Summary
Vi rapporterer om anvendelsen af kvantitativ kromosomkropsformation efterfulgt af sekvensering med høj gennemløb i embryoide kroppe, der stammer fra embryonale stamceller. Denne teknik gør det muligt at identificere og koronere kontakterne mellem formodede smagsforstærkere og promotorregioner for et givet gen under embryonal stamcelledifferentiering.
Abstract
Under pattedyrs udvikling bestemmes celleskæbneer gennem etablering af reguleringsnetværk, der definerer specificiteten, timingen og de rumlige mønstre af genekspression. Embryoid organer (EBs) stammer fra pluripotente stamceller har været en populær model til at studere differentieringen af de vigtigste tre kimlag og til at definere regulerende kredsløb under celle skæbne specifikation. Selv om det er velkendt, at vævsspecifikke smagsforstærkere spiller en vigtig rolle i disse netværk ved at interagere med initiativtagerne, er det stadig en udfordring at tildele dem deres relevante målgener. For at gøre dette muligt er der behov for kvantitative tilgange for at undersøge de mere omfattende kontakter og deres dynamik under udviklingen. Her har vi tilpasset en 4C-metode til at definere smagsforstærkere og deres kontakter med cognate initiativtagere i EB differentiering model. Metoden bruger ofte skære begrænsning enzymer, sonikering, og en indlejret-ligation-medieret PCR protokol kompatibel med kommercielle DNA bibliotek forberedelse kits. Efterfølgende er 4C biblioteker udsat for høj-throughput sekventering og analyseres bioinformatically, så detektion og kvantificering af alle sekvenser, der har kontakt med en valgt promotor. De resulterende sekventeringsdata kan også bruges til at få oplysninger om dynamikken i kontakt med forstærkeren under differentieringen. Den teknik, der er beskrevet for EB-differentieringsmodellen, er nem at implementere.
Introduction
I mus indeholder den indre cellemasse (ICM) af 3,5 dage gamle embryoner embryonale pluripotente stamceller. ICM videreudvikler sig til epiblast på dag 4.5, genererer ektoderm, mesoderm, og endoderm celler, de tre vigtigste kim lag i fosteret. Selv om pluripotente celler i ICM kun eksisterer forbigående in vivo, kan de fanges i kulturen ved at etablere embryonale stamceller (mESC)1,2,3. MESC'erne forbliver i en udifferentieret tilstand og formere sig på ubestemt tid, men på iboende og ydre stimuli er de også i stand til at forlade pluripotency-tilstanden og generere celler i de tre udviklingskimlag2,4. Interessant, når kulturforme i suspension i små dråber, mESCs danner tre-dimensionelle aggregater (dvs. EBs), der skelner i alle tre kim lag5. EB-formationsanalysen er et vigtigt redskab til at studere den tidlige afstamningsspecifikationsproces.
Under afstamningspecifikationen får celler i hvert kimlag et specifikt genekspressionsprogram4. Den præcise spatiotemporal udtryk for gener er reguleret af forskellige cis-regulerende elementer, herunder centrale initiativtagere, smagsforstærkere, lyddæmpere, og isolatorer6,7,8,9. Smagsforstærkere, lovgivningsmæssige DNA-segmenter typisk spænder over et par hundrede base par, koordinere væv-specifikke genekspression8. Smagsforstærkere aktiveres eller lukkes af binding af transskriptionsfaktorer og cofaktorer , der regulerer den lokale kromatinstruktur8,10. Almindeligt anvendte teknikker til at identificere formodede smagsforstærkere er genomdækkende kromatinimmunudfældning efterfulgt af sekventering (ChIP-seq) og analysen for transposasetilgængelige kromatin ved hjælp af sekventeringsteknikker (ATAC-seq). Aktive smagsforstærkere er således karakteriseret ved specifikke aktive histonermærker og ved øget lokal DNA-tilgængelighed11,12,13,14. Desuden er udviklingsmæssige smagsforstærkere menes at kræve fysisk interaktion med deres cognate promotor8,9. Faktisk har det vist sig, at forstærker varianter og sletninger, der forstyrrer forstærker-promotor kontakter kan føre til udviklingsmæssige misdannelser15. Derfor er der behov for nye teknikker, der giver yderligere oplysninger til identifikation af funktionelle smagsforstærkere, der styrer udviklingsgenekspression.
