Summary
Embriyonik kök hücrelerden üretilen embriyoid cisimlerde yüksek iş eldeli sıralamanın ardından kantitatif kromozom konformasyon yakalama uygulamasını rapor ediyoruz. Bu teknik, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında belirli bir genin putatif arttırıcılar ve promotör bölgeleri arasındaki temasları tanımlamaya ve quantitate sağlar.
Abstract
Memeli gelişimi sırasında hücre kaderleri gen ekspresyonunun özgüllüğünü, zamanını ve mekansal desenlerini tanımlayan düzenleyici ağların kurulması yla belirlenir. Pluripotent kök hücrelerden elde edilen embriyoid cisimler (EBs) ana üç mikrop tabakasının farklılaşmasını incelemek ve hücre kader belirtimi sırasında düzenleyici devreleri tanımlamak için popüler bir model olmuştur. Dokuya özgü arttırıcıların organizatörlerle etkileşimkurarak bu ağlarda önemli bir rol oynadığı iyi bilinmesine rağmen, bunları ilgili hedef genlerine atamak hala zor olmaya devam etmektedir. Bunu mümkün kılmak için, geliştirme sırasında artırıcı-organizatör kişileri ve dinamiklerini incelemek için nicel yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Burada, eb farklılaştırma modelinde güçlendiricileri ve bilişli organizatörlerle olan bağlantılarını tanımlamak için bir 4C yöntemi ni uyarladık. Yöntem sık sık kesme kısıtlama enzimleri, sonication ve bir iç içe-ligasyon aracılı PCR protokolü ticari DNA kütüphane hazırlama kitleri ile uyumlu kullanır. Daha sonra, 4C kitaplıkları yüksek iş sahibi sıraya tabi tutulur ve biyoinformatically analiz, algılama ve seçilen bir organizatör ile temas tüm dizileri niceliksel izin. Elde edilen sıralama verileri, farklılaşma sırasında artırıcı-organizatör kişilerin dinamikleri hakkında bilgi edinmek için de kullanılabilir. EB farklılaştırma modeli için açıklanan tekniği uygulamak kolaydır.
Introduction
Farelerde, 3,5 günlük embriyoların iç hücre kütlesi (ICM) embriyonik pluripotent kök hücreler içerir. ICM daha fazla gün 4.5 epiblast içine gelişir, ektoderm üreten, mezoderm, ve endoderm hücreleri, embriyo ana üç mikrop katmanları. ICM pluripotent hücreler sadece geçici in vivo var olmasına rağmen, onlar fare embriyonik kök hücrelerin kurulması ile kültür yakalanabilir (mESCs)1,2,3. MESC'ler farklılaşmamış bir durumda kalır ve süresiz olarak çoğalır, ancak içsel ve dışsal uyaranlarla aynı zamanda pluripotency durumundan çıkma ve üç gelişimselmikroptabakasının 2,4üreten hücreleri üretme yeteneğine sahiptirler. İlginçtir, küçük damlacıklar süspansiyon kültürlü, MM'ler üç boyutlu agregalar formu (yani, EBs) her üçmikropkatmanları 5 ayırt . EB formasyon uyrağı, erken soy spesifikasyon sürecini incelemek için önemli bir araçtır.
Soy belirtimi sırasında, her mikrop tabakasının hücreleri belirli bir gen ekspresyonu programı4elde. Genlerin kesin spatiotemporal ekspresyonu, çekirdek organizatörleri, arttırıcılar, susturucular ve yalıtkanlar6,,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli cis-düzenleyici unsurlar tarafından düzenlenir. Arttırıcılar, düzenleyici DNA segmentleri genellikle birkaç yüz baz çiftleri kapsayan, dokuya özgü gen ekspresyonu koordine8. Arttırıcılar aktive edilir veya transkripsiyon faktörleri ve yerel kromatin yapısını düzenleyen kofaktör bağlanması ile susturulur8,10. Putatif arttırıcıları tanımlamak için yaygın olarak kullanılan teknikler genom çapında kromatin immünopresidiplitve ardından sıralama (ChIP-seq) ve sıralama (ATAC-seq) teknikleri kullanılarak transposaz erişilebilir kromatin için titreşmedir. Böylece, aktif arttırıcılar belirli aktif histon işaretleri ve artan yerel DNA erişilebilirliğiile karakterizedir 11,12,13,14. Buna ek olarak, gelişimsel arttırıcılar kendi cognate organizatörü ile fiziksel etkileşim gerektiren inanılmaktadır8,9. Gerçekten de, artırıcı-organizatör temasları bozan artırıcı varyantları ve silmelerin gelişimsel malformasyonlara yol açabileceği gösterilmiştir15. Bu nedenle, gelişimsel gen ekspresyonunu kontrol eden fonksiyonel arttırıcıların tanımlanması için ek bilgi sağlayan yeni teknikler için ihtiyaç vardır.
Kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin geliştirilmesinden bu yana16,kromozom kontaklarının haritalaması düzenleyici unsurlar arasındaki fiziksel mesafeyi değerlendirmek için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Daha da önemlisi, 3C tekniklerinin yüksek iş sahibi varyantları son zamanlarda geliştirilmiştir, fiksasyon için farklı stratejiler sağlayan, sindirim, ligasyon, ve kromatin parçaları arasındaki temasların kurtarma17. Bunlar arasında, yerinde Hi-C 3C ligasyon ürünleri genom çapında18dizileme sağlayan popüler bir teknik haline gelmiştir. Ancak, arttırıcı-organizatör kontaklarının analizine uygun bir çözüme ulaşmak için gereken yüksek sıralama maliyetleri, bu tekniği belirli lokusların incelenmesi için pratik hale getirir. Bu nedenle, alternatif yöntemler yüksek çözünürlükte hedeflenen loci analiz etmek için geliştirilmiştir19,20,21,22. Bu yöntemlerden biri, yani 4C, tüm strateji karşı bir olarak bilinen, bakış açısı olarak seçilen bir site temas tüm dizileri algılama sağlar. Ancak, standart 4C tekniğinin bir dezavantajı ters PCR gerekli, hangi farklı boyutlarda parçaları güçlendirir, küçük ürünler lehine ve yüksek iş lenme sıralaması sonra sayısal önyargı. Son zamanlarda, UMI-4C, benzersiz moleküler tanımlayıcılar (UMI) kullanarak 4C tekniğinin yeni bir varyantı bu sorunu 23 atlatan kantitatif ve hedefli kromozomkontumasyon profilleme için geliştirilmiştir23. Bu yaklaşım, sık sık kesiciler, sonication ve iç içe ligasyon aracılı PCR protokolü kullanır, böylece nispeten düzgün uzunluk dağılımı ile DNA parçalarının amplifikasyon içeren. Bu homojenlik, PCR tercihlerinin daha kısa diziler için amplifikasyon sürecindeki önyargıları azaltır ve uzamsal bağlı moleküllerin/parçaların verimli bir şekilde kurtarılmasını ve doğru sayılmasına olanak tanır.
Burada, EB farklılaşması sırasında soyu öğretici transkripsiyon faktörlerinin organizatörleri ve arttırıcıları arasındaki kromatin temaslarını tanımlamak ve ölçmek için UMI-4C tekniğini uyarlayan bir protokolü açıklıyoruz.
Protocol
1. Fare embriyonik kök hücrelerinden embriyoid vücut üretimi
- MESC serumsuz kültür ortamını hazırlayın: DMEM/F12 ve nörobazal ortam 1:1 oranında karıştırılır. Kültür ortamı MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (1x), sodyum pirüuvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penisilin-streptomisin (100 U/mL), beta-mercaptoe ile desteklenmektedir. Tanol (50 μM), N2 ve B27 takviyeleri (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM) ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) (1.000 U/mL).
- EB farklılaşma ortamını hazırlayın: DMEM %10 fetal sığır serumu (FBS), MEM esansiyel olmayan amino asitler (1x), sodyum pirüuvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penisilin-streptomisin (100 U/mL), beta-merkaptoetanol (50 μM) ile desteklenir.
- 10 cm plastik tabaklarda, mESC kültürü serumsuz ortamda %0,1 (w/v) jelatin ile kaplanmış kültür mm'leri.
- MESC'ler %60 biraraya geldiğinde kültür ortamını çıkarın ve 2 mL sterilize PBS ile 1x hafifçe yıkayın.
- PBS'yi tamamen çıkarın ve 2 mL hücre ayırma ortamı ekleyin. Kültür çanasını 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
- Çanak içine 8 mL EB farklılaştırma ortamı ekleyerek reaksiyonu inaktive edin.
- Tek hücreli süspansiyon elde etmek için 15-20 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak mESC kolonilerini ayrıştırın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'de (RT) 5 dk santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Hücreleri say (örn. hemositometre kullanarak).
- EB farklılaşma ortamı ile hücre peletrerere resuspend ve 2 x 104 hücre / mL konsantrasyonu ayarlayın.
- 15 cm'lik bir kültür kabının kapağını ters çevirin ve 200 μL'lik çok kanallı pipet kullanarak kapakta 20°L'lik yeniden askıda kalmış hücreler (~400 hücre/damla) koyun.
- Kapağı dikkatlice alt odaya ters çevirin ve 37 °C'de %5 CO2 ve %95 nem ile 37 °C'de asılı damlalarla kabı 3 gün boyunca inkübe edin.
- Kapağı 10 mL PBS ile hafifçe yıkayarak EB'leri toplayın ve EB içeren süspansiyonu 50 mL plastik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 30 dakika boyunca RT'ye yerleştirin, böylece EB'ler yerçekimi ile dibe batar. Dikkatle supernatant çıkarın.
