Summary
Wir berichten über die Anwendung der quantitativen Chromosomenkonformationsaufnahme, gefolgt von einer Hochdurchsatzsequenzierung in embryonalen Körpern, die aus embryonalen Stammzellen erzeugt werden. Diese Technik ermöglicht es, die Kontakte zwischen vermeintlichen Enhancern und Promotorregionen eines bestimmten Gens während der embryonalen Stammzelldifferenzierung zu identifizieren und zu quantitieren.
Abstract
Während der Entwicklung von Säugetieren werden Zellschicksale durch den Aufbau von regulatorischen Netzwerken bestimmt, die die Spezifität, den Zeitpunkt und die räumlichen Muster der Genexpression definieren. Embryoide Körper (EBs), die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, waren ein beliebtes Modell, um die Differenzierung der drei wichtigsten Keimschichten zu untersuchen und regulatorische Schaltkreise während der Zellschicksalsspezifikation zu definieren. Obwohl bekannt ist, dass gewebespezifische Enhancer in diesen Netzwerken eine wichtige Rolle spielen, indem sie mit Promotoren interagieren, bleibt die Zuordnung zu ihren relevanten Zielgenen eine Herausforderung. Um dies zu ermöglichen, sind quantitative Ansätze erforderlich, um Kontakte zwischen Enhancer und Promoter und deren Dynamik während der Entwicklung zu untersuchen. Hier haben wir eine 4C-Methode angepasst, um Enhancer und deren Kontakte mit Cognate-Promotern im EB-Differenzierungsmodell zu definieren. Die Methode verwendet häufig Schneiden Vonrestriktionsenzyme, Beschallung und ein verschachteltes Ligations-vermitteltes PCR-Protokoll, das mit kommerziellen DNA-Bibliotheksvorbereitungskits kompatibel ist. Anschließend werden die 4C-Bibliotheken einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen und bioinformatisch analysiert, was die Erkennung und Quantifizierung aller Sequenzen ermöglicht, die Kontakte zu einem ausgewählten Promotor haben. Die resultierenden Sequenzierungsdaten können auch verwendet werden, um Informationen über die Dynamik von Enhancer-Promoter-Kontakten während der Differenzierung zu erhalten. Die für das EB-Differenzierungsmodell beschriebene Technik ist einfach zu implementieren.
Introduction
Bei Mäusen enthält die innere Zellmasse (ICM) von 3,5 Tage alten Embryonen embryonale pluripotente Stammzellen. Das ICM entwickelt sich an Tag 4.5 weiter zum Epiblast und erzeugt Ektoderm-, Mesoderm- und Endodermzellen, die drei wichtigsten Keimschichten im Embryo. Obwohl pluripotente Zellen im ICM nur vorübergehend in vivo existieren, können sie in der Kultur durch die Etablierung von mausembryonalen Stammzellen (mESCs)1,2,3erfasst werden. Die mESCs bleiben in einem undifferenzierten Zustand und vermehren sich auf unbestimmte Zeit, aber bei intrinsischen und extrinsischen Reizen sind sie auch in der Lage, den Pluripotenzzustand zu verlassen und Zellen der drei Entwicklungskeimschichten2,4zu erzeugen. Interessanterweise bilden mESCs, wenn sie in Suspension in kleinen Tröpfchen kultiviert werden, dreidimensionale Aggregate (d.h. EBs), die sich in alle drei Keimschichten differenzieren5. Der EB-Formationstest ist ein wichtiges Werkzeug, um den frühen Linienspezifikationsprozess zu untersuchen.
Während der Abstammungsspezifikation erhalten Zellen jeder Keimschicht ein spezifisches Genexpressionsprogramm4. Die präzise räumlich-zeitliche Expression von Genen wird durch verschiedene cis-regulatorische Elemente reguliert, einschließlich Kernpromotoren, Enhancer, Schalldämpfer und Isolatoren6,7,8,9. Enhancer, regulatorische DNA-Segmente, die sich typischerweise über ein paar hundert Basenpaare erstrecken, koordinieren die gewebespezifische Genexpression8. Enhancer werden durch Bindung von Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren, die die8lokale Chromatinstruktur regulieren 8,10, aktiviert oder zum Schweigen gebracht. Häufig verwendete Techniken zur Identifizierung vermeintlicher Enhancer sind genomweite Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq) und dem Assay für transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungstechniken (ATAC-seq). So zeichnen sich aktive Enhancer durch spezifische aktive Histonmarkierungen und durch erhöhte lokale DNA-Zugänglichkeit11,12,13,14aus. Darüber hinaus wird angenommen, dass Entwicklungsförderer physische Interaktion mit ihrem Kognatenpromotor8,9erfordern. In der Tat hat sich gezeigt, dass Enhancer-Varianten und Löschungen, die Enhancer-Promoter-Kontakte stören, zu Entwicklungsfehlbildungen führen können15. Daher sind neuartige Techniken erforderlich, die zusätzliche Informationen für die Identifizierung funktioneller Enhancer liefern, die die Entwicklung der Genexpression steuern.
