Summary
Vi rapporterer anvendelsen av kvantitativkromosomkonformasjonsfangst etterfulgt av sekvensering med høy gjennomstrømning i embryoide legemer generert fra embryonale stamceller. Denne teknikken gjør det mulig å identifisere og kvantat kontaktene mellom putative enhancers og promotor regioner av et gitt gen under embryonale stamcelledifferensiering.
Abstract
Under pattedyrutvikling bestemmes celleskjebner gjennom etablering av regulatoriske nettverk som definerer spesifisitet, timing og romlige mønstre av genuttrykk. Embryoid organer (EBs) avledet fra pluripotente stamceller har vært en populær modell for å studere differensiering av de tre viktigste bakterielagene og å definere regulatoriske kretser under celle skjebne spesifikasjon. Selv om det er velkjent at vevsspesifikke enhancers spiller en viktig rolle i disse nettverkene ved å samhandle med arrangører, tildele dem til sine relevante målgener fortsatt er utfordrende. For å gjøre dette mulig, er kvantitative tilnærminger nødvendig for å studere enhancer-promoter kontakter og deres dynamikk under utvikling. Her tilpasset vi en 4C-metode for å definere enhancers og deres kontakter med cognate arrangører i EB differensieringsmodellen. Metoden bruker ofte kutte begrensning enzymer, sonikering, og en nestet-ligation-mediert PCR protokoll kompatibel med kommersielle DNA bibliotek forberedelse kits. Deretter blir 4C-bibliotekene utsatt for sekvensering med høy gjennomstrømning og analysert bioinformatically, slik at deteksjon og kvantifisering av alle sekvenser som har kontakter med en valgt arrangør. De resulterende sekvenseringsdataene kan også brukes til å få informasjon om dynamikken i enhancer-promoter kontakter under differensiering. Teknikken som er beskrevet for EB-differensieringsmodellen er enkel å implementere.
Introduction
Hos mus inneholder den indre cellemassen (ICM) av 3,5-dagers gamle embryoer embryonale pluripotente stamceller. ICM utvikler seg videre til epiblasten på dag 4.5, genererer ektoderm, mesoderm og endoderm celler, de tre viktigste bakterielagene i embryoet. Selv om pluripotente celler i ICM eksisterer bare forbigående in vivo, kan de fanges i kultur ved etablering av mus embryonale stamceller (mESCs)1,2,3. MESCene forblir i en udifferensiert tilstand og sprer seg på ubestemt tid, men på iboende og extrinsic stimuli er de også i stand til å avslutte pluripotenstilstand og generere celler i de tre utviklingsbakterielag2,4. Interessant, når dyrket i suspensjon i små dråper, mESCs danner tredimensjonale aggregater (dvs. EBs) som skiller seg inn i alle tre bakterielag5. EB formasjonsanalysen er et viktig verktøy for å studere den tidlige avstamningsspesifikasjonsprosessen.
Under avstamningsspesifikasjonen får celler av hvert bakterielag et bestemt genuttrykksprogram4. Den presise spatiotemporal uttrykk for gener er regulert av ulike cis-regulatoriske elementer, inkludert kjerne arrangører, enhancers, lyddempere, og isolatorer6,,7,,8,9. Enhancers, regulatoriske DNA segmenter vanligvis spenner over noen hundre base par, koordinere vevsspesifikke genuttrykk8. Enhancers aktiveres eller dempes ved binding av transkripsjonsfaktorer og kofaktorer som regulerer lokal kromatinstruktur8,10. Vanlige teknikker for å identifisere antatte enhancers er genom-wide kromatin immunnedbør etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) og analysen for transposase-tilgjengelig kromatin ved hjelp av sekvensering (ATAC-seq) teknikker. Dermed er aktive enhancers preget av spesifikke aktive histone merker og av økt lokal DNA tilgjengelighet11,12,13,14. I tillegg antas utviklingsforsterkere å kreve fysisk interaksjon med deres cognate promoter8,9. Faktisk har det blitt vist at enhancer varianter og slettinger som forstyrrer enhancer-promoter kontakter kan føre til utviklingsmisdannelser15. Derfor er det behov for nye teknikker som gir ytterligere informasjon for identifisering av funksjonelle enhancers som styrer utviklingsgenuttrykk.
