Summary
このプロトコルは、6日間の生理学的条件下で心臓組織をスライスおよび培養する方法を説明する。この培養システムは、3D心臓モデルにおける急性心毒性の信頼性の高いテストと同様に、新しい心不全治療薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用することができる。
Abstract
多くの新薬は、現在入手可能な体外アッセイや生体内動物モデルが人間の心臓負債を十分に予測できず、製薬業界に数十億ドルの負担をかけているため、心毒性の副作用のために臨床研究に失敗する。したがって、高価で時間のかかる「人間の最初の」試験を行う前に、薬物の心毒性を特定するためのより良いアプローチのための世界的な満たされていない医療ニーズがあります。現在、未熟な心臓細胞(ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM))のみが、長期間培養できる唯一のヒト心臓細胞であるため、治療効率と薬物毒性を試験するために使用されている。薬効と毒性をテストするために必要.しかし、単一の細胞型は、複数の細胞型で形成される複雑な3D心臓組織の表現型を複製することはできません。重要なことに、薬物の効果は、未熟なhiPSC-CMsと比較して異なる特性および毒性応答を有する成人心筋細胞に対して試験する必要がある。この技術は、人間の心臓組織を模倣し、ヒト心筋の生理学的または病理学的状態を反映する完全な多細胞システムへのアクセスを提供する。近年、培養培地成分の最適化と培養条件の最適化により、1.2Hzでの連続的な電気刺激及び培養培地の間欠酸素化を含み、生存率を維持する新しい培養システムのセットアップを開発しました。人間と豚の心臓スライスの機能性は、文化の中で6日間。現在のプロトコルでは、例として豚の心臓をスライスし、培養するための方法を詳述しています。同じプロトコルは、人間、犬、羊、または猫の心からのスライスを培養するために使用されます。この培養システムは、前臨床と臨床検査の結果の間のギャップを閉じる急性心毒性試験のための現場モデルで強力な予測ヒトになる可能性を秘めています。
Introduction
薬物誘発性心毒性は、市場撤退の主な原因である 1.20世紀の最後の10年間で、8つの非心血管薬が心室性不整脈2によって突然死したため、市場から撤退した。さらに、いくつかの抗癌療法(多くの場合、有効)は、心筋症および不整脈を含むいくつかの心毒性効果につながる可能性があります。例えば、従来の(例えば、アントラクリンおよび放射線)および標的化された(例えば、トラスツズマブ)乳癌療法は、患者3のサブセットにおいて心血管合併症を生じ得る。心臓専門医と腫瘍学者の間の緊密な協力(「心臓腫瘍学」の新興分野を介して)は、患者が効果的に治療できることを確実に管理可能にするのに役立ちました2.より明確ではない新しい薬剤の心血管効果であります, Her2とPI3K阻害剤を含む, 特に治療が組み合わせて使用される場合.したがって、ヒト臨床試験の前に、新興の抗癌療法に関連する心血管毒性に対する信頼性の高い前臨床スクリーニング戦略の必要性が高まっています。24時間以上機能的かつ構造的に実行可能なヒト心臓組織の培養システムの利用可能性の欠如は、信頼性の高い心毒性試験の制限要因である。したがって、薬物毒性を試験するための生理学的条件下でヒト心臓組織を培養するための信頼性の高いシステムを開発することが急務である。
最近、人が人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(hiPSC-CM)を使用して、この問題に対処するための部分的な解決策を提供した。しかし、hiPSC-CMの未熟な性質と心臓組織の多細胞性と比較した組織完全性の喪失は、この技術4の主要な限界である。最近の研究では、ヒドロゲル上のhiPSC-CMから心臓組織を製造し、時間の経過とともに電気刺激の漸進的な増加を受けることを通じて、この制限を部分的に克服した5。しかし、その電気機械特性は、成人ヒト心筋に見られる成熟を達成しなかった。また、心臓組織は構造的に複雑であり、内皮細胞、ニューロン、および細胞外マトリックスタンパク質の非常に特異的な混合物と共に結合する様々なタイプの間質線維芽細胞を含む様々な細胞タイプから構成されている6。この非心筋細胞の不均一性は、哺乳動物の心臓の成体における非心筋細胞集団の,7、8、9,9が、個々の細胞型を用いて心臓組織をモデル化する上で大きな障害となる。これらの大きな制限は、心臓5の生理学的および病理学的状態を含む最適な研究のために無傷の心臓組織の培養を可能にする方法を開発することの重要性を強調する。