Seit der Entwicklung der Chromosomenkonformationsaufnahme (3C) Technik16wird die Kartierung von Chromosomenkontakten intensiv genutzt, um den physikalischen Abstand zwischen regulatorischen Elementen zu bewerten. Wichtig ist, dass vor kurzem Hochdurchsatzvarianten von 3C-Techniken entwickelt wurden, die verschiedene Strategien für die Fixierung, Verdauung, Ligation und Wiederherstellung von Kontakten zwischen Chromatinfragmenten17bieten. Unter ihnen, in situ Hi-C hat sich zu einer beliebten Technik ermöglicht die Sequenzierung von 3C Ligation Produkte genom-wide18. Die hohen Sequenzierungskosten, die erforderlich sind, um eine Fürdengeeignete Lösung für die Analyse von Enhancer-Promoter-Kontakten zu erreichen, machen diese Technik jedoch für die Untersuchung bestimmter Loci unpraktisch. Daher wurden alternative Methoden entwickelt, um gezielte Loci mit höherer Auflösung19,20,21,22zu analysieren. Eine dieser Methoden, nämlich 4C, bekannt als eine gegen alle Strategie, ermöglicht die Erkennung aller Sequenzen, die eine Website kontaktieren, die als Ansichtspunkt ausgewählt wurde. Ein Nachteil der Standard-4C-Technik ist jedoch die erforderliche inverse PCR, die Fragmente unterschiedlich großer Größe verstärkt, kleine Produkte begünstigt und die Quantifizierung nach Hochdurchsatzsequenzierung verzerrt. Kürzlich wurde UMI-4C, eine neue Variante der 4C-Technik mit einzigartigen molekularen Identifikatoren (UMI) für quantitative und gezielte chromosomale Kontaktprofilierung entwickelt, die dieses Problem umgeht23. Dieser Ansatz verwendet vielschneider, Beschallung und ein verschachteltes, ligationsvermitteltes PCR-Protokoll, wodurch DNA-Fragmente mit relativ gleichmäßiger Längenverteilung verstärkt werden. Diese Homogenität reduziert Verzerrungen im Amplifikationsprozess von PCR-Präferenzen für kürzere Sequenzen und ermöglicht eine effiziente Rückgewinnung und genaue Zählung räumlich verbundener Moleküle/Fragmente.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die UMI-4C-Technik anpasst, um Chromatinkontakte zwischen Promotoren und Enhancer von lineage instruktiven Transkriptionsfaktoren während der EB-Differenzierung zu identifizieren und zu quantifizieren.
Protocol
1. Embryoide Körpererzeugung aus embryonalen Stammzellen der Maus
- Bereiten Sie mESC serumfreies Kulturmedium vor: DMEM/F12 und neurobasales Medium gemischt im Verhältnis 1:1. Das Kulturmedium wird ergänzt durch MEM-Unessentielle Aminosäurelösung (1x), Natriumpyruvat (1 mM), L-Glutamin (2 mM), Penicillin-Streptomycin (100 U/ml), Beta-Mercaptoethanol (50 M), N2- und B27-Ergänzungen (1x), PD0325901 (1 M), CHIR99021 (3 M) und Leukämie-Hemmfaktor (LIF) (1.000 U/ml).
- Eb-Differenzierungsmedium vorbereiten: DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), MEM nicht essentiellen Aminosäuren (1x), Natriumpyruvat (1 mM), L-Glutamin (2 mM), Penicillin-Streptomycin (100 U/ml), Beta-Mercaptoethanol (50 mM).
- Kultur mESCs auf 10 cm Kunststoffschalen, vorbeschichtet mit 0,1% (w/v) Gelatine in mESC Kulturserum-freiem Medium.
- Wenn mESCs 60% Koninfluenza erreichen, Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie vorsichtig 1x mit 2 ml sterilisiertem PBS.
- Entfernen Sie PBS vollständig und fügen Sie 2 ml Zellablösungsmedium hinzu. Das Kulturgericht bei 37 °C für 5 min bebrüten.
- Inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie 8 ml EB-Differenzierungsmedium in die Schale einfügt.
- Dissoziieren Sie mESC-Kolonien, indem Sie 15-20-mal nach oben und unten pfeifen, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT) bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Zählzellen (z. B. mit einem Hämozytometer).