Siden udviklingen af kromosomkropsformationsfangstteknikken (3C)16er kortlægningen af kromosomale kontakter blevet anvendt intensivt til at vurdere den fysiske afstand mellem reguleringselementer. Vigtigere er det, høj-throughput varianter af 3C teknikker er for nylig blevet udviklet, giver forskellige strategier for fiksering, fordøjelse, ligation, og inddrivelse af kontakter mellem kromatin fragmenter17. Blandt dem, in situ Hi-C er blevet en populær teknik tillader sekventering af 3C ligation produkter genom-dækkende18. De høje sekventeringsomkostninger, der er nødvendige for at nå frem til en resolution, der er egnet til analyse af kontakter med forstærkeren, gør imidlertid denne teknik upraktisk til undersøgelse af specifikke loci. Derfor blev der udviklet alternative metoder til at analysere målrettede loci ved højere opløsning19,20,21,22. En af disse metoder, nemlig 4C, kendt som en en versus alle strategi, gør det muligt at opdage alle sekvenser, der kontakter et websted valgt som synspunkt. Men en ulempe ved standard 4C teknik er den omvendte PCR kræves, som forstærker forskelligt størrelse fragmenter, favoriserer små produkter og biasing kvantificering efter høj-throughput sekventering. For nylig, UMI-4C, en ny variant af 4C teknik ved hjælp af unikke molekylære identifikatorer (UMI) er blevet udviklet til kvantitative og målrettede kromosomale kontakt profilering, der omgår dette problem23. Denne fremgangsmåde bruger hyppige fræsere, sonikering og en indlejret-ligation-medieret PCR-protokol, hvilket indebærer forstærkning af DNA-fragmenter med relativt ensartet længdefordeling. Denne homogenitet reducerer skævheder i forstærkningsprocessen af PCR-præferencer for kortere sekvenser og muliggør effektiv genopretning og nøjagtig optælling af rumligt forbundne molekyler/fragmenter.
Her beskriver vi en protokol, der tilpasser UMI-4C-teknikken til at identificere og kvantificere kromatinkontakter mellem promotorer og smagsforstærkere af afstamnings lærerige transskriptionsfaktorer under EB-differentiering.
Protocol
1. Embryoid kropsdannelse fra mus embryonale stamceller
- Der fremstilles mESC serumfrit dyrkningsmedium: DMEM/F12 og neurobasalt medium blandet i et forhold på 1:1. Dyrkningsmediet suppleres med MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (1x), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 U/ml), beta-mercaptoethanol (50 μM), N2 og B27 kosttilskud (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM) og leukæmihæmmer (LIF) (1.000 U/ml).
- Klargør EB-differentieringsmedium: DMEM suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS), MEM ikke-essentielle aminosyrer (1x), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 U/ml), beta-mercaptoethanol (50 μM).
- Dyrkning mESCs på 10 cm plastretter prælakeret med 0,1% (w / v) gelatine i mESC kultur serum-fri medium.
- Når mESCs når 60% sammenløb, fjernes dyrkningsmediet og vaskes forsigtigt 1x med 2 ml steriliseret PBS.
- Fjern PBS helt og tilsæt 2 ml celleløsrivelsesmedium. Kulturskålen inkuberes ved 37 °C i 5 min.
- Inaktiver reaktionen ved at tilføje 8 ml EB differentieringsmedium i skålen.
- Dissociere mESC kolonier ved pipettering op og ned 15-20 gange for at opnå en enkelt-celle suspension.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g ved stuetemperatur (RT) i 5 min, og supernatanten fjernes forsigtigt.
- Tæl celler (f.eks. ved hjælp af et hæmocytometer).
- Resuspender cellepelletmed EB differentieringsmedium og juster koncentrationen til 2 x 104 celler/ml.
- Inverter låget på en 15 cm kulturskål og brug en 200 μL multikanalpipette til at deponere 20 μL dråber resuspenderede celler (~400 celler/fald) på låget.
- Inverter låget forsigtigt på det nederste kammer og inkuber skålen med hængende dråber ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed i 3 dage.
- Opsaml EB'erne ved at vaske låget forsigtigt med 10 ml PBS og overføre den EB-holdige suspension til et 50 ml plastrør.
- Anbring røret ved RT i 30 min, så EBs vil synke til bunds ved tyngdekraften. Fjern forsigtigt supernatanten.