ヒト心臓スライスの培養は、無傷のヒト心筋の有望なモデルである。この技術は、ヒト心筋の生理学的または病理学的状態を確実に反映することができる人間の心臓組織に類似した完全な3D多細胞システムへのアクセスを提供する。しかし、その使用は、2018年10、11、12,11,12まで報告された最も堅牢なプロトコルを使用して24時間を超えない培養における生存率の短い期間によって厳しく制限されている。この制限は、スライスを培養するための空気液体界面の使用、および心臓組織の高エネルギー要求を支持しない単純な培養培地の使用を含む複数の要因によるものであった。我々は最近、連続的な電気刺激を提供し、心臓組織スライスを最大6日間生存可能に保つために培養培地コンポーネントを最適化することができる水没培養システムを開発した。この培養システムは、前臨床と臨床検査の結果の間のギャップを埋めるために、急性心毒性試験のための現場モデルにおいて強力な予測ヒトになる可能性を秘めています。今回の記事では、例として豚の心臓を使用して心臓スライスをスライスし、培養するためのプロトコルを詳述しています。同じプロセスは、人間、犬、羊、または猫の心に適用されます。このプロトコルを使用して、我々は科学界の他の研究所に技術を広めたいと考えています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物の手順は、ルイビル大学の制度ガイドラインに従い、制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました.
1. スライスの準備(スライスする前の1日)
- 振動マイクロトームの調製
- 以下の手順に従って、セラミックブレードをホルダーに入れます:ブレードを慎重に開けた後、鋭いエッジをブレードツールのスロットに最初に配置します。次に、ホルダーの腕の2本のネジを緩めてホルダーにブレードを取り付け、各ワッシャーの下にブレードをスライドさせ、後部の停止にしっかりと押し付けます。ネジを締めてブレードを固定します。
注:ねじは締め過ぎてはならない。 - メーカーのプロトコルに従って、校正プロトコルとツールを使用してブレードをキャリブレーションします。
注:簡単に説明すると、ブレードを移動軸との位置合わせを容易にするため、Z軸偏向を最小限に抑えるために、振動マイクロトームは取り外し可能なキャリブレーション装置を使用する。校正装置が機器に差し込まれると、その存在が自動的に検出され、振動マイクロトームは、ブレードの位置合わせ誤差の調整を可能にする大きさにブレードの振幅と周波数設定を調整する制御を取ります。- スライスボタンを押して、ブレードを自動的に移動させるアライメントプロセスを開始し、最適な位置合わせ評価のために、校正デバイスに対して最適な位置に切刃が配置されるようにします。画面の指示に従って、付属のドライバーを使用してブレードを調整し、Zアライメントが1μm以内であることを確認します。
- 内部浴と振動ミクロトームのすべての金属部分をオートクレーブ。
- 以下の手順に従って、セラミックブレードをホルダーに入れます:ブレードを慎重に開けた後、鋭いエッジをブレードツールのスロットに最初に配置します。次に、ホルダーの腕の2本のネジを緩めてホルダーにブレードを取り付け、各ワッシャーの下にブレードをスライドさせ、後部の停止にしっかりと押し付けます。ネジを締めてブレードを固定します。
- 大きな金属トレイ(スライスを収集し、電気刺激プレートカバーを浸すため)、任意のガラス容器、通常の長方形ブレード、鉗子、はさみ、プリンタタイミングベルト(6mm幅にカット)、金属ワッシャー、ダブル蒸留水(ddH2O)の5 Lをオートクレーブ。
- 1つの1つのL瓶、1つの500 mL瓶および1つのプラスチックトレイをその時に心臓に、そして心肢麻痺溶液との体外灌流で殺菌する。
- 2 Lビーカーでタイローデの溶液をスライスの2 Lを準備します。
- スライスタイローデの溶液の1 Lの場合、3 g / L 2,3-ブタンジオンモノキシム(BDM)、140 mM NaCl(8.18 g)、6 mM KCl(0.447 g)、10 mM D-を混ぜます。 グルコース(1.86g)、10 mM HEPES(2.38g)、1mM MgCl2(1MLの1M溶液)、1.8 mM CaCl2(1.8 mLの1M溶液)、1LのddH2O. NaOH を使用して pH を 7.40 に調整します。2 2 2その後、1,000 mL、0.22 μm、真空フィルター/ストレージシステムを使用して溶液をフィルターし、一晩4°Cで保管します。