Siden utviklingen av kromosomkonformasjonsfangsten (3C) teknikk16, har kartleggingen av kromosomkontakter blitt intensivt brukt til å vurdere fysisk avstand mellom regulatoriske elementer. Viktigere, høy gjennomstrømning varianter av 3C teknikker har nylig blitt utviklet, og gir ulike strategier for fiksering, fordøyelse, ligation, og gjenoppretting av kontakter mellom kromatin fragmenter17. Blant dem har in situ Hi-C blitt en populær teknikk som tillater sekvensering av 3C ligation produkter genom-wide18. Imidlertid gjør de høye sekvenseringskostnadene som kreves for å nå en oppløsning som er egnet for analyse av enhancer-promoter kontakter denne teknikken upraktisk for studiet av spesifikk loci. Derfor ble det utviklet alternative metoder for å analysere målrettet loci ved høyere oppløsning19,20,21,22. En av disse metodene, nemlig 4C, kjent som en versus all strategi, tillater påvisning av alle sekvenser som kontakter et område valgt som synspunkt. En ulempe med standard 4C-teknikken er imidlertid den inverse PCR som kreves, noe som forsterker forskjellige størrelsefragmenter, favoriserer små produkter og biasing quantification etter høy gjennomstrømning sekvensering. Nylig har UMI-4C, en ny variant av 4C-teknikken ved hjelp av unike molekylære identifikatorer (UMI) blitt utviklet for kvantitativ og målrettet kromosomkontaktprofilering som omgår dette problemet23. Denne tilnærmingen bruker hyppige kuttere, sonikering og en nestet-ligation-mediert PCR-protokoll, og involverer dermed forsterkning av DNA-fragmenter med relativt jevn lengdefordeling. Denne homogeniteten reduserer skjevheter i forsterkningsprosessen av PCR-preferanser for kortere sekvenser og gir effektiv gjenoppretting og nøyaktig telling av romlig tilkoblede molekyler / fragmenter.
Her beskriver vi en protokoll som tilpasser UMI-4C-teknikken for å identifisere og kvantifisere kromatinkontakter mellom arrangører og enhancers av slektslærende transkripsjonsfaktorer under EB-differensiering.
Protocol
1. Embryoid kroppsgenerering fra mus embryonale stamceller
- Forbered mESC serumfritt kulturmedium: DMEM/F12 og neurobasal medium blandet med et forhold på 1:1. Kulturmediet suppleres med MEM ikke-essensielle aminosyrer oppløsning (1x), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 E / ml), beta-mercaptoetanol (50 μM), N2 og B27 kosttilskudd (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM) og leukemihemmende faktor (LIF) (1000 U/ml).
- Forbered EB differensieringmedium: DMEM supplert med 10% føtal storfe serum (FBS), MEM ikke-essensielle aminosyrer (1x), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 U / ml), beta-mercaptoetanol (50 μM).
- Kultur mESCs på 10 cm plastretter precoated med 0,1% (w / v) gelatin i mESC kultur serum-fritt medium.
- Når mESCs nå 60% samløpet, fjern kultur medium og vask forsiktig 1x med 2 ml sterilisert PBS.
- Fjern PBS helt og legg til 2 ml celleavløsningsmedium. Inkuber kulturretten ved 37 °C i 5 min.
- Inaktiver reaksjonen ved å legge til 8 ml EB-differensieringsmedium i parabolen.
- Dissosiere mESC kolonier ved pipettering opp og ned 15-20 ganger for å få en encellede suspensjon.
- Sentrifugercellene ved 300 x g ved romtemperatur (RT) i 5 min og fjern forsiktig supernatanten.
- Telle celler (f.eks. ved hjelp av et hemocytometer).
- Resuspender cellepelleten igjen med EB-differensieringsmedium og juster konsentrasjonen til 2 x 104 celler/ml.
- Inverter lokket på en 15 cm kulturrett og bruk en 200 μL flerkanals pipette til å deponere 20 μL dråper resuspenderte celler (~ 400 celler / slipp) på lokket.
- Vend lokket forsiktig på bunnkammeret og inkuber parabolen med hengende dråper ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % fuktighet i 3 dager.
- Samle EBs ved å vaske lokket forsiktig med 10 ml PBS og overfør EB-holdig suspensjon til et 50 ml plastrør.
- Plasser røret på RT i 30 min, slik at EBs vil synke til bunnen av tyngdekraften. Fjern forsiktig supernatanten.
- Resuspender EBs forsiktig med 10 ml frisk EB differensiering medium og overføre til en 10 cm bakteriologisk Petri parabolen.