- Resuspender eB'erne forsigtigt med 10 ml frisk EB-differentieringsmedium og overføres til en 10 cm bakteriologisk petriskål.
- Kontroller EB-formationen 3-6 dage senere ved hjælp af et omvendt mikroskop. De producerede EB'er skal være runde og homogene i størrelse.
- Inkuber kulturerne ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed. EBs vil fortsætte med at differentiere i de tre kimlag og kan indsamles på forskellige tidspunkter til analyse.
2. Afsaetning af eB'er
- Opsaml EB'erne fra to til tre 10 cm opvask i et 50 ml plastrør. EB'erne centrifugeres ved 300 x g ved RT i 5 min, og fjern derefter forsigtigt supernatanten.
- Resuspender eBs med 10 ml PBS. Der centrifugeres EBs ved 300 x g ved RT i 3 min. og supernatanten fjernes.
- Tilføj 2 ml trypsin-EDTA (0,25%) pellet og inkuberrøret ved 37 °C i 15 min. Pipetterer op og ned hvert 3.
- Der tilsættes 8 ml EB-differentieringsmedium for at stoppe trypsinreaktionen. Kontroller EB dissociation under mikroskopet og tæl cellerne.
3. Fiksering
- Resuspender cellerne i frisk EB-dyrkningsmedium ved 1 x 106 celler/ml. For et 50 ml rør anvendes maksimalt 4,5 x 107 celler i 45 ml medium.
- Der tilsættes paraformaldehyd fra en 37% bestand (ikke ældre end 6 måneder) til en 1% endelig koncentration.
FORSIGTIG: Følg de relevante sundheds- og sikkerhedsbestemmelser, mens du håndterer paraformaldehyd, da det er et farligt kemikalie. - Inkuber i 10 min ved RT under rotation.
- Slukker formaldehyd ved at tilsætte glycin til en endelig koncentration på 0,125 M.
- Inkuber i 5 min ved RT under rotation.
- De faste celler overføres til is, og der holdes koldt ved 4 °C fra nu af.
- Pellet cellerne på 300 x g i 5 min i en nedkølet centrifuge.
- Supernatanten kasseres, og pelletsen suspenderes igen i kolde PBS (1 ml i 5 x 106 celler), hvorefter den overføres til 1,5 ml sikre låserør.
- Pelletcellerne ved 300 x g i 5 min ved 4 °C, kassér supernatanten, og fastfryse pellets i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 °C eller fortsætte med nedenstående protokol.
4. Cell lysis og begrænsning enzym fordøje
- Resuspender forsigtigt cellepelletsen i 0,25 ml frisklavet iskold lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630 og 1x proteasehæmmere) pr. 2-5 x 106 celler. Se tabel 1for at forberede 5 ml lysisbuffer .
- Inkubercellerne i 15 minutter på is.
- Der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og hold pellet, som indeholder kerner.
- Vask de pelleterede kerner med 500 μL kold lysisbuffer.
- Resuspender forsigtigt pelleten i et 1,5 ml rør med 50 μL 0,5% SDS i 1x buffer 2, hvorefter røret inkuberes i en varmeblok ved 62 °C i 10 min.
- Rørene fjernes fra varmeblokken, og der tilsættes 170 μL fordøjelsesbuffer indeholdende 25 μL 10% triton X-100 for at slukke SDS. Bland godt ved pipettering, undgå overdreven skummende.
- Inkuber ved 37 °C i 15 min.
- Der tilsættes 25 μL fordøjelsesbuffer, blandes ved invertering, og der skal udtages 8 μL som en ufordøjet kontrol. Den ufordøjede kontrolprøve opbevares ved -20 °C. Der tilsættes 100 U MboI-restriktionsenzymer (4 μL af en 25 U/μL-bestand) til de resterende kerner, og kromatinet fordøjes i 2 timer ved 37 °C under rotation. Tilføj en anden aliquot af 100 U af MboI og inkubere i yderligere 2 timer.
- Der tilsættes yderligere 100 U MboI og inkuberes under rotation natten over ved 37 °C.
- Den næste dag, tilføje en anden 100 U af MboI og inkubere i 3 timer ved 37 °C under rotation.
- Der udtages 8 μL som en fordøjet kontrolprøve. Decrosslink-fordøjede kontrolprøver og de ufordøjede kontrolprøver fra trin 4.8 ved tilsætning af 80 μL TE-buffer (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) og 10 μL proteinase K (10 mg/ml). Inkuber ved 65 °C i 1 time.
