Affettare e coltivare i cuori di maiale in condizioni fisiologiche
Summary
Questo protocollo descrive come affettare e coltura tessuto cardiaco in condizioni fisiologiche per 6 giorni. Questo sistema di coltura potrebbe essere utilizzato come piattaforma per testare l’efficacia di nuove terapie per l’insufficienza cardiaca, nonché test affidabili della cardiotossicità acuta in un modello di cuore 3D.
Abstract
Molti nuovi farmaci falliscono negli studi clinici a causa di effetti collaterali cardiotossici, poiché i saggi in vitro attualmente disponibili e i modelli animali in vivo predicono male le passività cardiache umane, il che rappresenta un onere multimiliardario sull’industria farmaceutica. Pertanto, vi è una necessità medica insoddisfatta in tutto il mondo di approcci migliori per identificare la cardiotossicità dei farmaci prima di intraprendere studi costosi e dispendiosi in termini di tempo “first in man”. Attualmente, solo le cellule cardiache immature (cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali derivate da cellule staminali umane [hiPSC-CMs]) vengono utilizzate per testare l’efficienza terapeutica e la tossicità dei farmaci in quanto sono le uniche cellule cardiache umane che possono essere coltivate per periodi prolungati necessario per testare l’efficacia e la tossicità del farmaco. Tuttavia, un tipo di singola cellula non può replicare il fenotipo del complesso tessuto cardiaco 3D che è formato da più tipi di cellule. È importante sottolineare che l’effetto dei farmaci deve essere testato sui cardiomiociti adulti, che hanno caratteristiche e risposte di tossicità diverse rispetto ai immaturi hiPSC-CMs. Culturing human heart slices è un modello promettente di miocardio umano intatto. Questa tecnologia fornisce l’accesso a un sistema multicellulare completo che imita il tessuto cardiaco umano e riflette le condizioni fisiologiche o patologiche del miocardio umano. Recentemente, attraverso l’ottimizzazione delle componenti dei mezzi di coltura e le condizioni di coltura per includere la stimolazione elettrica continua a 1,2 Hz e l’ossigenazione intermittente del mezzo di coltura, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di coltura che preserva la vitalità e funzionalità di fette di cuore umano e maiale per 6 giorni in coltura. Nel protocollo attuale, stiamo descrivendo in dettaglio il metodo per affettare e coltivare il cuore di maiale come esempio. Lo stesso protocollo viene utilizzato per la coltura di fette da cuori umani, cani, pecore o gatti. Questo sistema di coltura ha il potenziale per diventare un potente modello predittivo in situ umano in situ per test di cardiotossicità acuta che colma il divario tra i risultati dei test preclinici e clinici.
Introduction
La cardiotossicità indotta da farmaci è una delle principali cause di ritiro del mercato1. Nell’ultimo decennio del XXsecolo, otto farmaci non cardiovascolari sono stati ritirati dal mercato in quanto hanno provocato la morte improvvisa a causa di aritmie ventricolari2. Inoltre, diverse terapie anti-cancro (mentre in molti casi efficace) può portare a diversi effetti cardiotossici tra cui cardiomiopatia e aritmie. Ad esempio, le terapie di cancro al seno sia tradizionali (ad esempio, antracicline e radiazioni) che terapie mirate (ad esempio, trastuzumab) possono provocare complicazioni cardiovascolari in un sottoinsieme di pazienti3. Una stretta collaborazione tra cardiologi e oncologi (attraverso il campo emergente della “cardio-oncologia”) ha contribuito a rendere queste complicazioni gestibili assicurando che i pazienti possano essere trattati efficacemente2. Meno evidenti sono gli effetti cardiovascolari degli agenti più recenti, tra cui Her2 e PI3K inibitori, soprattutto quando le terapie vengono utilizzate in combinazione. Pertanto, c’è una crescente necessità di strategie di screening preclinico affidabili per le tossicità cardiovascolari associate alle terapie anti-cancro emergenti prima degli studi clinici sull’uomo. La mancanza di disponibilità di sistemi di coltura per il tessuto cardiaco umano che è funzionalmente e strutturalmente praticabile per più di 24 h è un fattore limitante per test di cardiotossicità affidabili. Pertanto, è urgente sviluppare un sistema affidabile per la coltura del tessuto cardiaco umano in condizioni fisiologiche per testare la tossicità dei farmaci.