- 10 mL taze EB farklılaştırma ortamı ile EB'leri hafifçe askıya alın ve 10 cm bakteriyolojik Petri kabına aktarın.
- 3-6 gün sonra ters mikroskop kullanarak EB oluşumunu kontrol edin. Üretilen EB'ler yuvarlak ve homojen boyutta olmalıdır.
- Kültürleri %5 CO2 ve %95 nem oranı ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın. EB'ler üç mikrop tabakasına ayırmaya devam edecek ve analiz için çeşitli zaman noktalarında toplanabilir.
2. EB'lerin Dissosiyası
- 50 mL plastik bir tüp içine iki ila üç 10 cm yemekler DEN EBs toplayın. 5 dakika RT 300 x g de EBs santrifüj, sonra dikkatle supernatant çıkarın.
- 10 mL PBS ile EB'leri yeniden askıya alın. 3 dk rt 300 x g centrifuge EBs ve supernatant kaldırın.
- 2 mL tripsin-EDTA (%0.25) ekleyin tek hücreli süspansiyon elde etmek için 37 °C'de 15 dk. Pipet yukarı ve aşağı her 3 dakikada bir tüp tüp kuluçkaya yatırın.
- Tripsin reaksiyonunu durdurmak için 8 mL EB farklılaştırma ortamı ekleyin. Mikroskop altında EB dissosiation kontrol edin ve hücreleri saymak.
3. Fiksasyon
- Taze EB kültür ortamındaki hücreleri 1 x 106 hücre/mL'de yeniden askıya alın. 50 mL'lik bir tüp için, 45 mL orta alanda maksimum 4,5 x 107 hücre kullanın.
- %37'lik bir hisse senedinden (6 aydan büyük olmayan) paraformaldehiti %1 nihai konsantrasyona ekleyin.
DİkKAT: Tehlikeli bir kimyasal olduğu için paraformaldehit ilerlerken uygun sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine uyun. - Rotasyon altında RT 10 dakika kuluçka.
- Formaldehiti 0.125 M'lik son konsantrasyona glisin ekleyerek söndürün.
- Rotasyon altında RT 5 dakika kuluçka.
- Sabit hücreleri buza aktarın ve bundan sonra 4 °C'de soğuk tutun.
- Bir soğutmalı santrifüj 5 dakika için 300 x g hücreleri pelet.
- Supernatant atın ve soğuk PBS pelet resuspend (5 x 106 hücreleri için 1 mL), sonra 1.5 mL güvenli kilit tüpleri aktarın.
- 4 °C'de 5 dakika için 300 x g'deki hücreleri peletleyin, süpernatant'ı atın ve sıvı nitrojenle peletleri tutturun. -80 °C'de saklayın veya aşağıdaki protokole devam edin.
4. Hücre lisisi ve restriksiyon enzim sindirimi
- Hücre peletini 2-5 x 106 hücre başına 0,25 mL taze hazırlanmış buz gibi lysis tamponu (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, %0,2 Igepal CA630 ve 1x proteaz inhibitörleri) yavaşça askıya alın. 5 mL lysis arabelleği hazırlamak için Tablo 1'ebakınız.
- Hücreleri 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 5 dk için 1.000 x g santrifüj. Supernatant atın ve çekirdekleri içeren pelet, tutmak.
- Peletli çekirdekleri 500 μL soğuk lysis tamponu ile yıkayın.
- 1x tampon 2'de %0,5 SDS 50 μL ile 1,5 mL'lik bir tüpteki peleti yavaşça yeniden askıya alın, ardından tüpü 62 °C'de 10 dakika boyunca bir ısıtma bloğuna yerleştirin.
- Tüpleri ısıtma bloğundan çıkarın ve SDS'yi söndürmek için %10 triton X-100'ün 25 μL'si içeren 170 μL sindirim tamponu ekleyin. Aşırı köpüklenmeyi önleyerek pipetleme yaparak iyice karıştırın.
- 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 25 μL sindirim tamponu ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve sindirilmemiş bir kontrol olarak 8 μL alın. Sindirilmemiş kontrol örneğini -20 °C'de saklayın. Kalan çekirdeğe 100 U MboI restriksiyon enzimi (25 U/μL stokun 4 μL'si) ekleyin ve kromatini 37 °C'de döndürülme altında 2 saat sindirin. 100 U MboI ve ek bir 2 saat için kuluçka başka bir aliquot ekleyin.
- MboI başka bir 100 U ekleyin ve 37 °C'de bir gecede rotasyon altında kuluçka.
- Ertesi gün, başka bir 100 U MboI ekleyin ve 3 saat için 3 7 °C rotasyon altında kuluçka.
