoner, morfologi og arkitektur. Vårt team har lang erfaring med å kultere PDX-celler in vitro ved hjelp av 3D-matriser bestående av hyaluronsyre (HA). For å skille mus fibroblast stromal celler forbundet med PDXs, bruker vi rotasjonskultur, hvor stromale celler holder seg til overflaten av vev kulturbehandlede plater mens dissosierte PDX tumorceller flyter og selv-knyttes til flercellede klynger. Også flytende i supernatant er enkle, ofte døde celler, som presenterer en utfordring i å samle levedyktige PDX klynger for nedstrøms innkapsling i hydrogeler for 3D cellekultur. For å skille disse enkeltcellene fra levende celleklynger, har vi ansatt tetthet trinn gradient sentrifugering. Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å tømme ikke-levedyktige enkeltceller fra den sunne populasjonen av celleklynger som vil bli brukt til videre in vitro eksperimentering. I våre studier inkorporerer vi 3D-kulturene i mikrofluidiske plater som tillater medieperfusjon under kulturen. Etter å ha vurdert de resulterende kulturene ved hjelp av en fluorescerende bildebasert levedyktighetsanalyse av rensede versus ikke-rensede celler, viser våre resultater at dette ekstra separasjonstrinnet betydelig reduserte antall ikke-levedyktige celler fra våre kulturer.
Introduction
I løpet av det siste tiåret har feltet for kreftforskning vist fornyet entusiasme for pasientavledede xenografts (PDXs) som et verktøy for å vurdere kreftcelleveiavhengighet og legemiddelfølsomhet1. De vanligste PDX-modellene er etablert ved subkutan eller ortopisk implantasjon av menneskelige tumorceller – et tumorfragment, en klynge av dissosierte tumoravledede celler eller en prøve av isolerte sirkulerende tumorceller (CTCer) – til en gnagervert. Hvis svulsten “ta” er vellykket, vil xenograftcellene spre seg, vaskularisere og ellers samhandle med vertsvevet for å skape en svulst, som kan høstes i optimal størrelse, deles og implanteres i andre verter. Blant deres mange fordeler som modellsystem beholder PDXs vanligvis en betydelig del av den innfødte tumorcellepopulasjonens heterogenitet og muliggjør vurdering av menneskespesifikke veierog celleresponser 2,3. In vivo-konteksten muliggjør tumorinteraksjon med vaskulatur og andre tilstøtende stroma og rekafulerer vevsegenskaper som stoffdiffusjonsdynamikk, oksygenspenning og ekstracellulær matrisepåvirkning som biologisk og mekanisk påvirker tumorprogresjonen. Et negativt aspekt ved PDXs er deres avhengighet av en gnagervert, både for tumorutvidelse og til slutt for hypotesetesting. Fordi mange PDX-er ikke kan tilpasse seg tradisjonell todimensjonal (2D) kultur på vevskultur polystyren uten å miste mange av sine ønskelige egenskaper, har det vært minimal middelvei for forskere mellom denne relativt kontrollerte in vitro-metoden, og den betydelige økningen i utgifter, fasiliteter og tidskrav for in vivo PDX-bruk.
Vi har beskrevet flere in vitro-modeller som implementerer 3D-cellekultur i en støttende matrise, og nylig utvidet dette arbeidet med å demonstrere ex vivo-kulturen til flere prostatakreft (PCa)-avledede PDXs, både alene og i co-kultur med benmargsavledet fibroblaster4,,5. Hyaluronsyre (HA)-baserte vanngelmatriser gir tilpassbar og biologisk relevant støtte for begge celletyper, med facile kontroll over hydrogelegenskaper og optisk klarhet for avbildning gjennom hydrogeldybden6.
Modne PDX tumorvev består av en variabel blanding av heterogene humane kreftceller og mus stroma (fibroblaster, endotelceller, etc.). For å studere celle-type spesifikke bidrag til tumorprogresjon in vitro, kan det være en fordel å dissosiere svulster, skille cellepopulasjonene og eksperimentelt innlemme dem på en organisert måte for å dissekere veier for intercellulær kommunikasjon. De blandede cellepopulasjonene i vevsfordøyer har differensialkompatibilitet med spesifikke kulturforhold. For eksempel, tumor-assosiert fibroblast levedyktighet nødvendiggjør enten overflatetilslutning eller 3D matriser funksjonalisert med integrinske ligands, mens epitel-avledede PDX-celler vanligvis ikke har disse kravene, i stedet favoriserer cellecelleinteraksjoner. Disse forskjellene kan utnyttes for å oppnå effektiv separasjon av PDX-celler fra forurensende musstromale celler. Rotasjonskultur av vevsfordøyer gjør at stromal celleoverholdelse av vevskulturoverflaten mens cellecelleadhesjoner driver PDX-celler som flyter over den roterende kulturoverflaten for å danne flercellede klynger i supernatanten i 24-48 timer. De spesifikke egenskapene til disse klyngene varierer med PDX (f.eks. store, stramme, svært sfæriske klynger eller mindre, løsere aggregater som ligner bunter av druer), men er vanligvis av biologisk relevante størrelser (50-250 μm diameter), tilstrekkelig for å vurdere cellulære interaksjoner som er avhengige av intercellulære kontakter.