Il recente movimento verso l’uso di cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali plurimi indotti dall’uomo (hiPSC-CMs) nei test di cardiotossicità ha fornito una soluzione parziale per affrontare questo problema; tuttavia, la natura immatura degli hiPSC-CM e la perdita di integrità dei tessuti rispetto alla natura multicellulare del tessuto cardiaco sono i principali limiti di questa tecnologia4. Uno studio recente ha parzialmente superato questa limitazione attraverso la fabbricazione di tessuti cardiaci da hiPSC-CMs su idrogel e sottoponendoli ad un graduale aumento della stimolazione elettrica nel tempo5. Tuttavia, le loro proprietà elettromeccaniche non hanno raggiunto la maturità osservata nel miocardio umano adulto. Inoltre, il tessuto cardiaco è strutturalmente più complicato, essendo composto da vari tipi di cellule tra cui cellule endoteliali, neuroni e vari tipi di fibroblasti stromali collegati insieme a una miscela molto specifica di proteine della matrice extracellulare6. Questa eterogeneità della popolazione cellulare non cardiomiocite7,8,9 nel cuore dei mammiferi adulti è un ostacolo importante nella modellazione del tessuto cardiaco utilizzando singoli tipi di cellule. Queste principali limitazioni evidenziano l’importanza di sviluppare metodi per consentire la coltura di tessuto cardiaco intatto per studi ottimali che coinvolgono condizioni fisiologiche e patologiche del cuore5.
Coltivare fette di cuore umano è un modello promettente di miocardio umano intatto. Questa tecnologia fornisce l’accesso a un sistema multicellulare 3D completo che è simile al tessuto cardiaco umano che potrebbe riflettere in modo affidabile le condizioni fisiologiche o patologiche del miocardio umano. Tuttavia, il suo uso è stato fortemente limitato dal breve periodo di redditività nella cultura, che non si estende oltre 24 h utilizzando i protocolli più robusti segnalati fino2018 10,11,12. Questa limitazione era dovuta a molteplici fattori tra cui l’uso dell’interfaccia aria-liquido per la coltura delle fette, e l’uso di un semplice mezzo di coltura che non supporta le elevate esigenze energetiche del tessuto cardiaco. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura sommersi che è in grado di fornire una stimolazione elettrica continua e ottimizzato i componenti dei mezzi di coltura per mantenere le fette di tessuto cardiaco vitali fino a 6 giorni13. Questo sistema di coltura ha il potenziale per diventare un potente modello predittivo in situ umano in situ per i test di cardiotossicità acuta per colmare il divario tra i risultati dei test preclinici e clinici. Nell’articolo attuale, stiamo descrivendo in dettaglio il protocollo per affettare e coltivare le fette di cuore usando un cuore di maiale come esempio. Lo stesso processo viene applicato ai cuori umani, cani, pecore o gatti. Con questo protocollo, speriamo di diffondere la tecnologia ad altri laboratori della comunità scientifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo il protocollo video dettagliato per il nostro metodo recentemente pubblicato per la media throughput semplificata (processi fino a 48 fette/dispositivo) metodo che consente la coltura di fette di cuore di maiale per un periodo sufficientemente lungo per testare la cardiotossicità acuta13. Le condizioni proposte imitano l’ambiente del cuore, compresa la frequenza della stimolazione elettrica, la disponibilità di nutrienti e l’ossigenazione intermittente. Attribuiamo la prolungata …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM è supportato dalla sovvenzione NIH P30GM127607 e dalla sovvenzione 16SDG29950012. RB è supportato da P01HL78825 e UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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