- Sindirilmiş kontrol numunesi olarak 8 μL alın. De-crosslink sindirilmiş kontrol örnekleri ve adım 4.8'den sindirilmemiş kontrol örnekleri 80 μL TE tampon (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) ve 10 μL proteinaz K (10 mg/mL) ekleyerek. 65 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Sindirim verimliliğini kontrol etmek için %0,6 jel üzerinde 20 μL aliquots çalıştırın. Başarılı sindirim çoğunlukla 3.0-0.5 kb aralığında parçaları göstermektedir.
5. Yakınlık ligasyonu ve çapraz bağlantı ters
- MboI'yi inaktive etmek için MboI'yi 20 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 65 °C'de MboI sindirilmiş numuneleri inkübünle, ardından RT'ye soğutun.
- Tüpleri RT'de 1.000 x g'de 5 dk için santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve peleti 200 μL taze ligaz tamponunda çözün.
- Her numuneye 1.000 μL ligasyon ana karışımı ekleyin. Ligasyon ana karışımının 1.000 μL'sini hazırlamak için Tablo 2'yebakınız.
- Yavaş rotasyon (9 rpm) ile gecede RT ters ve kuluçka ile karıştırın.
- 100 μL proteinaz K (10 mg/mL) ve 10 μL RNase A (10 mg/mL) ekleyerek RNA ve protein artıklarını ortadan kaldırın. 45-60 dk için 55 °C'de kuluçka örnekleri.
- Numuneleri 65 °C'de 4 saat ek olarak kuluçkaya yatırmaya devam edin.
6. DNA kesme ve boyut seçimi
- RT için serin tüpler.
- 4 °C'de 1.000 x g'de 5 dk santrifüj.
- Numuneyi 2 mL tüpte üç adet 400 μL'lik alana bölün ve her tüpe 2 μL glikojen (20 mg/m), 40 μL sodyum asetat (3 M, pH = 5,2) ve 2,5 x hacim (1 mL) ilave edin. 45-60 dk için -80 °C'de ters çevirerek ve kuluçkaya yatırarak karıştırın.
- 25 dk. 16.000 x g 4 °C'de santrifüj.
- DNA peletlerini %70 etanolün 800 μL'lik kısmını yeniden sulayarak yıkayın. Santrifüj 16.000 x g 4 °C için 5 dakika.
- Supernatant çıkarın ve% 70 etanol 800 μL ile bir kez daha yıkama gerçekleştirin.
- Peleti 1x Tris tamponunun (10 mM Tris-HCl, pH = 8) 130 μL'lik bir alanda eritin ve DNA'yı tamamen eritmek için 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübedin. Gerekirse, herhangi bir çökelti yeniden askıya almak için pipetleme kullanın.
- DNA verimini ölçün; 1 x 106 hücre için 2,5-5 g kromatin beklenebilir. 3C ürünün ± 200 ng'sini %0,6 agarose jel üzerinde çalıştırarak ligasyonu kontrol edin. Başarılı ligasyonlar çoğunlukla DNA parçaları > 3 kb gösterir. Örnekleri -20 °C'de saklayın.
- 1x Tris tampon hacminin (tüp başına 1 μg) 100 μL'lik sonication'a uygun 0,65 mL'lik bir tüpteki numunesini seyreltin. Kütüphane hazırlama için kullanılan standart miktar 3 μg'dir, bu nedenle gerekirse üç ayrı tüpte sonication gerçekleştirin.
- Sonicator üzerinde aşağıdaki parametreleri kullanarak 150-700 bp (ortalama = 400-500 bp) boyutunda yamak DNA: Döngüler: 6-8 20 s kapalı 20 s kapalı. Bu, DNA'yı Illumina sıralayıcıları kullanarak yüksek işlemli sıralama kitaplığı hazırlığı için uygun hale getirmelidir.
- Yıkınan DNA'yı normal yeni bir güvenli kilit tüpüne aktarın. Aynı örnekten birden fazla sonications havuz.
- RT'de bir şişe DNA arınma boncukları ısıtın. Şu andan itibaren, düşük bağlama ipuçları kullanın.
- DNA tüpüne 1,8 x hacimli boncuk ekleyin ve yavaşça askıya alın.
- 5 dakika RT'de kuluçka.
- Bir manyetik raf ile boncuk toplamak. Tüpleri manyetik rafta tutarken boncukları 2x taze hazırlanmış %80 etanol ile yıkayın.
NOT: Artık damlacıklar da dahil olmak üzere tüm etanolleri çıkarın. - Hava kuru boncuklar kısaca (2-3 dk) RT.
NOT: Boncukları 5 dk'dan uzun süre kurutmayın. Bu DNA verimini azaltacaktır. - DNA'yı uzaklaştırmak için 90 μL 1x Tris tampon (10 mM Tris-HCl, pH = 8) ile boncukları yeniden askıya alın.