- Kontroller EB-formasjonen 3-6 dager senere med et omvendt mikroskop. EBs generert bør være rund og homogen i størrelse.
- Inkuber kulturene ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % fuktighet. EBs vil fortsette å differensiere i de tre bakterielagene og kan samles på ulike tidspunkter for analyse.
2. Dissosiasjon av EBs
- Samle EBs fra to til tre 10 cm retter i en 50 ml plastrør. Sentrifuge EBs på 300 x g på RT i 5 min, og fjern deretter supernatanten forsiktig.
- Resuspender EBs med 10 ml PBS. Sentrifuge-EBs på 300 x g på RT i 3 min og fjern supernatanten.
- Legg til 2 ml trypsin-EDTA (0,25 %) pellet og inkuberrøret ved 37 °C i 15 min. Pipette opp og ned hver 3.
- Tilsett 8 ml EB-differensieringsmedium for å stoppe trypsinreaksjonen. Sjekk EB dissosiasjon under mikroskopet og telle cellene.
3. Fiksering
- Resuspender cellene i frisk EB kultur medium på 1 x 106 celler / ml. For et 50 ml rør, bruk maksimalt 4,5 x 107 celler i 45 ml medium.
- Legg paraformaldehyd fra en 37% lager (ikke eldre enn 6 måneder) til en 1% endelig konsentrasjon.
FORSIKTIG: Følg egnede helse- og sikkerhetsforskrifter under håndtering av paraformaldehyd fordi det er et farlig kjemikalie. - Inkuber i 10 min ved RT under rotasjon.
- Slukke formaldehyd ved å legge glycin til en endelig konsentrasjon på 0,125 M.
- Inkuber i 5 min ved RT under rotasjon.
- Overfør de faste cellene til is og hold kaldt ved 4 °C fra nå av.
- Pellet cellene på 300 x g i 5 min i en nedkjølt sentrifuge.
- Kast supernatanten og resuspendpelleten i kalde PBS (1 ml for 5 x 106 celler), og overfør deretter til 1,5 ml sikker låsrør.
- Pellet cellene på 300 x g i 5 min ved 4 °C, kast supernatanten og trykk på pellets i flytende nitrogen. Oppbevares ved -80 °C eller fortsett med protokollen nedenfor.
4. Celle lysis og begrensning enzym fordøye
- Resuspender cellenpellet en forsiktig i 0,25 ml nylaget iskald lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA630 og 1x proteasehemmere) per 2-5 x 106 celler. Hvis du vil forberede 5 ml lysisbuffer, kan du se tabell 1.
- Inkuber cellene i 15 min på is.
- Sentrifuge ved 1000 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten og behold pelleten, som inneholder kjernene.
- Vask pelleted kjerner med 500 μL kald lysis buffer.
- Sett pelleten forsiktig i et 1,5 ml rør med 50 μL på 0,5 % SDS i 1x buffer 2, og inkuber deretter røret i en varmeblokk ved 62 °C i 10 min.
- Fjern rørene fra varmeblokken og tilsett 170 μL fordøyelsesbuffer som inneholder 25 μL 10% triton X-100 for å slukke SDS. Bland godt ved pipettering, unngå overdreven skumdannelse.
- Inkuber ved 37 °C i 15 min.
- Tilsett 25 μL fordøyelsesbuffer, bland ved å snu, og ta 8 μL som en ufordøyd kontroll. Oppbevar den ufordøyde kontrollprøven ved -20 °C. Tilsett 100 U MboI begrensningenzym (4 μL av en 25 U/μL lager) til de resterende kjernene og fordøye kromatinet i 2 timer ved 37 °C under rotasjon. Legg til en annen aliquot av 100 U av MboI og inkuber for ytterligere 2 timer.
- Tilsett ytterligere 100 U av MboI og inkuber under rotasjon over natten ved 37 °C.
- Neste dag, legg til ytterligere 100 U av MboI og inkuber for 3 t ved 37 °C under rotasjon.
- Ta 8 μL som en fordøyd kontrollprøve. De-crosslink fordøyd kontrollprøver og de ufordøyde kontrollprøvene fra trinn 4.8 ved å legge til 80 μL TE-buffer (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) og 10 μL proteinase K (10 mg/ml). Inkuber ved 65 °C i 1 t.
- Kjør 20 μL aliquots på en 0,6% gel for å sjekke fordøyelseseffektiviteten. Vellykkede fordøyelser viser for det meste fragmenter i 3.0-0.5 kb-området.