Tumorhenting og behandling resulterer uunngåelig i en viss grad av sikkerhet celledød, enten på grunn av kortsiktigskade fra mekanisk / enzymatisk forstyrrelse, eller langsiktig inkompatibilitet av underpopulasjoner med de valgte kulturforholdene. Til tross for nytten av rotasjonskultur som en innledende bulkseparasjon, overføres døde eller døende celler uunngåelig med PDX-klyngene og kan påvirke den resulterende kulturen. Disse døde cellene er ofte individuelle PDX-celler som ikke ble integrert i en klynge, musstrommale fibroblaster som ikke kan overleve under utvalgte kulturforhold, eller spesielt skjøre endotelceller. Slike døende celler kan påvirke eksperimentelle resultater fra “overlevende” og kan i stor grad påvirke kvantifisering, for eksempel via fluorescerende bildebaserte levedyktighetsscreeningsanalyser. For å forbedre utvalget av levende PDX-celler fra denne metoden, tilpasset vi sentrifugeringsmetoder med tetthetstrinn for enkelt å fjerne individuelle døde / døende celler fra PDX-blandinger og beholde hovedsakelig levende flercellede klynger.
For å forbedre studien av resulterende PDX-avledede klynger i 3D-kultur, vi benyttet en mikrofluidisbasert perfusjonskulturplattform, OrganoPlate (Figur 1), som er en høy gjennomstrømningsorgan-on-a-chip plattform som muliggjør samtidig kultur på opptil 96 individuelle perfused, 3D-kulturer på en 384-brønns mikrotiter platebase (figur 1A)7,8. I 2-felts mikrofluidisk plate er en enkelt vevsbrikke forbundet med to mikrofluidiske kanaler (figur 1B, gelkanal: rød, perfusjonskanal: blå) som strekker seg over fire brønner på rad. De to mikrofluidiske kanalene er adskilt av en kort plastrygg kalt en Phaseguide som forhindrer overløp av en kanal inn i sin tilstøtende nabokanal, og samtidig gir mulighet for et membranfritt grensesnitt mellom innholdet i gelen og perfusjonskanal9. Fordi bunnen av mikrofluidplaten består av mikroskop-grade glass, kan kulturene ses i observasjonsvinduet gjennom bunnen av platen med et standard eller automatisert mikroskop. Perfusjon er etablert i mikrofluidisk plate med en programmerbar rocker, ved hjelp av tyngdekraften til å drive media gjennom mikrofluidiske kanaler, mellomreservoarbrønner ( figur 1C). Perfusjonsstrømmen etterligner nærmere tumormikromiljøet enn statisk kultur, noe som åpner for inkorporering av skjærstress og forbedret fordeling av gasser og næringsstoffer. Fordelene med å opprettholde en perfundert kreftcellekultur i mikrofluidisk plate har tidligere blitt beskrevet som perfused brystkreftkulturer som viste optimal levedyktighet sammenlignet med en statisk 3D-kultur av de samme cellene7.
Den nåværende rapporten beskriver en adapted density gradient sentrifugeringsmetode for å isolere levende flercellede PDX-klynger og demonstrerer sitt verktøy for å etablere 3D PDX-kulturer innenfor 1000 mikrofluidiske plater. Fordi et økende antall forskningslaboratorier søker metoder for å lette PDX-bruk, forventer vi at protokollene som presenteres her, vil være til umiddelbar nytte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode for behandling og dyrking av levedyktige PDX-avledede tumorceller i et høyt gjennomstrømmings-, perfundert 3D-kultursystem. Mens denne protokollen benytter PCa PDX vev, det er like effektivt for andre epitel-avledede svulster. Tumoregenskaper varierer mellom individuelle PDX-linjer selv innenfor samme opprinnelsesvev (prostata, bryst, etc.). Noen PCa PDX linjer er mer fibrotiske og vanskelig å isolere levedyktige celler fra mens andre er mer cellulære. Tumorstørrelsen som er nevnt her, kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) og P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