- DNA verimini ölçün ve %1,5 jel üzerinde 5 μL aliquot analiz edin. Presonication verim ile karşılaştırıldığında çok az kayıp olmalıdır.
7. Sıralama için kütüphane hazırlığı
- Kütüphane hazırlama kitinden 15 μL ana karışım ekleyin. Yığılmayı yıkılmış DNA'nın uçlarını onarmak için 10 μL 10x son onarım reaksiyon tamponu ve 5 μL son onarım enzim karışımını birleştirin.
- 30 dakika RT'de kuluçka.
- DNA saflaştırma boncuk 1.1x hacmi ekleyin ve yavaşça resuspend.
- 5 dakika RT'de kuluçka.
- Bir manyetik raf ile boncuk toplamak. Tüpleri manyetik rafta tutarken boncukları 1 mL taze hazırlanmış %80 etanol ile iki kez yıkayın. Etanol'u çıkarın.
- DNA'yı uzaklaştırmak için 42 μL 1x Tris tampon (10 mM Tris-HCl, pH = 8) ile boncukları 2-3 dakika hava kurutun.
- Her numuneye 8 μL dA kuyruklu ana karışımı ekleyin. dA kuyruklu ana karışımı hazırlamak için 5 μL 10x dA kuyruklu reaksiyon arabelleği ve 3 μL Klenow parça exo eksi sini birleştirin.
- 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
- DNA'yı defosforilasyona 2 μL baldır bağırsak alkalen fosfataz (CIP) ekleyin.
- 37 °C'de 30 dk, 50 °C'de 60 dk kuluçka.
- DNA saflaştırma boncuk 1.1x hacimleri ekleyin ve yavaşça resuspend.
- 5 dakika RT'de kuluçka.
- Bir manyetik raf ile boncuk toplamak. Tüpleri manyetik rafta tutarken boncukları 2x taze hazırlanmış %80 etanol ile yıkayın.
- DNA'yı uzaklaştırmak için 35 μL 1x Tris tampon (10 mM Tris-HCl, pH = 8) ile boncukları kısaca (2-3 dk) hava kurutun.
- Adaptör ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin. Tablo 3'tebelirtildiği gibi azaltılmış adaptör/ligaz konsantrasyonları kullanın.
- 20 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Urasil DNA glikozilaz ve DNA glikozilaz lyase enonuklelease VII (örneğin, USER) enzimkarışımı 3 μL ekleyin, pipetleme ile karıştırın ve 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçka.
- Hacmi su yla 100°L'ye çıkarın, 96 °C'de 5 dk kaynatın ve numuneleri buzda saklayın.
- DNA saflaştırma boncuk 1.1x hacimleri ekleyin ve yavaşça resuspend.
- 5 dakika RT'de kuluçka.
- Bir manyetik raf ile boncuk toplamak. Tüpleri manyetik rafta tutarken boncukları 2x taze hazırlanmış %80 etanol ile yıkayın.
- DNA'yı uzaklaştırmak için boncukları 2-3 dakika hava kurutun.
8. 4C kromatin etkileşim kütüphanesi amplifikasyon ve arıtma
- İlk PCR'yi gerçekleştirmek için 10 μL'lik kitaplığı kullanarak 4C kitaplığını yükseltin. PCR kurulumu ve programı Tablo 4'tebulunabilir.
- İç içe pcr gerçekleştirin. İç içe pcr kurulumu ve programı Tablo 5'tebulunabilir.
- Havuz PCR ürünleri her kütüphane için ve 1.1x DNA arıtma boncuk ile arındırın.
- DNA verimini ölçün ve %1,5 jel üzerinde 5 μL aliquot analiz edin.
- Kitaplık konsantrasyonu ayarla ve kitaplığı sırala. Dizine eklenmişse, kitaplıklar sıralamadan önce bir araya kullanılabilir.
Representative Results
Asma damlalarında ESC farklılaşmasının indüksiyonundan altı gün sonra, daha ileri analizler için kullanılan homojen bir EB popülasyonu elde ettik(Şekil 1). UMI-4C yöntemi23'ü, EBs24'tekisoya özgü genlerin promotörlerinde spesifik kromatin etkileşimini ölçmek için uyarladık. Farklı adımlarda temsili kalite kontrol jelleri ile protokolün şematik bir bakış Şekil 2Agösterilir. MboI restriksiyon enzim sindiriminin verimliliğini belirlemek için ilk kalite kontrol yapılmıştır. Verimli sindirim, 3 kbp'den küçük bir parça boyutunu gösterdi (Şekil 2B). Dikkat, mESC ve EB kromatin sindirim zordu ve bazen artık sindirilmemiş kromatin devam etti. İkinci kalite kontrolü, parçaların çoğunun şimdi > 3 kbp(Şekil 2B)olduğunu doğrulamak için ligasyondan sonra yapılmıştır. Sonication sonrası elde edilen kromatin parçaları jel elektroforez ile analiz edildi. 400-500 bp'lik parça boyutları bekleniyordu (Şekil 2B).