5. Nærhetligasjon og krysslinkreversering
- Inkuber de FoI-fordøyde prøvene ved 65 °C i en varmeblokk i 20 minutter for å inaktivere MboI, deretter avkjøles til RT.
- Sentrifugerrørene i 5 min ved 1000 x g ved RT, fjern supernatanten og løspelleten i 200 μL fersk ligasebuffer.
- Tilsett 1000 μL av ligation master mix til hver prøve. Hvis du vil forberede 1000 μL av ligation master mix, se tabell 2.
- Bland ved å invertere og inkubere ved RT over natten med langsom rotasjon (9 rpm).
- Eliminer RNA og proteinrester ved å tilsette 100 μL proteinase K (10 mg/ml) og 10 μL RNase A (10 mg/ml). Inkuber prøvene ved 55 °C i 45-60 min.
- Fortsett å ruge prøver ved 65 °C i ytterligere 4 timer.
6. DNA-klipping og størrelsesvalg
- Kule rør til RT.
- Sentrifuge i 5 min ved 1000 x g ved 4 °C.
- Del prøven i tre 400 μL aliquots i 2 ml rør og tilsett 2 μL glykogen (20 mg/m), 40 μL natriumacetat (3 M, pH = 5,2) og 2,5 x volumer (1 ml) av 100% etanol til hvert rør. Bland ved invertering og inkubasjon ved -80 °C i 45-60 min.
- Sentrifuge ved 16 000 x g ved 4 °C i 25 min. Hold rørene på is etter snurring og fjern forsiktig supernatanten ved pipettering.
- Vask DNA-pellets ved resuspending i 800 μL av 70% etanol. Sentrifuge ved 16 000 x g ved 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten og utfør vasken igjen med 800 μL av 70% etanol.
- Oppløs pelleten i 130 μL av 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) og inkuber ved 37 °C i 15 min for å oppløse DNA-et helt. Bruk eventuelt pipettering for å sette av ethvert utfelling.
- Mål DNA-utbyttet; 2,5-5 μg kromatin kan forventes for 1 x 106 celler. Kontroller ligasjonen ved å kjøre ± 200 ng av 3C-produktet på en 0,6% agarosegel. Vellykkede ligasjoner viser for det meste DNA-fragmenter > 3 kb. Oppbevar prøvene ved -20 °C.
- Fortynn en prøve i et 0,65 ml rør egnet for sonikering til 10 ng/μL i 100 μL 1x Tris buffervolum (1 μg per rør). Standardbeløpet som brukes til bibliotekforberedelse er 3 μg, så utfør sonikering i tre separate rør om nødvendig.
- Skjær DNA til en størrelse på 150-700 bp (gjennomsnitt = 400-500 bp) ved hjelp av følgende parametere på sonicator: Sykluser: 6-8 av 20 s på -60 s off. Dette bør gjøre DNA egnet for høy gjennomstrømning sekvensering bibliotek forberedelse ved hjelp av Illumina sequencers.
- Overfør det store DNA-et til et vanlig nytt safe-lock-rør. Pool flere sonikering fra samme prøve.
- Varm en flaske DNA renseperler på RT. Fra nå av bruker du lav bindingstips.
- Tilsett 1,8 x mengder perler i DNA-røret og resuspend forsiktig.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Samle perlene med et magnetisk stativ. Vask perlene 2x med 1 ml nylaget 80% etanol mens du holder rørene i det magnetiske stativet.
MERK: Fjern all etanol, inkludert gjenværende dråper. - Lufttørk perlene kort (2-3 min) ved RT.
MERK: Ikke tørk perlene lenger enn 5 min. Dette vil redusere DNA-utbyttet. - Resuspend perlene med 90 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for å elute DNA.
- Mål DNA-utbyttet og analyser en 5 μL aliquot på en 1,5% gel. Det bør være svært lite tap i forhold til presonication yield.
7. Bibliotekforberedelse for sekvensering
- Tilsett 15 μL mastermix fra bibliotekets forberedelsessett. For å reparere endene av betegnet DNA, kombinere 10 μL av 10x end reparasjon reaksjon buffer og 5 μL av end reparasjon enzym blanding.
- Inkuber ved RT i 30 min.