- 心肢麻痺溶液の4 Lを準備します。
- 1 Lの心肢麻痺溶液の場合、110 mM NaCl(6.43 g)、1.2 mM CaCl 2(1.2 mLの1 M溶液)、16 mM KCl(1.19 g)、16 mM MgCl2(3.25 g)、10 mM NaHCO3(0.84 g)、1U/mLヘリンを混合する 最大 1 L の ddH2O. NaOH を使用して pH を 7.40 に調整します。2その後、1,000 mL、0.22 μm、真空フィルター/ストレージシステムを使用して溶液をフィルターし、一晩4°Cで保管します。
注:スライスの日にカーディオプレギア溶液に1,000 U/Lヘパリンを加えます(ステップ2.1を参照)。
- 1 Lの心肢麻痺溶液の場合、110 mM NaCl(6.43 g)、1.2 mM CaCl 2(1.2 mLの1 M溶液)、16 mM KCl(1.19 g)、16 mM MgCl2(3.25 g)、10 mM NaHCO3(0.84 g)、1U/mLヘリンを混合する 最大 1 L の ddH2O. NaOH を使用して pH を 7.40 に調整します。2その後、1,000 mL、0.22 μm、真空フィルター/ストレージシステムを使用して溶液をフィルターし、一晩4°Cで保管します。
- バイオセーフティキャビネットの元のボトルに500 mLの培養培地を新たに調製する:ミキシング培地199、1xインスリントランスフェリンセレン(ITS)サプリメント、10%胎児ウシ血清(FBS)、5 ng/mL血管内皮成長因子(VEGF)、10 ng/mL FGF-basic、および2x抗生物質抗ミコティックを混合する。フィルターは0.22 μm、真空フィルター/貯蔵システムを通して殺菌し、4 °Cの一晩で貯える。
注:pHを調整しないでください, VEGFとFGFを使用する前に新鮮に追加. - 4%寒天ゲルプレートを準備します。
- 滅菌したddH2Oを500mLの殺菌フラスコに200mL加えます。アガロースの重さ8gを、フラスコにそっと注ぎます。電子レンジで2分間沸騰させ、室温で5分間冷まします。
- バイオセーフティキャビネットに100mmのペトリ皿1個ずつ25mLを注ぎ(6皿を用意)し、固めるのを1時間待ちます。その後、パラフィンフィルムでプレートを密封し、きれいなラップで包み、4°Cで保存します。
- オートクレーブddH2Oで200プルーフ絶対エタノールを希釈して4Lの70%エタノールを調製した。
- 殺菌されたddH2Oで2倍の抗生物質抗抗抗抗抗抗薬を準備する:バイオセーフティキャビネットの下で抗生物質抗抗抗毒素の20 mLと滅菌ddH2Oの980 mLを混合する。
2. 豚の心臓灌流
- 1,000 U/mLヘパリンを1Lずつ加えて、心肢麻痺溶液を1Lずつ加えます。氷の上にソリューションを保ちます。
注:組織培養室への移送中に心臓の灌流および保存のために少なくとも3Lが必要である。 - 次のアイテムを豚の手術室に持って行く:氷でいっぱいの1つの大きなアイスバケツ、1つの滅菌された金属トレイ(心臓灌流のためにアイスバケツに保管する)、1つの滅菌された500 mL瓶、1つの1つのL瓶(心プレギア溶液中の心臓を組織培養室に戻す)、氷の上)、氷でいっぱいの1つの殺菌プラスチックトレイ(氷の上に心肢溶液を保つために)。
- 3ウェイストップコック、60 mLシリンジ、18Gバタフライニードルカテーテル、および心肢麻痺溶液貯留層への延長チューブを含む、その場での心臓灌流システムを準備します。
- 最初にケタミン(20mg/kg)/キシラジン(2mg/kg)カクテルの筋肉内注射でヨークシャーの雄豚(2-3ヶ月、20-25キロ)を麻酔します。顎の緊張の喪失によって適切な麻酔を確認する。次いで、このブタを手術室に移し、前述の14のように肺を挿管し、機械的に換気する。
- 麻酔を維持する(1.5-2%)イソフルラン。
- 動物を右横の位置に置き、胸部から毛皮を剃ります。アルコールスクラブで皮膚をきれいにし、10%(w/v)ポビドネ-ヨウ素溶液で外科部位を殺菌します。
- 4番目の肋間空間でメスを使用して左胸部切開によって胸を開き、胸部を開いて心臓を露出させるために肋骨の間に胸のレトラクターを使用する。