- Setzen Sie das Zellpellet mit EB-Differenzierungsmedium wieder auf und stellen Sie die Konzentration auf 2 x 104 Zellen/ml ein.
- Invertieren Sie den Deckel einer 15 cm großen Kulturschale und verwenden Sie eine 200-L-Mehrkanalpipette, um 20 L Tropfen resuspendierter Zellen (ca. 400 Zellen/Tropfen) auf den Deckel zu legen.
- Den Deckel vorsichtig auf die Unterkammer umkehren und die Schale mit hängenden Tropfen bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 3 Tage inkubieren.
- Sammeln Sie die EBs, indem Sie den Deckel vorsichtig mit 10 ml PBS waschen und die EB-haltige Suspension auf ein 50 ml Kunststoffrohr übertragen.
- Legen Sie das Rohr 30 min bei RT, damit die EBs durch die Schwerkraft auf den Boden sinken. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Die EBs vorsichtig mit 10 ml frischem EB-Differenzierungsmedium aussetzen und auf eine 10 cm bakteriologische Petrischale übertragen.
- Überprüfen Sie die EB-Bildung 3-6 Tage später mit einem invertierten Mikroskop. Die erzeugten EBs sollten rund und homogen sein.
- Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit. EBs werden weiterhin in die drei Keimschichten differenzieren und können zu verschiedenen Zeitpunkten für die Analyse gesammelt werden.
2. Dissoziation von EBs
- Sammeln Sie die EBs von zwei bis drei 10 cm Geschirr in einem 50 ml Kunststoffrohr. Zentrifugieren Sie die EBs bei 300 x g bei RT für 5 min, dann entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Setzen Sie die EBs mit 10 ml PBS aus. Zentrifuge EBs bei 300 x g bei RT für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
- 2 ml Trypsin-EDTA hinzufügen (0,25%) und bebrüten das Rohr bei 37 °C für 15 min. Pipette alle 3 min nach oben und unten, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
- Fügen Sie 8 ml EB-Differenzierungsmedium hinzu, um die Trypsin-Reaktion zu stoppen. Überprüfen Sie die EB-Dissoziation unter dem Mikroskop und zählen Sie die Zellen.
3. Fixierung
- Setzen Sie die Zellen in frischem EB-Kulturmedium bei 1 x 106 Zellen/ml aus. Für ein 50 ml Rohr maximal 4,5 x 107 Zellen in 45 ml Medium verwenden.
- Fügen Sie Paraformaldehyd aus einem 37%-Bestand (nicht älter als 6 Monate) zu einer Endkonzentration von 1 % hinzu.
VORSICHT: Befolgen Sie beim Umgang mit Paraformaldehyd die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften, da es sich um eine gefährliche Chemikalie handelt. - 10 min bei RT unter Rotation inkubieren.
- Das Formaldehyd durch Zugabe von Glycin auf eine Endkonzentration von 0,125 M ablöschen.
- 5 min bei RT unter Rotation inkubieren.
- Die festen Zellen auf Eis übertragen und von nun an bei 4 °C kalt halten.
- Pellet die Zellen bei 300 x g für 5 min in einer gekühlten Zentrifuge.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in kalten PBS (1 ml für 5 x 106 Zellen) wieder auf, und übertragen Sie es dann in 1,5 ml Sicherverriegelungsrohre.
- Pellet die Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, und fangen Sie die Pellets in flüssigem Stickstoff ein. Bei -80 °C lagern oder mit dem untenstehenden Protokoll fortfahren.
4. Zelllyse und Restriktionsenzym-Digest
- Das Zellpellet in 0,25 ml frisch zubereitetem eiskalten Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630 und 1x Proteaseinhibitoren) pro 2-5 x 106 Zellen vorsichtig wieder aufsetzen. Informationen zur Vorbereitung von 5 ml Lysepuffer finden Sie in Tabelle 1.
- Inkubieren Sie die Zellen für 15 min auf Eis.
- Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf, das die Kerne enthält.
- Waschen Sie die pelletierten Kerne mit 500 L kalter Lysepuffer.
- Das Pellet in einem 1,5 ml-Rohr mit 50 l 0,5% SDS in 1x Puffer 2 vorsichtig wieder aufhängen, dann das Rohr in einem Heizblock bei 62 °C für 10 min inkubieren.
- Entfernen Sie die Rohre aus dem Heizblock und fügen Sie 170 L Verdauungspuffer mit 25 L von 10% Triton X-100 hinzu, um das SDS zu löschen. Mischen Sie gut durch Pipettieren, Vermeidung von übermäßigem Schäumen.
- Bei 37 °C für 15 min inkubieren.