Defosforilasyon ve tek uçlu adaptör ligasyonundan sonra, ilgi çekici hedefleri yükseltmek için iki tur PCR yapıldı. İç içe geçen bir yaklaşım, her bir çekirge için iki astar kümesi tasarlamak için kullanılmıştır. Bu, özgüllüğünü artırmaya yardımcı oldu. Her hedef, PCR koşullarını optimize etmek için iki farklı astar çifti ile ayrı ayrı yükseltildi (örneğin, Pou5f1 locus için A ve B çiftleri A ve B çiftleri ve T çekirgeleri için C ve D astar çiftleri) ve 400 bp civarında bir DNA smear ile sonuçlandı(Şekil 2C). Alternatif olarak, a ve c hedeflerini aynı anda yükseltmek için multipleks PCR yapıldı (Şekil 2D) ve saflaştırma sonrası benzer bir parça boyutu ile sonuçlandı (Şekil 2D). 4C kütüphane hazırlığı için kullanılan astarlar (Pou5f1 ve Tloci) Tablo 6'dabulunabilir.
Veri analizi için, ham sıralama okumaları ilk olarak yeniden çit mm10 fare genomuna göre hizalanmış, hepsi çoğaltılmış ve düşük kaliteli (< 20) okumalar kaldırılmıştır. Her yem için, her kısıtlama parçasındaki bilgiler okunan parça sayısı hesaplandırılarak elde edildi ve ham bir temas profili elde edildi. Daha sonra, ilgi bölgesi yem 2 kbp ve 250 kbp mesafe ile tüm kısıtlama parçaları olarak tanımlanmıştır. Her bir kısıtlama parçasının boyutu, ilgi alanında toplam ham kontak sayısının %5'ine ulaşılıncaya kadar profilleri düzeltmek için bitişik kısıtlama parçalarının sırayla toplanmasıyla artırıldı. Çoğaltmaların tümleşik olduğundan ve koşulların karşılaştırıldığından emin olmak için, hem eğimleri hem de rasgele kesitleri kısıtlama parçası düzeyinde dahil ettik. Durum başına ortalama profil ve aralarındaki kıvrım değişimi Şekil 3'tegösterildiği gibi çizilmiştir. EB farklılaşması sırasında, arttırıcılar ve pluripotency gen Pou5f1 organizatörü arasındaki temaslar azalırken, mesendoderm soyundan eğitici transkripsiyon faktörü T arttırıcı-promotör temasları arttı (Şekil 3), bu gelişimsel arttırıcılar hakkında fonksiyonel bilgiler sağlayan.
Şekil 1: MESC ve türetilmiş embriyoid cisimlerin temsili görüntüleri. Gün 0 mESC serumsuz koşullarda kültürlü (sol) ve homojen gün 6 EBs (sağ) ters bir mikroskop tarafından gözlenen. Ölçek Çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 4C iş akışı ve protokolün ana adımları temsili görüntüler. (A) Kantitatif 4C şematik iş akışı. RS = kısıtlama sitesi; ABD = upstream; DS = aşağı akım; UP = evrensel astar; D = RS ve DS arasındaki mesafe ideal olarak 5-15 bp.(B) MboI sindirilmiş kromatin örnekleri (I), çekirdekleri ligatlı kromatin (II) ve sonicated kromatin (III) olmalıdır. Soldaki sayılar, her bir örnek için çalışan DNA merdiveni tarafından belirlenen DNA boyutlarını gösteriyor. (C) İki loci pcr amplifikasyon örnekleri: Pou5f1 (astar A ve B) ve T (astar C ve D). (D) A ve C. ES = embriyonik kök hücreleri kullanarak Pou5f1 ve T loci'de multipleks PCR amplifikasyonu örnekleri; EB = embriyoid cisimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 4C profil örnekleri. Pou5f1 ve T gen organizatörleri üzerinde bulunan yemler için kantitatif 4C profilleri mESCs ve Gün 6 EBS olarak titretilmiştir. Üst panel, iki bağımsız biyolojik kopyadan oluşturulan ortalama temas çizimlerini gösterir; alttaki panel, 6. Açık mavi kutular, farklılaşma sırasında dinamik değişikliklerle artırıcıların konumunu gösterir. Şekil Tian ve ark.24uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 5mL için | |
| 1M Tris-HCl, pH8.0 | 50 μL |
| 5M Nacl | 10 μL |
| %10 Igepal CA630 | 100 μL |
| 50x Roche komple proteaz inhibitörleri | 100 μL |
| MilliQ Su | 4,74 mL |
Tablo 1: Lysis tampon.