注:この手順では、すべての滅菌器具を使用してください。 - 左心房に蝶の針カテーテルを挿入し、財布のひも閉鎖で針を固定します。ヘパリンのボーラス用量(100 U/kg)の静脈内注射後、左心房カテーテルを介して500mLの氷冷心肢麻痺溶液(心拍数を遅くする)で心臓をその部位に浸透させ始める。
- 5%のイオブルランで豚を深く麻酔します。心臓を手術用ハサミで胸から素早く切除する。大動脈を大動脈カニューレでカンニューテレートし、血管系血液を洗い流すために、別の1 Lの氷冷心肢溶液(100 mL/分)をインビトロで穿孔します。
- 心臓灌流後、氷冷心プレギア溶液で満たされた1Lジャーに心臓を保管し、組織培養室への移送中に氷の上に保管します。
3. 豚の心臓組織スライス
- ビブラートメにティッシュバスを設置し、組織バス冷却ジャケットに氷を加え、タイロードの溶液をティッシュバスに加えます。1 Lプラスチック瓶を設置して、組織バス冷却ジャケットから溶けた氷の処分を収集します。
- バイオセーフティキャビネットの下で、豚の心臓を新鮮な冷たい心肢麻痺溶液の1 Lを含むトレイに移します。
- 引き込み式の無菌メスを使用して左心室を分離するために心臓を解剖する。次に、カミソリの長方形ブレードを使用して、左心3室を1〜2cm3のブロックに切ります。スライスに1個を使用し、必要に応じて後で切断するために氷の上に冷たいタイロードの溶液で50 mLチューブに残りの部分を保ちます。
注:特にこれが2番目のブロックである場合は、手でスライスする前に組織をマッサージします。マッサージは、正しい筋線維の構成を復元するのに役立ち、心臓ブロック内の剛性を防ぎます. - 金属サンプルホルダーにティッシュグルー(材料表)の1-2滴を加え、4%寒天ブロックの一部を約1cm 2の表面積で貼り付けます。
- 寒天にティッシュ接着剤を1~2滴加えます。
- 心臓心気道側を下側に向けて寒天に心臓ブロックを貼り付け、可能な限り平らであることを確認します。次いで、心臓ブロックを有する組織ホルダーをビブラートのスライス浴内のその位置に移す。
- スライス浴に酸素チューブを取り付け、スライス(酸素化タイロードのお風呂)を収集するためのタイロードの溶液で満たされた金属トレイを取り付けます。次に、金属トレイに40μmのセルストレーナーを加え、切った後にスライスを収集します。
- スライス位置の調整
- ビブラートメの操作ソフトウェアとダッシュボードを使用して、ブレード/サンプルの高さを調整します。高さボタンを選択し、画面の指示に従って高さを調整します。理想的には、ブレードを組織の上部に近いが、乳頭筋の下に持っており、スライスする前に組織とブレードを覆う液体があることを確認してください。
- 事前ボタンを選択して、組織のスライスを開始する場所を調整します。スライスボタンを押し、ノブを使用して速度を上げ、ブレードをティッシュの端に向かって動かします。スライスをもう一度押して停止し、進むボタンを押してプロセスを無効にします。
- 切削パラメータを調整します:前進速度= 0.03 mm/s、振動周波数= 80 Hz、水平振動振幅= 2 mm。スライスボタンを選択してスライスを開始します。
- ビブラートメは組織の端に達するまでスライスしますが、標本ホルダーのバックエンドに当たる前に行います。この時点で、スライスをもう一度押して停止します。[戻る] ボタンを押して、開始位置に戻ります。
- 自動繰り返し(2回クリック)を選択すると、振動マイクロトームがスライスプロセスを最大99回自動的に繰り返します。
- スライスの収集
- スライスが完全な長さになるまで待って、(乳頭筋層を過ぎた後)良く見える、その後、スライスの収集を開始します。
- 冷たいタイロードの溶液で満たされたプラスチック製のパスツールピペットを使用してスライスを収集し、お風呂から組織をそっとつかみます。必要に応じて、鉗子とスプリングハサミを使用して、組織がまだ取り付けられている場合は、心臓ブロックからスライスを解離します。
- 酸素化されたタイローデの浴槽の1つの細胞ストレーナーにスライスを移し(ステップ3.7を参照)、プラスチック製のパスツールピペットの液体を使用して、細胞ストレーナーの1つに平らに横たわる組織を取得し、上部に金属ワッシャーを追加して組織を押さえます。
注:スライスは、処理する前に少なくとも1時間タイロードの溶液中でインキュベートする必要があります(これはBDMが組織をリラックスさせるためです)。