- Fügen Sie 25 L Verdauungspuffer hinzu, mischen Sie sie durch Invertieren, und nehmen Sie 8 L als unverdaute Kontrolle. Halten Sie die unverdaute Kontrollprobe bei -20 °C. Fügen Sie den verbleibenden Kernen 100 U MboI-Restriktionsenzym (4 L eines 25-U/L-Bestands) hinzu und verdauen Sie das Chromatin für 2 h bei 37 °C unter Rotation. Fügen Sie ein weiteres Aliquot von 100 U von MboI hinzu und brüten Sie für weitere 2 h.
- Fügen Sie weitere 100 U mboI hinzu und inkubieren Sie unter Rotation über Nacht bei 37 °C.
- Am nächsten Tag weitere 100 U MboI hinzufügen und 3 h bei 37 °C unter Rotation brüten.
- Nehmen Sie 8 l als verdaute Kontrollprobe. De-Crosslink-verdaute Kontrollproben und die unverdauten Kontrollproben ab Schritt 4.8 durch Zugabe von 80 l TE-Puffer (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) und 10 l Proteinase K (10 mg/ml). Bei 65 °C für 1 h inkubieren.
- Führen Sie 20 L Aliquots auf einem 0,6%-Gel aus, um die Verdauungseffizienz zu überprüfen. Erfolgreiche Verdauungen zeigen meist Fragmente im Bereich von 3,0-0,5 kb.
5. Proximity Ligation und Crosslink-Umkehr
- Die MboI-verdauten Proben bei 65 °C in einem Heizblock 20 min inkubieren, um MboI zu inaktivieren, und dann auf RT abkühlen.
- Zentrifugieren Sie die Rohre für 5 min bei 1.000 x g bei RT, entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 200 l frischer Ligasepuffer auf.
- Fügen Sie jeder Probe 1.000 L des Ligationsmaster-Mix hinzu. Zur Vorbereitung von 1.000 l des Ligationsmaster-Mixes siehe Tabelle 2.
- Mischen Sie durch Invertieren und inkubieren Bei RT über Nacht mit langsamer Drehung (9 Rpm).
- Eliminieren Sie RNA- und Proteinrückstände, indem Sie 100 l Proteinase K (10 mg/ml) und 10 l RNase A (10 mg/ml) hinzufügen. Inkubieren Sie Proben bei 55 °C für 45-60 min.
- Inkubationsproben bei 65 °C für weitere 4 h fortsetzen.
6. DNA-Scheren und Größenauswahl
- Kühlrohre zu RT.
- Zentrifuge für 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C.
- Teilen Sie die Probe in drei 400 L-Aliquots in 2 ml-Röhrchen auf und fügen Sie jedem Rohr 2 l Glykogen (20 mg/m), 40 l Natriumacetat (3 M, pH = 5,2) und 2,5x (1 ml) 100 % Ethanol hinzu. Mischen Sie durch Invertieren und inkubieren bei -80 °C für 45-60 min.
- Zentrifuge bei 16.000 x g bei 4 °C für 25 min. Halten Sie die Rohre nach dem Spinnen auf Eis und entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipetten.
- Waschen Sie die DNA-Pellets, indem Sie in 800 l 70% Ethanol wieder aufhängen. Zentrifuge bei 16.000 x g bei 4 °C für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und führen Sie die Wäsche noch einmal mit 800 l 70% Ethanol aus.
- Lösen Sie das Pellet in 130 l 1x Tris Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) und inkubieren Bei 37 °C für 15 min, um die DNA vollständig aufzulösen. Verwenden Sie ggf. Pipettierung, um den Niederschlag wieder auszusetzen.
- Messen Sie die DNA-Ausbeute; Für 1 x 106 Zellen ist mit 2,5-5 g Chromatin zu rechnen. Überprüfen Sie die Ligation, indem Sie 200 ng des 3C-Produkts auf einem 0,6%igen Agarose-Gel laufen. Erfolgreiche Ligationen zeigen meist DNA-Fragmente > 3 kb. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.
- Verdünnen Sie eine Probe in einem 0,65 ml-Rohr, das für die Beschallung geeignet ist, auf 10 ng/l in 100 l 1x Tris-Puffervolumen (1 g pro Tube). Die Standardmenge, die für die Bibliotheksvorbereitung verwendet wird, beträgt 3 g, also führen Sie die Beschallung bei Bedarf in drei separaten Röhren durch.
- Scher-DNA bis zu einer Größe von 150-700 bp (Durchschnitt = 400-500 bp) mit den folgenden Parametern auf dem Beschallungsmittel: Zyklen: 6-8 von 20 s auf -60 s aus. Dadurch sollte die DNA für die Vorbereitung von Bibliothekspräparationen mit hohem Durchsatz mit Illumina-Sequenzern geeignet sein.