| 1000μL için | |
| MilliQ Su | 869 μL |
| 10X NEB T4 DNA Ligase Tampon | 120 μL |
| 20mg/mL Büyükbaş Hayvan Serum Albumin | 6 μL |
| 2000 U/l T4 DNA Ligase | 5 μL |
Tablo 2: Ligasyon ana karışımı hazırlama.
| 15 μL için | |
| 5X Hızlı Ligasyon Reaksiyon Tamponu | 10 μL |
| NEBNext Adaptörü | 3 μL |
| Hızlı T4 DNA ligaz | 2 μL |
Tablo 3: Adaptör ligasyon reaksiyonu.
| PCR kurulumu | |
| Adaptör ligated kütüphane-on-deads | 10 μL |
| PCR sınıfı su | 20,25 μL |
| 10 μM Hedef özel astar | 3.75 μL |
| 10 μM NEB Endeksi astar | 3.75 μL |
| Herculase II 5X tampon | 10 μL |
| 10 Mm dNTPs | 1,25 μL |
| Herkülaz II polimeraz | 1 μL |
| Toplam hacim | 50 μL |
| PCR programı | |
| Adım 1: 98 °C - 2 dk | |
| Adım 2: 98 °C - 20s | |
| Adım 3: 65 °C - 30s | |
| Adım 4: 72 °C - 45s | |
| Adım 5: toplam 15-18 döngü yapmak için adım 2'ye gidin | |
| Adım 6: 72 °C - 3 dk | |
| Adım 7: 4 °C – tutun |
Tablo 4: 4C kromatin etkileşim kitaplığı amplifikasyon, ilk PCR.
| İç içe PCR kurulumu | |
| İlk PCR'den DNA parçası | 10 μL |
| PCR sınıfı su | 20,25 μL |
| 10 μM özgül astar+P5 Illumina astar | 3.75 μL |
| 10 μM P7 Illumina astar | 3.75 μL |
| Herculase II 5X tampon | 10 μL |
| 10 Mm dNTPs | 1,25 μL |
| Herkülaz II polimeraz | 1 μL |
| Toplam hacim | 50 μL |
| İç içe PCR programı | |
| Adım 1: 98 °C - 2 dk | |
| Adım 2: 98 °C - 20s | |
| Adım 3: 65 °C - 30s | |
| Adım 4: 72 °C - 45s | |
| Adım 5: toplam 15-18 döngü yapmak için adım 2'ye gidin | |
| Adım 6: 72 °C - 3 dk | |
| Adım 7: 4 °C – tutun |
Tablo 5: 4C kromatin etkileşim kitaplığı amplifikasyon, iç içe PCR.
| Adı | Sıra (5'-3') |
| DS-Eki4-A | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG |
| ABD-Eki4-A | TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC |
| DS-Ekim4-B | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGTGTATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTCTCT |
| ABD-Eki4-B | ACCAGGTGGGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT |
| DS-T-C | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC |
| ABD-T-C | GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAA |
| DS-T-D | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGGCTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG |
| ABD-T-D | GCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC |
| YUKARı-4C | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
| Adap-ı1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGTGCTCtTCCGATC |
| Adap-i2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGTGCTCtTCCGATC |
| Adap-i3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGTGCTCtTCCGATC |
| Adap-i4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGTGCTCtTCCGATC |
Tablo 6: 4C kitaplık hazırlama için kullanılan astarlar.
Discussion
Asılı damla kültür yöntemi ek büyüme faktörleri veya sitokinler gerekmez ve tekrartekrar mESCs5önceden belirlenmiş sayıda EBs homojen popülasyonları oluşturur . Burada, EB farklılaştırma modelinde soya özgü transkripsiyon faktörlerinin arttırıcı-organizatör temasının ölçülebilir hale getirmek için UMI-4C yaklaşımından uyarlanmış nicel 4C protokolünü açıklıyoruz. EB farklılaşması sırasında Pou5f1 ve T genlerinin organizatörleri ile dinamik bir şekilde temas eden kromatin bölgelerini belirledik. Pou5f1, EB farklılaşması sırasında bozuldu ve Pou5f1 organizatörü ile distal arttırıcısı arasındaki temas frekansı azaldı. Tersine, EB farklılaşması sırasında T düzenlendi ve organizatörü ile temas frekanslarının azaldığı üç arttırıcı belirledik(Şekil 3). Kimlik doğrulamak için, aktif histon işareti H3K27ac bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tsayyapılabilir 24, Bu histon işareti arttırıcı aktivasyon ile ilişkili olduğu gösterilmiştir ve arttırıcılar onların inaktivasyon sırasında bu işareti kaybedersiniz11.