4. 心臓スライスの培養
-
文化用のスライスの準備
- エッジが不均等にならないように、エッジからスライスをトリムします。次に、ティッシュ接着剤を使用して埋め込まれた金属線と滅菌ポリウレタン6ミリメートル幅のプリンタータイミングベルトに両端からそれを接着します。
- 各ウェルに6 mLの培養培地を含む6ウェルプレートにサポートされた心臓スライスを移します。
- 6ウェルプレートの上部に刺激プレートカバー(材料表)を置き、細胞培養電気刺激装置(材料表)にカバーを接続します。刺激装置を調整して、心臓スライスを10 V、1.2Hzで連続的に常に電気的に刺激します。
注:刺激を差し込んだ後、心臓のスライスが拍動し始め、この動きは視覚的に明白になります。 - プレートをインキュベーターに移し、加湿空気と5%CO2で37°Cに保ちます。
- 培地を1日あたり3倍ずつ変え、培地交換の際にはウェル当たり6mLの培養培地を添加する。
注:培地は、各培地交換の前に5分間酸素化される。媒体は1日に少なくとも1倍変更する必要があります。これは、必要に応じて週末に大丈夫です。1 日あたり 1 つのメディア変更のうち 2 日間がテストされる最大値です。 -
刺激プレートカバーを毎日変更して、培養培地中の有毒な黒鉛粒子の放出を防ぎます(通常、昼間の培地交換中)。
- 培養皿から刺激板カバーを取り外し、カバーが電気刺激装置用のケーブルに接続する白い泡プラグを挿入して、電気回路への水害を防ぎます。
- 2倍の抗生物質抗ミキティックでオートクレーブ水の浴にプレートカバーを置きます。このお風呂(つまり、すす風呂)に一晩保管してください。
- 翌日、プレートカバーを70%エタノール浴に入れ、5〜15分間除染します。お風呂を切り替える前に、デバイスからできるだけ多くの液体を振り払ってください。
- 次いで、プレートカバーを第3の最終浴(すなわち、クリーンバス)に移し、オートクレーブ水と2倍の抗菌抗菌性からなる、残りのエタノールの痕跡をすすいすぐるむ。
- きれいな浴室でプレートカバーをすすった後、きれいな糸口のないワイプ(エタノールでスプレー)を使用してプラスチック部品の残留水を乾燥させ、白い泡片を取り除き、慎重にプレートカバーを培養プレートに戻します。
注:装置がもはや無菌ではなくなるので、井戸に入る黒い黒鉛電極に触れないでください。 - 滅菌鉗子を使用して、プレートカバーが組織に触れないように、組織が井戸の中央にあることを確認してください。プレートカバーの湾曲した側がプレートの角度付き側と一致し、四角いコーナーが並っていることを確認します。
注:刺激プレートカバーの汚染を最小限に抑えるために、実験を終えた後、清潔で空の6ウェルプレートに保管してください。
- 新鮮な豚の心臓スライス(0日目)にMTTアッセイ、カルシウム測定および収縮機能評価を行い、6日後に培養後にOu et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
一度に8つの6つのウェルプレートを収容できる市販の細胞培養電気刺激剤を用いて、生理学的頻度(1.2Hz)で電気刺激を誘発して成体心臓ミリューをエミュレートし、培養13における機能的な豚心のスライスの持続時間を延長する基本的な培地成分についてスクリーニングした。豚と人間の心臓は大きさと解剖学15が似ているため、豚の心臓を用いた生態性心スライス培養システムを開発し、その後、人間の心臓スライスで検証しました。ここでは、人間の心臓のスライスと培養と同じ手順である豚の心臓スライスのプロトコルを詳述しました。ここで説明する新しいバイオミメティック培養のセットアップは、MTTアッセイによって評価された6日間の豚の心臓スライスの生存率を維持した(図1A)。我々は、カルシウム恒常性および収縮力を評価することによって、6日間にわたるこれらのスライスの機能的生存率を確認した。最初の6日間は、心筋細胞に自発的なカルシウム過渡症がなく、心筋細胞は新鮮な心臓スライスと同様の外部電気刺激とβアドレナリン刺激に反応した(図1B)。さらに、イソプロテレノールに対する収縮力および応答は、新鮮な心臓スライスと同様に、培養された心臓スライスで最大6日間維持される(図1C,D)。