- Übertragen Sie die geerschende DNA in eine normale neue sichere Röhre. Pool mehrere Beschallungen aus dem gleichen Sample.
- Erwärmen Sie eine Flasche DNA-Reinigungsperlen bei RT. Verwenden Sie von nun an niedrige Bindungstipps.
- 1,8-fache Mengen Perlen in die DNA-Röhre geben und sanft wieder aufsetzen.
- Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Rack. Waschen Sie die Perlen 2x mit 1 ml frisch zubereitetem 80% Ethanol, während die Rohre im Magnetischen Rack gehalten werden.
HINWEIS: Entfernen Sie alle Ethanol, einschließlich Resttröpfchen. - Die Perlen kurz (2-3 min) bei RT abtrocknen.
HINWEIS: Trocknen Sie Perlen nicht länger als 5 min. Dies verringert die DNA-Ausbeute. - Setzen Sie die Perlen mit 90 l 1x Tris Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) wieder auf, um die DNA zu entkernen.
- Messen Sie die DNA-Ausbeute und analysieren Sie einen 5-L-Aliquot auf einem 1,5%-Gel. Im Vergleich zur Vorschallungsausbeute sollte es sehr wenig Verlust geben.
7. Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung
- Fügen Sie 15 L Master-Mix aus dem Bibliotheksvorbereitungskit hinzu. Um die Enden der verscherten DNA zu reparieren, kombinieren Sie 10 l 10x 10x End-Reparatur-Reaktionspuffer und 5 l End-Reparatur-Enzym-Mix.
- Inkubieren Bei RT für 30 min.
- 1,1x Volumen dna-Reinigungsperlen hinzufügen und sanft wieder anhalten.
- Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Rack. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml frisch zubereitetem 80% Ethanol, während die Rohre im magnetischen Rack gehalten werden. Entfernen Sie Ethanol.
- Die Perlen für 2-3 min bei RT lufttrocknen. Die Perlen mit 42 l 1x Tris Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) aussetzen, um die DNA zu entkernen.
- Fügen Sie jeder Probe 8 L dA-tailing Master-Mix hinzu. Zur Vorbereitung des dA-tailing Master-Mix 5 l 10x dA-tailing Reaktionspuffer und 3 'L Klenow Fragment exo minus kombinieren.
- Bei 37 °C für 30 min inkubieren.
- Fügen Sie der DNA des Dephosphorylats 2 L intestinale alkalische Phosphatase (CIP) hinzu.
- 30 min bei 37 °C inkubieren, dann 60 min bei 50 °C.
- 1,1x Volumen DNA-Reinigungsperlen hinzufügen und sanft wieder anhalten.
- Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Rack. Waschen Sie die Perlen 2x mit 1 ml frisch zubereitetem 80% Ethanol, während die Rohre im Magnetischen Rack gehalten werden.
- Die Perlen kurz (2-3 min) bei RT abtrocknen. Perlen mit 35 l 1x Tris Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) aufheben, um die DNA zu entkernen.
- Führen Sie die Adapterligationsreaktion aus. Verwenden Sie reduzierte Adapter-/Ligasekonzentrationen, wie in Tabelle 3erwähnt.
- Bei 20 °C für 15 min inkubieren.
- Fügen Sie 3 L des Gemischs aus Uracil-DNA-Glykosyllase und DNA-Glykosylase-Endonuklease VII (z. B. USER)-Enzym hinzu, mischen Sie sie durch Pipettieren und inkubieren Sie 15 min bei 37 °C.
- Erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 l, kochen Sie 5 min bei 96 °C, und halten Sie die Proben dann auf Eis.
- 1,1x Volumen DNA-Reinigungsperlen hinzufügen und sanft wieder anhalten.
- Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Rack. Waschen Sie die Perlen 2x mit 1 ml frisch zubereitetem 80% Ethanol, während die Rohre im Magnetischen Rack gehalten werden.
- Die Perlen für 2-3 min bei RT lufttrocknen. Die Perlen mit 50 l 1x Tris Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) aussetzen, um die DNA zu entkernen.
8. 4C Chromatin Interaktion Bibliothek Verstärkung und Reinigung
- Verstärken Sie die 4C-Bibliothek mit 10 L Bibliothek, um die erste PCR durchzuführen. Das PCR-Setup und -Programm finden Sie in Tabelle 4.
- Führen Sie verschachtelte PCR aus. Das verschachtelte PCR-Setup und -Programm finden Sie in Tabelle 5.
- Bündeln Sie PCR-Produkte für jede Bibliothek und reinigen Sie sie mit einer 1,1-fachen DNA-Reinigungsperlen.