- Der køres 20 μL aliquots på en 0,6% gel for at kontrollere fordøjelseseffektiviteten. Vellykkede fordøjelser viser for det meste fragmenter i 3,0-0,5 kb rækkevidde.
5. Nærhed ligation og crosslink tilbageførsel
- Inkuber de MboI-fordøjede prøver ved 65 °C i en varmeblok i 20 minutter for at inaktivere MboI, hvorefter de afkøles til RT.
- Rørene centrifugeres i 5 min ved 1.000 x g ved RT, supernatanten fjernes, og pelleten opløses i 200 μL frisk ligasebuffer.
- Der tilsættes 1.000 μL ligationsmastermix til hver prøve. For at forberede 1.000 μL af ligationsmasterblandingen skal du se tabel 2.
- Bland ved at vende og inkubere på RT natten over med langsom rotation (9 rpm).
- Eliminer RNA- og proteinrester ved tilsætning af 100 μL proteinase K (10 mg/ml) og 10 μL RNase A (10 mg/ml). Inkuberprøver ved 55 °C i 45-60 min.
- Der fortsættes med at inkubere prøver ved 65 °C i yderligere 4 timer.
6. VALG AF DNA-klipning og størrelse
- Cool rør til RT.
- Der centrifugeres i 5 min ved 1.000 x g ved 4 °C.
- Prøven opdeles i tre 400 μL-aliquots i 2 ml rør, og der tilsættes 2 μL glykogen (20 mg/m), 40 μL natriumacetat (3 M, pH = 5,2) og 2,5 x mængder (1 ml) 100% ethanol til hvert rør. Bland ved invertering og inkubering ved -80 °C i 45-60 min.
- Der centrifugeres ved 16.000 x g ved 4 °C i 25 min. Hold rørene på is efter spinding, og supernatanten fjernes forsigtigt ved pipettering.
- DNA-pillerne vaskes ved at gensuspendere i 800 μL 70% ethanol. Der centrifugeres ved 16.000 x g ved 4 °C i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og vask igen med 800 μL 70% ethanol.
- Pelletsen opløses i 130 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter for at opløse DNA'et helt. Brug om nødvendigt pipettering til at genopslæme eventuelle bundfald.
- Mål DNA-udbyttet; 2,5-5 μg kromatin kan forventes for 1 x 106 celler. Ligationen kontrolleres ved at køre ± 200 ng af 3C-produktet på en agarosegel på 0,6%. Succesfulde ligationer viser for det meste DNA-fragmenter > 3 kb. Prøverne opbevares ved -20 °C.
- En prøve fortyndes i et 0,65 ml rør, der er egnet til sonikering, til 10 ng/μL i 100 μL 1x Tris buffervolumen (1 μg pr. rør). Den standardmængde, der anvendes til biblioteksforberedelse, er 3 μg, så udfør sonikering i tre separate rør, hvis det er nødvendigt.
- Shear DNA til en størrelse på 150-700 bp (gennemsnit = 400-500 bp) ved hjælp af følgende parametre på sonikeren: Cykler: 6-8 af 20 s på -60 s off. Dette skulle gøre DNA egnet til høj-gennemløb sekventering bibliotek forberedelse ved hjælp af Illumina sequencere.
- Overfør det vnurede DNA til et normalt nyt sikkerhedslåserør. Pool flere sonications fra den samme prøve.
- Varm en flaske DNA-rensning perler på RT. Fra nu af skal du bruge tip med lav binding.
- Tilsæt 1,8 x perlermængder til DNA-røret og resuspender forsigtigt.
- Inkuber på RT i 5 min.
- Saml perlerne med en magnetisk rack. Vask perlerne 2x med 1 ml frisklavet 80% ethanol, mens rørene opbevares i den magnetiske rist.
BEMÆRK: Fjern al ethanol, herunder restdråber. - Lufttørre perlerne kort (2-3 min) på RT.
BEMÆRK: Må ikke tørre perler, der er længere end 5 min. Dette vil reducere DNA-udbyttet. - Resuspender perlerne med 90 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for at udreve DNA'et.
- Dna-udbyttet måles, og analysér en 5 μL aliquot på en 1,5% gel. Der bør være meget lidt tab i forhold til præsoniske udbytte.