図1:豚の心臓スライス文化の生存率と機能性の検証。(A)最適化された培地での刺激または非刺激培養系でMTTアッセイを使用した経時の心臓スライスの生存率の定量化(n = 3重化中の豚の心臓はそれぞれ5匹、SEMは誤差棒として表され、二方ANOVA試験はグループ間で比較するために実施された、*p<0.05)。(B)新鮮な心臓スライス(0日目)および培養6日目(6日目)からの代表的なカルシウムシグナルトレース(6日目)を1μMイソプロテレノール(Iso)刺激の有無にかかわらず。トランジェントは、心臓スライスをFluo-4カルシウム色素でロードし、記録時に1 Hz/20 Vの電気刺激を使用した後に記録された。イソプロテレノールによる刺激の有無にかかわらずカルシウムシグナル振幅の定量化は、培養で0日目と6日目のカルシウム過渡症の同様のパターンを示す(n= 4豚の心臓、 それぞれ10-15セルを分析し、SEMは誤差範囲として表され、2方向ANOVA試験はグループ間で比較するために行われ、*p<0.05はベースラインと同じ時点での等方刺激を比較し、p値D0対D6 = 0.95、p値D0 Iso対D6 Iso = 0.93を比較した。(C)収縮力評価設定(左パネル);心のスライス(HS)は電気刺激のための2つの電気電極(EE)の間の力のトランスデューサ(FT)と安定したポスト(P)の間に掛けられる。刺激時に、スライスの収縮と収縮は、指定されたソフトウェア(右パネル)を使用して記録されます。(D)棒グラフは、新鮮な豚の心臓スライス(0日目)によって生成されたイソプロテレノール(Iso)の有無およびバイオミメティック培養(n=4豚の心臓それぞれ3倍)での収縮力の定量を示し、 SEMは誤差範囲として表され、グループ間で比較するために双方向ANOVA検定が行われ、*p<0.05はベースラインと同じ時点での等方刺激と比較し、twitch force:p値D0対D6 = 0.96、p値D0 Iso対D6 Iso= 0.81;時間から50%緩和:p値D0 対 D6 = 0.47、p 値D0 Iso 対 D6 Iso = 0.43)。この図は、Ouら13から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 条件 | フィッシャーら16 | オウ・エ・アル13 |
| 種 | 人間 | 豚と人間 |
| 病気 | 失敗した心 | 正常な健康な心 |
| 保存 | 保存されたティッシュ | 新鮮なティッシュ |
| スライスの厚さ | 300 μm | 300 μm |
| 中酸素化 | いいえ | インターミッタ酸素化 |
| 培養培地 | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| 攪拌 | はい | いいえ |
| ペーシングレート | 0.2 Hz | 1.2 Hz |
| カルチャの期間 | 妥協して4ヶ月 | 妥協のない6日間 |
| カチュール温度 | 37 | 37 |
| 機械式ローディング | オーキストニックローディング | ローディングなし |
| 新鮮な心臓スライスと比較して遺伝子発現に変化のないテストされたタイムポイント | N/a | 2日と6日 |
| 遺伝子発現の変化を示す最初のテストされたタイムポイント | 8日目 | 10日目 |
表1:フィッシャーら16とOuら13で使用されるスライスと培養条件の比較。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、急性心毒性13をテストするのに十分な長さの期間の豚の心臓スライスの培養を可能にする簡略化された媒体スループット(最大48スライス/デバイス)の方法のための我々の最近公開された方法のための詳細なビデオプロトコルを説明する。提案された条件は、電気刺激の頻度、栄養素の可用性、および断続的な酸素化を含む心臓の環境を模倣する。私たちは、生物模倣刺激培養における心臓スライスの生存率の延長は、無傷の心臓が経験する生理学的状態を再現することに焦点を当てていると考えています。この概念は、電気刺激だけでは、必須栄養素を提供することなく、心臓スライスの生存率を維持するのに十分ではないことを示す我々のデータによって支持される。したがって、培養培地の新しい成分は、培養における心臓スライスの生存率および機能性を延長するための主要な原動力となる。我々は、生き生きとするために培地にFBSを含める必要があることを発見し、これは様々な脂肪酸、微量元素、酵素、タンパク質、高分子、化学成分、およびホルモンの様々な要件に起因する可能性が高く、これは通常血清中に存在し、生体内17で心臓組織に送達される。さらに、培養培地へのFGFおよびVEGFの添加は、組織の生存率を高めるために必要であることがわかった。FGFおよびVEGFは、培養内皮細胞18の維持に必須である血管新生因子として知られている。したがって、培養中の内皮細胞および結合組織を維持するためにFGFおよびVEGFが必要である可能性が高く、組織の生存率をサポートする。我々の研究は、心臓スライスを培養するために以前に報告された単純化された培養培地を変更する最初のものであり、その後の研究におけるメディア成分のさらなる最適化の可能性を開く。