- Tilsett 1,1 x volum av DNA-renseperler og resuspender forsiktig.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Samle perlene med et magnetisk stativ. Vask perlene to ganger med 1 ml nylaget 80% etanol mens du holder rørene i det magnetiske stativet. Fjern etanol.
- Lufttørk perlene i 2-3 min ved RT. Resuspend perlene med 42 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for å elute DNA.
- Tilsett 8 μL dA-tailing master mix til hver prøve. For å forberede dA-tailing master mix, kombinere 5 μL av 10x dA-tailing reaksjonbuffer og 3 μL Klenow fragment exo minus.
- Inkuber ved 37 °C i 30 min.
- Tilsett 2 μL kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIP) for å avphosphorylate DNA.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C, deretter 60 min ved 50 °C.
- Tilsett 1,1 x volumer av DNA-renseperler og resuspender forsiktig.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Samle perlene med et magnetisk stativ. Vask perlene 2x med 1 ml nylaget 80% etanol mens du holder rørene i det magnetiske stativet.
- Lufttørk perlene kort (2-3 min) ved RT. Resuspend perlene med 35 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for å elute DNA.
- Utfør adapterligasjonsreaksjonen. Bruk reduserte adapter-/ligasekonsentrasjoner som nevnt i tabell 3.
- Inkuber ved 20 °C i 15 min.
- Tilsett 3 μL av blandingen av uracil DNA glycosylase og DNA glycosylase lyase endonuclease VII (f.eks. BRUKER) enzym, bland ved pipettering, og inkuber ved 37 °C i 15 min.
- Øk volumet til 100 μL med vann, kok 5 min ved 96 °C, og hold deretter prøvene på is.
- Tilsett 1,1 x volumer av DNA-renseperler og resuspender forsiktig.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Samle perlene med et magnetisk stativ. Vask perlene 2x med 1 ml nylaget 80% etanol mens du holder rørene i det magnetiske stativet.
- Lufttørk perlene i 2-3 min ved RT. Resuspend perlene med 50 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for å elute DNA.
8. 4C kromatin interaksjon bibliotek forsterkning og rensing
- Forsterk 4C-biblioteket ved hjelp av 10 μL bibliotek for å utføre det første PCR. PCR-oppsettet og -programmet finnes i tabell 4.
- Utfør nestet PCR. Det nestede PCR-oppsettet og -programmet finnes i tabell 5.
- Pool PCR produkter for hvert bibliotek og rense med en 1.1x DNA rensing perler.
- Mål DNA-utbytte og analyser en 5 μL aliquot på en 1,5% gel.
- Juster bibliotekkonsentrasjonen og sekvensbiblioteket. Hvis det indekseres, kan bibliotekene være samlet før sekvensering.
Representative Results
Seks dager etter induksjon av ESC-differensiering i hengende dråper, fikk vi en homogen populasjon av EB som ble brukt til ytterligere analyser (figur 1). Vi tilpasset UMI-4C-metoden23 for å kvantifisere spesifikk kromatininteraksjon hos arrangører av slektsspesifikke gener i EBs24. En skjematisk oversikt over protokollen med representative kvalitetskontrollgeler ved ulike trinn vises i figur 2A. Den første kvalitetskontrollen ble utført for å bestemme effektiviteten av MboI-begrensningenenzymfordøyelsen. Effektiv fordøyelse viste en fragmentstørrelse på mindre enn 3 kbp (figur 2B). Merk at mESC og EB-kromatinfordøyelsen var vanskelig og noen ganger gjenværende ufordøyd kromatin vedvarte. Den andre kvalitetskontrollen ble utført etter ligation for å bekrefte at de fleste fragmentene var nå > 3 kbp (figur 2B). Deretter ble kromatinfragmenter oppnådd etter sonikering analysert av gelelektroforese. Det var forventet fragmentstørrelser på 400-500 bp (figur 2B).
Etter avfonomylering og en-end adapter ligation, to runder av PCR ble utført for å forsterke målene av interesse. En nestet tilnærming ble brukt til å designe et sett med to primere for hver locus. Dette bidro til å forbedre spesifisiteten. Hvert mål ble forsterket separat med to forskjellige primerpar for å optimalisere PCR-forhold (dvs. primerpar A og B for Pou5f1 locus og primer par C og D for T locus, henholdsvis) og resulterte i et DNA smøre rundt 400 bp (Figur 2C). Multipleks PCR ble også utført for å forsterke mål A og C samtidig (Figur 2D) og resulterte i en lignende fragmentstørrelse etter rensing (figur 2D). Primere som brukes til 4C bibliotek forberedelse (loci av Pou5f1 og T)kan bli funnet i tabell 6.