- Messen Sie die DNA-Ausbeute und analysieren Sie einen 5-L-Aliquot auf einem 1,5%-Gel.
- Passen Sie die Bibliothekskonzentration an und sequenzieren Sie die Bibliothek. Wenn die Bibliotheken indiziert sind, können sie vor der Sequenzierung gepoolt werden.
Representative Results
Sechs Tage nach der Induktion der ESC-Differenzierung in den hängenden Tropfen erhielten wir eine homogene Population von EBs, die für weitere Analysen verwendet wurden (Abbildung 1). Wir haben die UMI-4C-Methode23 angepasst, um die spezifische Chromatin-Interaktion an Promotoren von linienspezifischen Genen in EBs24zu quantifizieren. Eine schematische Übersicht über das Protokoll mit repräsentativen Qualitätskontrollgelen in verschiedenen Schritten ist in Abbildung 2Adargestellt. Die erste Qualitätskontrolle wurde durchgeführt, um die Effizienz der MboI-Restriktionsenzymverdauung zu bestimmen. Die effiziente Verdauung ergab eine Fragmentgröße von weniger als 3 kbp (Abbildung 2B). Bemerkenswert ist, dass die MESC- und EB-Chromatinverdauung schwierig war und manchmal noch unverdautes Chromatin fortbesteht. Die zweite Qualitätskontrolle wurde nach der Ligation durchgeführt, um zu überprüfen, ob die meisten Fragmente jetzt > 3 kbp waren (Abbildung 2B). Anschließend wurden Chromatinfragmente, die nach der Beschallung erhalten wurden, durch Gelelektrophorese analysiert. Es wurden Fragmentgrößen von 400-500 bp erwartet (Abbildung 2B).
Nach Dephosphorylierung und Single-End-Adapterligation wurden zwei Runden PCR durchgeführt, um die Ziele des Interesses zu verstärken. Ein verschachtelter Ansatz wurde verwendet, um einen Satz von zwei Primern für jeden Locus zu entwerfen. Dies trug zur Verbesserung der Spezifität bei. Jedes Ziel wurde separat mit zwei verschiedenen Primerpaaren verstärkt, um die PCR-Bedingungen zu optimieren (d. h. die Primerpaare A und B für die Pou5f1-Lokus- und Primerpaare C bzw. D für den T-Lokus) und führte zu einem DNA-Abstrich um 400 bp(Abbildung 2 T C). Alternativ wurde Multiplex-PCR durchgeführt, um die Ziele A und C gleichzeitig zu verstärken (Abbildung 2D) und führte nach der Reinigung zu einer ähnlichen Fragmentgröße (Abbildung 2D). Primer, die für die 4C-Bibliotheksvorbereitung verwendet werden (loci von Pou5f1 und T) finden Sie in Tabelle 6.
Für die Datenanalyse wurden Rohsequenzierungslesevorgänge zuerst an dem Refence mm10-Mausgenom ausgerichtet, alle dupliziert und Lesevorgänge mit geringer Qualität (< 20) entfernt. Für jeden Köder wurden die Informationen zu jedem Restriktionsfragment durch Berechnung der Anzahl der Lesefragmente und ein rohes Kontaktprofil ermittelt. Als Nächstes wurde der Interessenbereich als alle Einschränkungsfragmente mit 2 kbp und 250 kbp Abstand zum Köder definiert. Die Größe jedes Einschränkungsfragments wurde erhöht, indem die angrenzenden Einschränkungsfragmente sequenziell aggregiert wurden, um die Profile zu glätten, bis im Interessenbereich ein Schwellenwert von 5 % der Gesamtzahl der Rohkontakte erreicht wurde. Um sicherzustellen, dass die Replikationen integriert und die Bedingungen verglichen wurden, haben wir sowohl Steigungen als auch zufällige Abfangen auf der Ebene des Restriktionsfragments aufgenommen. Das durchschnittliche Profil pro Bedingung und die Faltung zwischen ihnen wurden dargestellt, wie in Abbildung 3dargestellt. Während der EB-Differenzierung verringerten sich die Kontakte zwischen den Enhancern und dem Promotor des Pluripotenzgens Pou5f1, während die Enhancer-Promoter-Kontakte des mesendoderm Lineage-Instruktionsfaktors T erhöhten (Abbildung 3), was funktionelle Einblicke über diese Entwicklungsförderer lieferte.