Standart bir 4C tekniği, spesifik genomik alanların kromatin temas profilini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır25. Ancak, pcr parça boyutunun heterojenliği ve PCR kopyalarını ayırt etme imkânının getirdiği önyargılar nedeniyle, kapsamlı normalleştirme26,27,28'den sonra bile bu yaklaşımı nicel olarak yorumlamak zordur. Bizim kantitatif 4C yöntemi büyük ölçüde sonication ve bir iç içe-ligasyon aracılı PCR adım kullanarak tek moleküllerin sayısallaştırılması sağlayan UMI-4C tekniği ile aynıdır klasik 4C yaklaşım23sınırlama atlamak için . Ancak, benzersiz moleküler tanımlayıcılar kullanan UMI-4C'nin aksine, kantitatif 4C protokolümüz sonication step tarafından üretilen spesifik DNA kırılmasına göre tek moleküllerin sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Protokolümüzü ticari DNA kitaplığı hazırlama kitleri ile uyumlu hale getirerek, eşsiz moleküler tanımlayıcılarla astar ihtiyacını ortadan kılmaktadır.
Protokolümüz göz önünde bulundurulması gereken birkaç önemli adımı içerir. Klasik 4C yöntemi28'deolduğu gibi, protokolümüzün kritik faktörleri 3C moleküllerinin hazırlanması sırasında sindirim in verimliliği ve ligasyondur. Düşük sindirim/ligasyon verimliliği, ilgi nin bir parçasıyla etkileşimin karmaşıklığını önemli ölçüde azaltabilir ve bu da çözünürlüğün azalmasına neden olabilir. Daha önce açıklandığı gibi23, protokolün bir başka kritik adım kütüphane amplifikasyon için astar tasarımıdır. İkinci PCR reaksiyon astarları sorgulanan kısıtlama sitesinden 5-15 nt bulunmalıdır. 75 nt sıralama okumasında, bu eşleme için yakalama uzunluğunun en az 40 nt soluna izin verir. İlk PCR reaksiyonunda kullanılan astar, üst üste çakışma olmadan ikinci astarın yukarısına tasarlanmalı ve her ikisi de verimli DNA amplifikasyonu sağlayacak kadar spesifik olmalıdır. Çoklama için astarlar 60-65 °C'lik bir erime sıcaklığı (Tm)hedefleyen bağımsız olarak tasarlanmalıdır. Ayrıca, diğer 3C tekniklerinde olduğu gibi, kantitatif 4C yönteminin çözünürlüğü protokol25'tekullanılan restriksiyon enzimi ile belirlenir. Bu protokol, 4 bp tanıma bölgesi olan MboI'lı bir restriksiyon enzimi kullanır. Bu enzim ile maksimum çözünürlük yaklaşık 500 bp, ama bu son derece lokus bağımlı ve nadiren elde edilir. Başka bir sınırlama, aynı kısıtlama parçasında bulunan öğeler arasında oluşan etkileşimlerin algılanmamasıdır. Buna ek olarak, bir kısıtlama alanının uzaklığında meydana gelen etkileşimler sindirilmemiş arka plandan ayırt edilemez. Ligasyondan önce doldurma adımı nın kullanılması, bu etkileşimlerin algılanmasına izin verebilir.
Kantitatif 4C, hedeflenen lokusun kromatin kontalarını sorgulamak için idealdir. Ancak, belirli PCR amplifikasyon adımı aynı anda araştırılabilir loci sayısını sınırlar. Hedeflenen loci sayısını artırmanın bir yolu, aynı anda birden fazla hedefi yükseltmek için PCR adımlarını çok katlı yapmaktır, ancak bu, kullanılan astarların uyumluluğunu ve uygulamadan önce her astar çiftinin test edilmesini gerektirir. Organizatörlerde kromatin mimarisinin küresel değişiklikler istenirse, Hi-C, PC Hi-C veya HiChIP gibi genom çapında yaklaşımlar daha uygun olacaktır29,30,31.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
F. Le Dily, R. Stadhouders ve Graf laboratuvarı üyelerine tavsiye ve tartışmaları için teşekkür ederiz. G.S., Marie Sklodowska-Curie bursu (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T. tarafından Juan de la Cierva doktora sonrası bursu (MINECO, FJCI-2014-22946) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi tarafından7.Çerçeve Programı FP7 (ERC Sinerji Grant 4D-Genome, 609989 to T.G., İspanya Ekonomi, Sanayi ve Rekabet Bakanlığı (MEIC) kapsamında EMBL ortaklığı, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 ve CERCA Programı Generalitat de Catalun kapsamında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martello, G., Smith, A. The nature of embryonic stem cells. Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International. 2012, 738910 (2012).
- Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).
- Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).
- Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).
- Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
- Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Lettice, L. A., et al. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
- van de Werken, H. J., et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).
- Schwartzman, O., et al. UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling. Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).
- Tian, T. V., et al. Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification. Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).
- Chen, H., et al. Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity. Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).
- Apostolou, E., et al. Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).
- de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).
- Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. 4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis. Methods. , (2019).
- Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
