تشريح وزراعة قلوب الخنازير في ظل الظروف الفسيولوجية
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية تقطيع أنسجة القلب واستزراعها في ظل ظروف فسيولوجية لمدة 6 أيام. يمكن استخدام هذا النظام الثقافي كمنصة لاختبار فعالية علاجات فشل القلب الجديدة وكذلك الاختبار الموثوق به للسمية القلبية الحادة في نموذج القلب ثلاثي الأبعاد.
Abstract
العديد من الأدوية الجديدة تفشل في الدراسات السريرية بسبب الآثار الجانبية السامة للقلب كما تتوفر حاليا في المقالات المختبرية وفي نماذج الحيوانات على الجسم الحي التنبؤ بشكل سيئ التزامات القلب البشري, تشكل عبئا بمليارات الدولارات على صناعة الأدوية. وبالتالي، هناك حاجة طبية غير ملباة في جميع أنحاء العالم إلى نهج أفضل لتحديد سمية القلب الدوائية قبل إجراء تجارب مكلفة وتستغرق وقتاطويلا “أولا في الإنسان”. حاليا، يتم استخدام خلايا القلب غير ناضجة فقط (الإنسان المستحث ة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من القلب [hiPSC-CMs]) لاختبار الكفاءة العلاجية وسمية المخدرات لأنها الخلايا القلبية البشرية الوحيدة التي يمكن استزراعها لفترات طويلة مطلوب لاختبار فعالية الدواء والسمية. ومع ذلك، لا يمكن لنوع خلية واحدة تكرار النمط الظاهري لأنسجة القلب 3D المعقدة التي تتشكل من أنواع خلايا متعددة. والأهم من ذلك، يجب اختبار تأثير الأدوية على خلايا القلب البالغة، التي لها خصائص مختلفة واستجابات سمية مقارنة بـ hiPSC-CMs غير الناضجة. توفر هذه التقنية الوصول إلى نظام كامل متعدد الخلايا يحاكي أنسجة القلب البشرية ويعكس الظروف الفسيولوجية أو المرضية لعضلة القلب البشرية. في الآونة الأخيرة ، من خلال تحسين مكونات وسائل الإعلام الثقافية وظروف الثقافة لتشمل التحفيز الكهربائي المستمر في 1.2 هرتز والأوكسجين المتقطع للوسيط الثقافي ، قمنا بتطوير إعداد نظام ثقافة جديد يحافظ على قابلية البقاء وظائف الإنسان والخنازير شرائح القلب لمدة 6 أيام في الثقافة. في البروتوكول الحالي، نحن نفصّل طريقة تقطيع وزراعة قلب الخنزير كمثال. يستخدم نفس البروتوكول لثقافة شرائح من قلوب الإنسان أو الكلب أو الأغنام أو القطط. هذا النظام الثقافي لديه القدرة على أن يصبح الإنسان التنبؤية قوية في الموقع لاختبار السمية القلبية الحادة التي تسد الفجوة بين نتائج الاختبار قبل السريرية والسريرية.
Introduction
السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي سبب رئيسي لانسحاب السوق1. في العقد الأخير منالقرن العشرين، تم سحب ثمانية أدوية غير قلبية وعائية من السوق لأنها أدت إلى الوفاة المفاجئة بسبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي العديد من العلاجات المضادة للسرطان (في حين أنها فعالة في كثير من الحالات) إلى العديد من الآثار السامة للقلب بما في ذلك اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي كل من العلاجات التقليدية (مثل الجمرة الخبيثة والإشعاع) والمستهدفة (على سبيل المثال، trastuzumab) علاجات سرطان الثدي إلى مضاعفات القلب والأوعية الدموية في مجموعة فرعية من المرضى3. وقد ساعد التعاون الوثيق بين أطباء القلب وأطباء الأورام (عبر المجال الناشئ من “أمراض القلب والأورام”) على جعل هذه المضاعفات قابلة للإدارة لضمان أن المرضى يمكن علاجهم بفعالية2. أقل وضوحا هي آثار القلب والأوعية الدموية من العوامل الأحدث، بما في ذلك مثبطات Her2 و PI3K، وخاصة عندما يتم استخدام العلاجات في تركيبة. لذلك، هناك حاجة متزايدة لاستراتيجيات فحص موثوق بها قبل السريرية لسمية القلب والأوعية الدموية المرتبطة بالعلاجات الناشئة المضادة للسرطان قبل التجارب السريرية البشرية. عدم توافر نظم الثقافة لأنسجة القلب البشرية التي هي قابلة للحياة وظيفيا وهيكليا لأكثر من 24 ساعة هو عامل يحد من اختبار السمية القلبية موثوق بها. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير نظام موثوق به لزراعة أنسجة القلب البشرية في ظل ظروف فسيولوجية لاختبار سمية الدواء.