7. Bibliotekforberedelse til rækkefølge
- Der tilsættes 15 μL mastermix fra bibliotekets forberedelsessæt. For at reparere enderne af vundne DNA, kombinere 10 μL af 10x ende reparation reaktion buffer og 5 μL af ende reparation enzym mix.
- Inkuber på RT i 30 min.
- Tilsæt 1,1 x volumen af DNA rensning perler og resuspender forsigtigt.
- Inkuber på RT i 5 min.
- Saml perlerne med en magnetisk rack. Perlerne vaskes to gange med 1 ml frisklavet 80% ethanol, mens rørene opbevares i den magnetiske rist. Fjern ethanol.
- Lufttørreperlerne i 2-3 min ved RT. Resuspender perlerne med 42 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for at udrede DNA'et.
- Der tilsættes 8 μL dA-tailing mastermix til hver prøve. For at forberede dA-tailing master mix, kombinere 5 μL af 10x dA-tailing reaktion buffer og 3 μL af Klenow fragment exo minus.
- Inkuber ved 37 °C i 30 min.
- Der tilsættes 2 μL kalvtarmalkalinphosphatase (CIP) til afphosphosphorylate DNA.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 °C og derefter 60 min ved 50 °C.
- Tilsæt 1,1 x mængder af DNA-rensning perler og resuspender forsigtigt.
- Inkuber på RT i 5 min.
- Saml perlerne med en magnetisk rack. Vask perlerne 2x med 1 ml frisklavet 80% ethanol, mens rørene opbevares i den magnetiske rist.
- Lufttørrer kortvarigt perlerne (2-3 min) ved RT. Resuspender perler med 35 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for at udrev DNA'et.
- Udfør adapterligationsreaktionen. Brug reducerede adapter-/ligakoncentrationer som nævnt i tabel 3.
- Inkuber ved 20 °C i 15 min.
- Der tilsættes 3 μL af blandingen af uracil DNA glycosylase og DNA glycosylase lyase endonuclease VII (f.eks. USER) enzym, blandes ved pipettering og inkuberes ved 37 °C i 15 min.
- Forøg volumen til 100 μL med vand, kog 5 min ved 96 °C, og opbevar derefter prøverne på is.
- Tilsæt 1,1 x mængder af DNA-rensning perler og resuspender forsigtigt.
- Inkuber på RT i 5 min.
- Saml perlerne med en magnetisk rack. Vask perlerne 2x med 1 ml frisklavet 80% ethanol, mens rørene opbevares i den magnetiske rist.
- Lufttørreperlerne i 2-3 min ved RT. Resuspender perlerne med 50 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) for at udrede DNA'et.
8. 4C chromatin interaktion bibliotek forstærkning og rensning
- Forstærk 4C-biblioteket ved hjælp af 10 μL bibliotek til at udføre den første PCR. PCR-opsætningen og -programmet findes i tabel 4.
- Udfør indlejret PCR. Den indlejrede PCR-opsætning og -program findes i tabel 5.
- Pool PCR produkter til hvert bibliotek og rense med en 1,1 x DNA rensning perler.
- Mål DNA-udbyttet, og analysér en 5 μL aliquot på en 1,5% gel.
- Juster bibliotekets koncentration og sekvens biblioteket. Hvis de er indekseret, kan bibliotekerne samles før rækkefølge.
Representative Results
Seks dage efter induktionen af ESC-differentieringen i de hængende dråber opnåede vi en homogen population af EB'er, der blev anvendt til yderligere analyser (figur 1). Vi tilpassede UMI-4C-metoden23 for at kvantificere specifik kromatininteraktion hos initiativtagere til afstamningsspecifikke gener i EBs24. En skematisk oversigt over protokollen med repræsentative kvalitetskontrolgeler på forskellige trin er vist i figur 2A. Den første kvalitetskontrol blev udført for at bestemme effektiviteten af MboI-begrænsningsenzymets fordøjelse. Effektiv fordøjelse viste en fragmentstørrelse på mindre end 3 kbp (figur 2B). Bemærk, mESC og EB kromatin fordøjelsen var vanskelig og undertiden resterende ufordøjet kromatin fortsatte. Den anden kvalitetskontrol blev udført efter ligation for at kontrollere, at de fleste af fragmenterne nu var > 3 kbp (figur 2B). Derefter blev kromatinfragmenter opnået efter sonikering analyseret ved gelelektroforese. Der forventedes fragmentstørrelser på 400-500 bp (figur 2B).