我々の新しい方法では、バイオエンジニアリングシステム16、19、20,19,20における培養におけるスライスを維持する上で連続的な電気機械刺激の重要性を実証した3つの研究が他の3つの研究であった。しかし、これらの研究は、心臓スライスの代謝ニーズを維持するのに十分ではない基礎M199/ITS培地を使用しました。これは、スライスの収縮性とカルシウム恒常性の初期の培養16、,19、,20の間にいくつかの妥協につながった。Qiaoら19は、心臓スライスの電気生理学的特性を4日間維持できる高度に洗練されたバイオエンジニアリングチップを開発したが、収縮機能の評価は提供されなかった。Watsonら20は、24時間の心筋特性の維持のための拡張期サルコメア長さの重要性を実証するために、低スループット培養システム(最大4つのスライス/デバイスを処理)をバイオエンジニアリングした。最後に、Fischerら.16は、0.2Hzの刺激、オーキストニックローディングおよび培地攪拌の下で培養された場合、ヒト心臓スライスの障害を最大4ヶ月間インビトロで維持できることを示している。しかし、これらの条件は、それらのRNAEqデータに反映されるように、心臓スライスの様々な変化を誘発し、これは早期に初回評価時点(8日目)16の心臓遺伝子発現の10倍以上のダウンレギュレーションを示した。しかし、我々の最適化された培養系では、2日および5つの転写物のみが、それぞれ新鮮な心臓組織と比較して培養で2日および6日後に有意に差異的に発現した。しかし、培養10日後、500以上の転写物の発現に有意な変化があった。培養で10日後のダウンレギュレートされた遺伝子は主に心筋に関連し、アップレギュレートされた遺伝子は線維芽細胞、細胞外マトリックス、および炎症13に関連していた。表1は、フィッシャーら16とOuet13の間のスライスおよび培養プロトコルの完全な比較を示す。したがって、当社のバイオミメティック刺激培養システムは、心臓が経験する制御可能な状態をその場でエミュレートし、したがって、急性の心臓毒性または有効性に関する薬物治療の機能的および構造的結果の信頼性の高い読み出しを提供すべきである。
この培養システムの主な制限の1つは、我々の培養システムは、いくつかの生理的条件をエミュレートすることができるが、それは心臓収縮周期の間に機械的負荷およびせん断応力の変化を模倣することができないということです。生理学的および代謝因子のさらなる最適化は、心臓スライスの生存率と機能を延長するのに役立つ可能性があります。さらに、我々は、心臓スライス生存率13の悪化を促す酸化リン酸化の減少につながる早期の適応に気づいた。残念ながら、今のところ酸化リン酸化を維持するための最適な方法を特定できませんでした。心臓スライス中の脂肪酸代謝を高めることは、成長培地に脂肪酸を添加するほど単純ではなく、さらなる最適化が必要であり、今後の研究で取り組むことができる可能性があります。さらに、このアプローチの一般的な弱点は、心電図および心室性不整脈の中断を実証するために不可欠である心臓スライス内の単一心筋細胞の行動電位の欠落測定である。したがって、心電図の中断を誘発する心筋細胞による治療後に心臓のスライスから単一の心筋細胞を分離し、単離された心筋細胞に対する作用電位に対する効果を評価するプロトコルを最適化する必要がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAMはテナヤ・セラピューティクスの株式を保有しています。他の著者は競合を報告しません。
Acknowledgments
TMAMはNIH助成金P30GM127607およびアメリカ心臓協会助成金16SDG29950012によってサポートされています。RB は P01HL78825 および UM1HL113530 でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al.
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