For dataanalyse ble rå sekvenseringslesing først justert mot refence mm10 mus genomet, ble alle duplisert, og lav kvalitet (< 20) lesinger ble fjernet. For hver agn ble informasjonen om hvert begrensningsfragment oppnådd ved å beregne antall lesefragmenter, og en rå kontaktprofil ble innhentet. Deretter ble regionen av interesse definert som alle begrensningfragmenter med 2 kbp og 250 kbp avstand til agn. Størrelsen på hvert begrensningsfragment ble økt ved å aggregere de tilstøtende begrensningsfragmentene sekvensielt for å jevne ut profilene til en terskel på 5% av det totale antallet råkontakter ble nådd i regionen av interesse. For å sikre at replikerble integrert, og forholdene ble sammenlignet, inkluderte vi både bakker og tilfeldige avskjæringer på begrensningsfragmentnivået. Den gjennomsnittlige profilen per betingelse og foldeendringen mellom dem ble plottet som vist i figur 3. Under EB differensiering, kontaktene mellom enhancers og arrangøren av pluripotensgenet Pou5f1 redusert, mens enhancer-promotorer kontakter av mesendoderm avstamning lærerikt transkripsjonfaktor T økt (Figur 3), gir funksjonell innsikt om disse utviklingsenhancers.
Figur 1: Representative bilder av mESC og avledede embryoide kropper. Dag 0 mESC dyrket i serumfrie forhold (venstre) og homogen dag 6 EBs (høyre) observert av et invertert mikroskop. Skala bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 4C-arbeidsflyt og representative bilder av hovedtrinnene i protokollen. (A) Skjematisk arbeidsflyt av kvantitativ ec. RS = begrensning nettsted; US = oppstrøms; DS = nedstrøms; UP = universell primer; D = avstanden mellom RS og DS bør ideelt sett være 5-15 bp. (B) Eksempler på FoI-fordøyd kromatin (I), in-nuclei ligated kromatin (II) og sonikert kromatin (III). Tallene til venstre indikerer DNA-størrelsene som bestemmes av DNA-stigen, som går for hver prøve. (C) Eksempler på PCR forsterkning på de to loci: Pou5f1 (primers A og B) og T (primer C og D). (D) Eksempler på multipleks PCR forsterkning på Pou5f1 og T loci ved hjelp av primere A og C. ES = embryonale stamceller; EB = embryoid organer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på 4C-profiler. Kvantitative 4C-profiler for agn som ligger på Pou5f1- og T-genarrangørene som er analyset i mESCer og dag 6 EBS. Topppanelet viser plott av gjennomsnittlige kontakter generert fra to uavhengige biologiske replikater; bunnpanelet viser den gjennomsnittlige kontaktfoldendringen av Dag 6-EBer kontra mESCer (gjennomsnitt av de to replikaene). Lyseblå bokser indikerer plasseringen av enhancers med dynamiske endringer under differensiering. Figur tilpasset fra Tian et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| For 5ml | |
| 1M Tris-HCl, pH8.0 | 50 μL (50 μL) |
| 5M NaCl (andre er i seg selv) | 10 μL (10 μL) |
| 10% Igepal CA630 | 100 μL |
| 50x Roche komplette proteasehemmere | 100 μL |
| MilliQ Vann | 4,74 ml |
Tabell 1: Lysis buffer.
| For 1000μL | |
| MilliQ Vann | 869 μL (869 μL) |
| 10X NEB T4 DNA ligase buffer | 120 μL |
| 20mg/ml storfe serum albumin | 6 μL (andre er i sl) |
| 2000 U/μL T4 DNA Ligase | 5 μL (5 μL) |
Tabell 2: Ligation master mix forberedelse.
| For 15 μL | |
| 5x rask ligasjon reaksjonbuffer | 10 μL (10 μL) |
| NEBNeste adapter | 3 μL (andre er i sl) |
| Rask T4 DNA ligase | 2 μL (2 μL) |
Tabell 3: Reaksjon på adapterligasjon.