Efter afphosphorylation og single-end adapter ligation, to runder af PCR blev udført for at forstærke mål af interesse. En indlejret tilgang blev brugt til at designe et sæt af to primere for hver locus. Dette bidrog til at forbedre specificiteten. Hvert mål blev forstærket separat med to forskellige primer par for at optimere PCR betingelser (dvs. primer par A og B for Pou5f1 locus og primer par C og D for T locus, henholdsvis) og resulterede i en DNA smøre omkring 400 bp (Figur 2C). Alternativt blev multiplex PCR udført for at forstærke mål A og C samtidigt (Figur 2D) og resulterede i en lignende fragmentstørrelse efter rensning (figur 2D). Primere, der anvendes til 4C bibliotek forberedelse (loci af Pou5f1 og T) kan findes i tabel 6.
Til dataanalyse blev rå sekvenseringslæsninger først justeret i forhold til refence mm10-musens genom, alle duplikeret, og læseaflæsninger af lav kvalitet (< 20) blev fjernet. For hver lokkemad blev oplysningerne om hvert restriktionsfragment indhentet ved at beregne antallet af læsefragmenter, og der blev opnået en rå kontaktprofil. Dernæst blev den pågældende region defineret som alle restriktionsfragmenter med 2 kbp og 250 kbp afstand til agn. Størrelsen af hvert restriktionsfragment blev forøget ved at samle de tilstødende restriktionfragmenter for tløbende for at udjævne profilerne, indtil en tærskel på 5 % af det samlede antal rå kontakter blev nået i den pågældende region. For at sikre, at replikaterne blev integreret, og forholdene blev sammenlignet, inkluderede vi både skråninger og tilfældige aflytninger på begrænsningsfragmentniveauet. Den gennemsnitlige profil pr. betingelse og foldændringen mellem dem blev afbildet som vist i figur 3. Under EB differentiering, kontakterne mellem smagsforstærkere og initiativtageren til pluripotency genet Pou5f1 faldt, mens forstærker-promotor kontakter mesendoderm afstamning lærerigt transskription faktor T steget (Figur 3), giver funktionel indsigt om disse udviklingsmæssige smagsforstærkere.
Figur 1: Repræsentative billeder af mESC og afledte embryoide kroppe. Dag 0 mESC dyrket under serumfrie forhold (venstre) og homogen dag 6 EBs (højre) observeret af et omvendt mikroskop. Skalabar = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 4C-arbejdsgange og repræsentative billeder af protokollens hovedtrin. (A) Skematisk arbejdsgang for den kvantitative 4C. RS = begrænsning site; US = opstrøms; DS = nedstrøms UP = universel primer; D = afstanden mellem RS og DS bør ideelt set være 5-15 bp. (B) Eksempler på MboI-fordøjet kromatin (I), in-nuclei ligated chromatin (II) og sonikeret kromatin (III). Tallene til venstre angiver de DNA-størrelser, der bestemmes af DNA-stigen for hver prøve. (C) Eksempler på PCR-forstærkning ved de to loci: Pou5f1 (primer A og B) og T (primer C og D). (D) Eksempler på multiplex-PCR-forstærkning ved Pou5f1 og T loci ved hjælp af primer A og C. ES = embryonale stamceller EB = embryoide kroppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempler på 4C-profiler. Kvantitative 4C-profiler for lokkemad på Pou5f1- og T-genpromotorerne, der er angivet i mESC'er og dag 6 EBS. T Toppanelet viser parceller med gennemsnitlige kontakter, der er genereret fra to uafhængige biologiske replikater. det nederste panel viser den gennemsnitlige ændring af kontaktfolden i dag 6-EB'er i forhold til mESC'er (gennemsnit af de to replikater). Lyseblå bokse angiver placeringen af smagsforstærkere med dynamiske ændringer under differentiering. Figur tilpasset fra Tian et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.
| For 5 ml | |
| 1M Tris-HCl, pH8.0 | 50 μL |
| 5M NaCl | 10 μL |
| 10% Igepal CA630 | 100 μL |
| 50x Roche komplet protease hæmmere | 100 μL |
| MilliQ Vand | 4,74 ml |
Tabel 1: Lysis-buffer.