وقد وفر التحرك الأخير نحو استخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان حلاً جزئياً لمعالجة هذه المسألة؛ ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير الناضجة لhiPSC-CMs وفقدان سلامة الأنسجة مقارنة بالطبيعة متعددة الخلايا لأنسجة القلب هي قيود رئيسية لهذه التكنولوجيا4. وقد تغلبت دراسة حديثة جزئيا هذا القيد من خلال تصنيع أنسجة القلب من hiPSC-CMs على hydrogels وإخضاعها لزيادة تدريجية في التحفيز الكهربائي مع مرور الوقت5. ومع ذلك ، لم تحقق خصائصها الكهروميكانيكية النضج الذي شوهد في عضلة القلب البشرية البالغة. وعلاوة على ذلك، أنسجة القلب هو أكثر تعقيدا من الناحية الهيكلية، ويجري تتألف من أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الانبهية والخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا الليفية سترومال مرتبطة جنبا إلى جنب مع خليط محدد جدا من البروتينات مصفوفة خارج الخلية6. هذا التغاير من السكان خلية غير cardiomyocyte7,8,9 في قلب الثدييات الكبار هو عقبة رئيسية في نمذجة أنسجة القلب باستخدام أنواع الخلايا الفردية. هذه القيود الرئيسية تسليط الضوء على أهمية تطوير أساليب لتمكين زراعة الأنسجة القلبية سليمة للدراسات المثلى التي تنطوي على الحالات الفسيولوجية والمرضية للقلب5.
زراعة شرائح القلب البشري هو نموذج واعد من عضلة القلب البشرية سليمة. توفر هذه التقنية الوصول إلى نظام كامل متعدد الخلايا ثلاثي الأبعاد يشبه أنسجة القلب البشرية التي يمكن أن تعكس بشكل موثوق الظروف الفسيولوجية أو المرضية لعضلة القلب البشرية. ومع ذلك ، فقد تم تقييد استخدامه بشدة بسبب فترة قصيرة من الجدوى في الثقافة ، والتي لا تتجاوز 24 ساعة باستخدام أقوى البروتوكولات المبلغ عنها حتى عام 201810،11،12. ويرجع هذا القيد إلى عوامل متعددة بما في ذلك استخدام واجهة الهواء والسائل لثقافة الشرائح ، واستخدام وسيلة الثقافة البسيطة التي لا تدعم المطالب النشطة العالية للأنسجة القلبية. لقد قمنا مؤخرا بتطوير نظام الثقافة المغمورة التي هي قادرة على توفير التحفيز الكهربائي المستمر وتحسين مكونات وسائل الإعلام الثقافة للحفاظ على شرائح الأنسجة القلبية قابلة للحياة لمدة تصل إلى 6 أيام13. هذا النظام الثقافي لديه القدرة على أن يصبح الإنسان التنبؤية قوية في الموقع لاختبار السمية القلبية الحادة لسد الفجوة بين نتائج الاختبار قبل السريرية والسريرية. في المقالة الحالية ، ونحن تفاصيل بروتوكول لتقطيع وزراعة شرائح القلب باستخدام قلب الخنزير كمثال. يتم تطبيق نفس العملية على قلوب الإنسان أو الكلب أو الأغنام أو القطط. مع هذا البروتوكول، ونحن نأمل في نشر التكنولوجيا إلى مختبرات أخرى في المجتمع العلمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن وصف بروتوكول الفيديو مفصلة لطريقتنا نشرت مؤخرا لإنتاجية متوسطة مبسطة (عمليات تصل إلى 48 شرائح / جهاز) الأسلوب الذي يتيح ثقافة شرائح قلب الخنزير لفترة طويلة بما فيه الكفاية لاختبار سمية القلب الحادة13. تحاكي الظروف المقترحة بيئة القلب، بما في ذلك تواتر التحفيز الكهربائي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم TMAM من قبل المعاهد القومية للصحة منحة P30GM127607 وجمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG29950012. ويدعم RB من قبل P01HL78825 وUM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