| PCR-oppsett | |
| Adaptor ligated bibliotek-on-deads | 10 μL (10 μL) |
| PCR-vann av klasse | 20,25 μL |
| 10 μM Målspesifikk primer | 3,75 μL |
| 10 μM NEB Indeks primer | 3,75 μL |
| Herculase II 5X buffer | 10 μL (10 μL) |
| 10 mm dNTPs | 1,25 μL |
| Herculase II polymerase | 1 μL (1 μL) |
| Totalt volum | 50 μL (50 μL) |
| PCR-program | |
| Trinn 1: 98 °C – 2 min | |
| Trinn 2: 98 °C - 20-årene | |
| Trinn 3: 65 °C - 30-tallet | |
| Trinn 4: 72 °C - 45s | |
| Trinn 5: gå til trinn 2 for å lage totalt 15-18 sykluser | |
| Trinn 6: 72 °C – 3 min | |
| Trinn 7: 4 °C – hold nede |
Tabell 4: 4C kromatin interaksjon bibliotek forsterkning, første PCR.
| Nestet PCR-oppsett | |
| DNA-fragment fra den første PCR | 10 μL (10 μL) |
| PCR-vann av klasse | 20,25 μL |
| 10 μM spesifikk primer+P5 Illumina primer | 3,75 μL |
| 10 μM P7 Illumina primer | 3,75 μL |
| Herculase II 5X buffer | 10 μL (10 μL) |
| 10 mm dNTPs | 1,25 μL |
| Herculase II polymerase | 1 μL (1 μL) |
| Totalt volum | 50 μL (50 μL) |
| Nestet PCR-program | |
| Trinn 1: 98 °C – 2 min | |
| Trinn 2: 98 °C - 20-årene | |
| Trinn 3: 65 °C - 30-tallet | |
| Trinn 4: 72 °C - 45s | |
| Trinn 5: gå til trinn 2 for å lage totalt 15-18 sykluser | |
| Trinn 6: 72 °C – 3 min | |
| Trinn 7: 4 °C – hold nede |
Tabell 5: 4C kromatin interaksjon bibliotek forsterkning, nestet PCR.
| navn | Sekvens (5'-3') |
| DS-Oct4-A (ds-okt4-a) | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG |
| USA-Oct4-A | TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC |
| DS-Oct4-B (DS-Oct4-B) | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT |
| USA-Oct4-B | ACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT |
| DS-T-C (Andre) | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC |
| Usa-T-C | Gattacacctgggtccctgcacattcgccaa |
| DS-T-D (DS-T-D) | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGGCTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG |
| Usa-T-D | Gctgaggctttggagaggtcaaggagacc (engelsk) |
| UP-4C (andre- og opp-4C- | Caagcagaagacggcatacga |
| Adap-i1 (andre vil si at det er | Caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttcaga CGTGTGCTCTTCCGATC (andre kan være på engelsk) |
| Adap-i2 (andre vil ha deg) | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC (andre kan være på engelsk) |
| Adap-i3 (andre vil si at i318) | Caagcagaagacggcatacgagatgcctaagtgactggagttcaga CGTGTGCTCTTCCGATC (andre kan være på engelsk) |
| Adap-i4 (andre vil ha deg) | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTGtGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC (andre kan være på engelsk) |
Tabell 6: Primerer som brukes til 4C-bibliotekforberedelse.
Discussion
Den hengende dråpekulturmetoden trenger ikke ytterligere vekstfaktorer eller cytokiner og genererer reproduserbare populasjoner av EB-er fra et forhåndsbestemt antall mESCer5. Her beskriver vi en protokoll av kvantitativ 4C tilpasset fra UMI-4C tilnærming for å kvantifisere enhancer-promoter kontakt av avstamning spesifikke transkripsjonsfaktorer i EB differensiering seruttmodellen. Vi identifiserte kromatinregioner som kontakter arrangører av Pou5f1- og T-gener på en dynamisk måte under EB-differensiering. Pou5f1 ble nedregulert under EB-differensiering og kontaktfrekvensen mellom Pou5f1-arrangøren og dens distale forsterker redusert. Omvendt ble T oppregulert under EB-differensiering, og vi identifiserte tre enhancers som kontaktfrekvenser med deres promotor er redusert (Figur 3). For å bekrefte identifikasjonen, kan en kromatin immunnedbør (ChIP) analyse av aktiv histone H3K27ac utføres24, da dette histonemerket har vist seg å være forbundet med enhancer aktivering og enhancers mister dette merket under deres inaktivering11.