| For 1000 μL | |
| MilliQ Vand | 869 μL |
| 10x NEB T4 DNA Ligase Buffer | 120 μL |
| 20mg/mL Kvæg Serum Albumin | 6 μL |
| 2000 U/μL T4 DNA Ligase | 5 μL |
Tabel 2: Ligation master mix forberedelse.
| For 15 μL | |
| 5X hurtig ligationsreaktionsbuffer | 10 μL |
| NEBNext adapter | 3 μL |
| Hurtig T4 DNA ligase | 2 μL |
Tabel 3: Reaktion på adapterligation.
| PCR-opsætning | |
| Adapter ligated bibliotek-on-deads | 10 μL |
| PCR-vand | 20,25 μL |
| 10 μM Målspecifik primer | 3,75 μL |
| 10 μM NEB Index primer | 3,75 μL |
| Herculase II 5X buffer | 10 μL |
| 10 mm dNTPs | 1,25 μL |
| Herculase II polymerase | 1 μL |
| Volumen i alt | 50 μL |
| PCR-program | |
| Trin 1: 98 °C - 2 min | |
| Trin 2: 98 °C - 20'erne | |
| Trin 3: 65 °C - 30'erne | |
| Trin 4: 72 °C - 45s | |
| Trin 5: gå til trin 2 for at lave i alt 15-18 cyklusser | |
| Trin 6: 72 °C - 3 min | |
| Trin 7: 4 °C – hold |
Tabel 4: 4C chromatin interaktion bibliotek forstærkning, første PCR.
| Indlejret PCR-opsætning | |
| DNA-fragment fra den første PCR | 10 μL |
| PCR-vand | 20,25 μL |
| 10 μM specifik primer+P5 Illumina primer | 3,75 μL |
| 10 μM P7 Illumina primer | 3,75 μL |
| Herculase II 5X buffer | 10 μL |
| 10 mm dNTPs | 1,25 μL |
| Herculase II polymerase | 1 μL |
| Volumen i alt | 50 μL |
| Indlejret PCR-program | |
| Trin 1: 98 °C - 2 min | |
| Trin 2: 98 °C - 20'erne | |
| Trin 3: 65 °C - 30'erne | |
| Trin 4: 72 °C - 45s | |
| Trin 5: gå til trin 2 for at lave i alt 15-18 cyklusser | |
| Trin 6: 72 °C - 3 min | |
| Trin 7: 4 °C – hold |
Tabel 5: 4C chromatin interaktion bibliotek forstærkning, indlejret PCR.
| Navn | Rækkefølge (5'-3') |
| DS-Oct4-A | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAAGCGCCCCCAG |
| US-Oct4-A | TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC |
| DS-Oct4-B | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCGCGCTGGAGCCGGGCT |
| US-Oct4-B | ACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCGCGCT |
| DS-T-C | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC |
| US-T-C | GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA |
| DS-T-D | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG |
| US-T-D | GCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC |
| OP-4C | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
| Adap-i1 | CAAGCAGAAGACGGCACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i3 | CAAGCAGAAGAAGAGCGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i4 | CAAGCAGAAGACGGCACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
Tabel 6: Primere, der anvendes til forberedelse af 4C-biblioteket.
Discussion
Metoden til hængende dråbekultur kræver ikke yderligere vækstfaktorer eller cytokiner og genererer på en måde homogen population5af EB'er fra et forudbestemt antal mES5 . Her beskriver vi en protokol af kvantitative 4C tilpasset fra UMI-4C tilgang til at kvantificere forstærker-promotor kontakt af afstamning specifikke transskription faktorer i EB differentiering model. Vi identificerede chromatin regioner, der kontakter initiativtagere til Pou5f1 og T gener på en dynamisk måde under EB differentiering. Pou5f1 blev downregulated under EB differentiering og kontaktfrekvensen mellem Pou5f1 promotor og dens distale forstærker faldt. Omvendt blev T upregulated under EB differentiering, og vi identificerede tre smagsforstærkere, for hvilke kontaktfrekvenser med deres promotor er faldet (figur 3). For at bekræfte identifikationen kan der udføres en chromatinimmunudfældning (ChIP) af aktiv histonmærke H3K27ac24, da dette histonmærke har vist sig at være forbundet med forstærkeraktivering, og smagsforstærkere mister dette mærke under deres inaktivering11.