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von mESC und abgeleiteten embryoiden Körpern. Tag 0 mESC kultiviert unter serumfreien Bedingungen (links) und homogenen Tag 6 EBs (rechts), beobachtet von einem invertierten Mikroskop. Skala Bar = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: 4C-Workflow und repräsentative Abbilder der wichtigsten Schritte des Protokolls. (A) Schematischer Workflow des quantitativen 4C. RS = Einschränkungssite; US = vorgelagert; DS = nachgeschaltet; UP = Universalgrundierung; D = der Abstand zwischen RS und DS sollte idealerweise 5-15 bp betragen. (B) Beispiele für MboI-verdautes Chromatin (I), in-nuklei ligiertes Chromatin (II) und beschalltes Chromatin (III). Die Zahlen auf der linken Seite zeigen die DNA-Größen an, die durch die DNA-Leiter für jede Probe bestimmt werden. (C) Beispiele für PCR-Verstärkung an den beiden Loci: Pou5f1 (Primer A und B) und T (Primer C und D). (D) Beispiele für Multiplex-PCR-Verstärkung bei Pou5f1 und T loci mit den Primern A und C. ES = embryonale Stammzellen; EB = embryoide Körper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiele für 4C-Profile. Quantitative 4C-Profile für Köder auf den Pou5f1- und T-Genpromotoren, die in mESCs und Tag 6 EBS nachgewiesen werden. T Das obere Panel zeigt Diagramme mit durchschnittlichen Kontakten, die aus zwei unabhängigen biologischen Replikationen generiert wurden; Das untere Panel zeigt die durchschnittliche Kontaktfaltenänderung von Tag 6 EBs im Vergleich zu mESCs (Durchschnitt der beiden Replikationen). Hellblaue Felder zeigen die Position von Enhancern mit dynamischen Änderungen während der Differenzierung an. Figur angepasst von Tian et al.24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Für 5ml | |
| 1M Tris-HCl, pH8.0 | 50 l |
| 5M NaCl | 10 l |
| 10% Igepal CA630 | 100 l |
| 50x Vollständige Proteasehemmer von Roche | 100 l |
| MilliQ Wasser | 4,74 ml |
Tabelle 1: Lysispuffer.
| Für 1000 l | |
| MilliQ Wasser | 869 l |
| 10X NEB T4 DNA Ligase Puffer | 120 l |
| 20mg/ml Rinderserum Albumin | 6 l |
| 2000 U/L T4 DNA Ligase | 5 l |
Tabelle 2: Ligation Master Mix Vorbereitung.
| Für 15 l | |
| 5X Schneller Ligations-Reaktionspuffer | 10 l |
| NEBNext Adapter | 3 l |
| Schnelle T4 DNA Ligase | 2 l |
Tabelle 3: Adapterligationsreaktion.
| PCR-Einrichtung | |
| Adaptor ligated Library-on-deads | 10 l |
| PCR-Wasser | 20,25 l |
| 10 M Zielspezifische Grundierung | 3,75 l |
| 10 M NEB Index-Primer | 3,75 l |
| Herculase II 5X Puffer | 10 l |
| 10 Mm dNTPs | 1,25 l |
| Herculase II Polymerase | 1 L |
| Gesamtvolumen | 50 l |
| PCR-Programm | |
| Schritt 1: 98 °C - 2 min | |
| Schritt 2: 98 °C - 20er Jahre | |
| Schritt 3: 65 °C - 30er Jahre | |
| Schritt 4: 72 °C - 45s | |
| Schritt 5: Gehen Sie zu Schritt 2, um insgesamt 15-18 Zyklen zu machen | |
| Schritt 6: 72 °C - 3 min | |
| Schritt 7: 4 °C – halten |
Tabelle 4: 4C Chromatin-Interaktionsbibliotheksverstärkung, erste PCR.
| Verschachtelte PCR-Einrichtung | |
| DNA-Fragment aus der ersten PCR | 10 l |
| PCR-Wasser | 20,25 l |
| 10 M spezifische Grundierung + P5 Illumina Grundierung | 3,75 l |
| 10 M P7 Illumina Grundierung | 3,75 l |
| Herculase II 5X Puffer | 10 l |
| 10 Mm dNTPs | 1,25 l |
| Herculase II Polymerase | 1 L |
| Gesamtvolumen | 50 l |
| Verschachteltes PCR-Programm | |
| Schritt 1: 98 °C - 2 min | |
| Schritt 2: 98 °C - 20er Jahre | |
| Schritt 3: 65 °C - 30er Jahre | |
| Schritt 4: 72 °C - 45s | |
| Schritt 5: Gehen Sie zu Schritt 2, um insgesamt 15-18 Zyklen zu machen | |
| Schritt 6: 72 °C - 3 min | |
| Schritt 7: 4 °C – halten |
Tabelle 5: 4C Chromatin-Interaktionsbibliotheksverstärkung, verschachtelte PCR.