En standard 4C-teknikk har blitt mye brukt til å kartlegge kromatinkontaktprofilen til bestemte genomiske steder25. Denne tilnærmingen er imidlertid vanskelig å tolke kvantitativt selv etter omfattende normalisering26,27,28 på grunn av skjevheter introdusert av heterogeniteten av PCR fragment størrelse og umuligheten til å skille PCR duplikater. Vår kvantitative 4C-metode er i stor grad identisk med UMI-4C-teknikken som gjør det mulig å kvantifisere enkeltmolekyler ved hjelp av sonikering og et nestet-ligation-mediert PCR-trinn for å omgå begrensningen av den klassiske 4C-tilnærmingen23. Men i motsetning til UMI-4C som bruker unike molekylære identifikatorer, tillater vår kvantitative 4C-protokoll kvantifisering av enkeltmolekyler basert på den spesifikke DNA-pausen produsert av sonikeringstrinnet. Det gjør vår protokoll kompatibel med kommersielle DNA-bibliotek forberedelse kits, obviating behovet for primere med unike molekylære identifikatorer.
Vår protokoll innebærer flere viktige trinn som bør vurderes. Som i den klassiske 4C-metoden28er kritiske faktorer i vår protokoll effektiviteten av fordøyelsen og ligasjonen under utarbeidelsen av 3C-molekylene. Lav fordøyelses-/ligasjonseffektivitet kan dramatisk redusere kompleksiteten i samspillet med et fragment av interesse, noe som resulterer i en redusert oppløsning. Som tidligere beskrevet23, et annet kritisk skritt i protokollen er utformingen av primere for biblioteket forsterkning. De andre PCR reaksjonprimere bør være plassert 5-15 nt fra det avhørte begrensningsstedet. I en 75 nt sekvensering lese, dette tillater minst 40 nt venstre for fangstlengde for kartlegging. Primeren som brukes i den første PCR-reaksjonen, bør utformes oppstrøms av den andre primeren uten overlapping, og begge bør være spesifikke nok til å sikre effektiv DNA-forsterkning. For multipleksing bør primere utformes uavhengig, med sikte på en smeltetemperatur (Tm) på 60-65 °C. Videre, som for andre 3C-teknikker, bestemmes oppløsningen av den kvantitative 4C-metoden av begrensningsenzymet som brukes i protokollen25. Denne protokollen bruker et begrensningsenzym med et 4 bp anerkjennelsessted, MboI. Maksimal oppløsning med dette enzymet er rundt 500 bp, men dette er svært locus avhengig og sjelden oppnådd. En annen begrensning er at samhandlinger som oppstår mellom elementer som ligger i samme begrensningsfragment, ikke kan oppdages. I tillegg kan interaksjoner som forekommer i en avstand på ett restriksjonssted ikke skilles fra den ufordøyde bakgrunnen. Bruk av et fylltrinn før ligation kan tillate påvisning av disse interaksjonene.
Kvantitativ 4C er ideelt egnet til å avhøre kromatinkontakter av målrettet loci. Det spesifikke PCR-forsterkningstrinnet begrenser imidlertid antall loci som kan undersøkes samtidig. En måte å øke antall målrettede loci er å multiplex PCR trinnene for å samtidig forsterke flere mål, men dette krever kompatibilitet av primere som brukes og teste hver primer par før implementering. Hvis globale endringer av kromatinarkitektur hos arrangører er ønsket, vil tilnærminger til genom-brede tilnærminger som Hi-C, PC Hi-C eller HiChIP være mer hensiktsmessig29,,30,31.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke F. Le Dily, R. Stadhouders og medlemmer av Graf-laboratoriet for deres råd og diskusjoner. G.S. ble støttet av en Marie Sklodowska-Curie fellesskap (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T av en Juan de la Cierva postdoktorfellesskap (MINECO, FJCI-2014-22946). Dette arbeidet ble støttet av Det europeiske forskningsrådet under 7th Framework Programme FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, grant agreement 609989 to T.G.), det spanske finans-, industri- og konkurranseevnedepartementet (MEIC) til EMBL-partnerskapet Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 og CERCA Program Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martello, G., Smith, A. The nature of embryonic stem cells. Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International. 2012, 738910 (2012).
- Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).
- Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).
- Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).
- Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
- Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Lettice, L. A., et al. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
- van de Werken, H. J., et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).
- Schwartzman, O., et al. UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling. Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).
- Tian, T. V., et al. Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification. Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).
- Chen, H., et al. Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity. Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).
- Apostolou, E., et al. Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).
- de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).
- Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. 4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis. Methods. , (2019).
- Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