En standard 4C-teknik er blevet grundigt anvendt til at undersøge kromatinkontaktprofilen for specifikke genomiske steder25. Denne fremgangsmåde er imidlertid vanskelig at fortolke kvantitativt, selv efter en omfattende normaliseringaf 26,27,28 pågrund af de skævheder, der er indført ved pcr-fragmenterets heterogenitet og den manglende mulighed for at skelne pcr-dubletter. Vores kvantitative 4C-metode er stort set identisk med UMI-4C-teknikken, der gør det muligt at kvantificere enkelte molekyler ved hjælp af sonikering og et indlejret-ligation-medieret PCR-trin for at omgå begrænsningen af den klassiske 4C-tilgang23. Men i modsætning til UMI-4C, der bruger unikke molekylære identifikatorer, tillader vores kvantitative 4C-protokol kvantificering af enkelte molekyler baseret på den specifikke DNA-brud, der frembringes af sonikeringstrinnet. Det gør vores protokol kompatibel med kommercielle DNA bibliotek forberedelse kits, undgå behovet for primere med unikke molekylære identifikatorer.
Vores protokol omfatter flere vigtige skridt, der bør overvejes. Som i den klassiske 4C metode28, kritiske faktorer i vores protokol er effektiviteten af fordøjelsen og ligation under udarbejdelsen af 3C molekyler. Lav fordøjelse/ ligation effektivitet kan dramatisk mindske kompleksiteten af interaktion med et fragment af interesse, hvilket resulterer i en reduceret opløsning. Som tidligere beskrevet23, et andet kritisk skridt i protokollen er udformningen af primere til biblioteket forstærkning. Den anden PCR reaktion primere bør være placeret 5-15 nt fra den afhørte begrænsning site. I en 75 nt sekvensering læse, giver dette mulighed for mindst 40 nt tilbage af fange længde for kortlægning. Den primer, der anvendes i den første PCR-reaktion, skal konstrueres opstrøms for den anden primer uden overlapning, og begge bør være specifikke nok til at sikre effektiv DNA-forstærkning. Ved multipleksning skal primere konstrueres uafhængigt med henblik på en smeltetemperatur (Tm)på 60-65 °C. Som for andre 3C-teknikker bestemmes opløsningen af den kvantitative 4C-metode desuden af det restriktionsenzym, der anvendes i protokol25. Denne protokol bruger et restriktionsenzym med et 4 bp-genkendelsessted, MboI. Den maksimale opløsning med dette enzym er omkring 500 bp, men dette er meget locus afhængige og sjældent opnået. En anden begrænsning er, at interaktioner, der forekommer mellem elementer, der er placeret i det samme begrænsningsfragment, ikke kan spores. Desuden kan interaktioner, der finder sted i en afstand af ét begrænsningssted, ikke skelnes fra den ufordøjede baggrund. Brugen af et indfyldningstrin før ligation kan gøre det muligt at påvise disse interaktioner.
Kvantitativ 4C er ideel til at afhøre kromatin kontakter af målrettede loci. Men det specifikke PCR-forstærkningstrin begrænser antallet af loci, der kan undersøges samtidigt. En måde at øge antallet af målrettede loci er at multiplex PCR trin til samtidig forstærke flere mål, men dette kræver kompatibilitet af de anvendte primere og teste hver primer par før gennemførelsen. Hvis der ønskes globale ændringer af kromatinarkitektur hos initiativtagerne, vil genom-dækkende tilgange som Hi-C, PC Hi-C eller HiChIP være merehensigtsmæssige 29,30,31.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke F. Le Dily, R. Stadhouders og medlemmer af Graf laboratoriet for deres råd og diskussioner. G.S. blev støttet af et Marie Sklodowska-Curie-stipendium (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T af et postdoc-stipendium fra Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Dette arbejde blev støttet af Detth Europæiske Forskningsråd under 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martello, G., Smith, A. The nature of embryonic stem cells. Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International. 2012, 738910 (2012).
- Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).
- Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).
- Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).
- Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
- Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Lettice, L. A., et al. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
- van de Werken, H. J., et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).
- Schwartzman, O., et al. UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling. Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).
- Tian, T. V., et al. Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification. Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).
- Chen, H., et al. Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity. Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).
- Apostolou, E., et al. Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).
- de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).
- Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. 4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis. Methods. , (2019).
- Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