| Namen | Sequenz (5'-3') |
| DS-Okt4-A | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG |
| US-Okt4-A | TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC |
| DS-Okt4-B | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT |
| US-Okt4-B | ACCAGGTGGGGGGGGATGGCAGCAGGGCT |
| DS-T-C | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCTTGGGTCCCTGCACAGCGCCAAAGGAGC |
| US-T-C | GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA |
| DS-T-D | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCTCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG |
| US-T-D | GCTGAGGCTGTGGAGAGGTCAAGGAGACC |
| UP-4C | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
| Adap-i1 | CAAGCAGAGAACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i2 | CAAGGAGAGAACGGCATACGAGATACCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i3 | CAAGGAGAAGACGGCATACTGTGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i4 | CAAGGAGAGAACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
Tabelle 6: Primer, die für die 4C-Bibliotheksvorbereitung verwendet werden.
Discussion
Die Hangtropfenkulturmethode benötigt keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder Zytokine und erzeugt reproduzesstlich homogene Populationen von EBs aus einer vorgegebenen Anzahl von mESCs5. Hier beschreiben wir ein Protokoll von quantitativem 4C, das vom UMI-4C-Ansatz angepasst wurde, um den Enhancer-Promoter-Kontakt von linienspezifischen Transkriptionsfaktoren im EB-Differenzierungsmodell zu quantifizieren. Wir identifizierten Chromatinregionen, die während der EB-Differenzierung dynamisch mit Promotern von Pou5f1- und T-Genen in Kontakt treten. Pou5f1 wurde während der EB-Differenzierung herunterreguliert und die Kontaktfrequenz zwischen dem Pou5f1-Promoter und seinem distalen Enhancer verringert. Umgekehrt wurde T während der EB-Differenzierung hochreguliert und wir identifizierten drei Enhancer, bei denen die Kontaktfrequenzen mit ihrem Promotor verringert werden (Abbildung 3). Zur Bestätigung der Identifizierung kann ein Chromatin-Immunpräzipitationstest (ChIP) des aktiven Histonzeichens H3K27ac24durchgeführt werden, da sich gezeigt hat, dass diese Histonmarke mit Enhancer-Aktivierung in Verbindung gebracht wird und Enhancer diese Marke während ihrer Inaktivierung verlieren11.
Eine Standard-4C-Technik wurde ausgiebig verwendet, um das Chromatin-Kontaktprofil bestimmter genomischer Standorte zu untersuchen25. Dieser Ansatz ist jedoch auch nach extensiver Normalisierung quantitativ schwer zu interpretieren26,27,28, da die Heterogenität der PCR-Fragmentgröße und die Unmöglichkeit, PCR-Duplikate zu unterscheiden, mit Verzerrungen einhergehen. Unsere quantitative 4C-Methode ist weitgehend identisch mit der UMI-4C-Technik, die die Quantifizierung einzelner Moleküle mittels Beschallung und einem verschachtelten Ligations-vermittelten PCR-Schritt ermöglicht, um die Begrenzung des klassischen 4C-Ansatzes zu umgehen23. Im Gegensatz zum UMI-4C, der eindeutige molekulare Identifikatoren verwendet, ermöglicht unser quantitatives 4C-Protokoll jedoch die Quantifizierung einzelner Moleküle auf der Grundlage des spezifischen DNA-Bruchs, der durch den Beschallungsschritt erzeugt wird. Es macht unser Protokoll kompatibel mit kommerziellen DNA-Bibliothek Vorbereitung Kits, die Notwendigkeit von Primern mit einzigartigen molekularen Identifikatoren zu machen.
Unser Protokoll umfasst mehrere wichtige Schritte, die in Betracht gezogen werden sollten. Wie bei der klassischen 4C-Methode28sind kritische Faktoren unseres Protokolls die Effizienz der Verdauung und der Ligation bei der Herstellung der 3C-Moleküle. Niedrige Effizienzderdungen bei der Verdauung/Ligation können die Komplexität der Interaktion mit einem Fragment von Interesse drastisch verringern, was zu einer reduzierten Auflösung führt. Wie bereits beschrieben23, ist ein weiterer kritischer Schritt des Protokolls das Design der Primer für die Bibliotheksverstärkung. Die zweite PCR-Reaktionsgrundierung sollte 5-15 nt von der abgefragten Restriktionsstelle entfernt sein. Bei einer 75 nt-Sequenzierung ermöglicht dies mindestens 40 nt links der Erfassungslänge für die Zuordnung. Die in der ersten PCR-Reaktion verwendete Grundierung sollte vor der zweiten Grundierung ohne Überlappung ausgelegt sein und beide sollten spezifisch genug sein, um eine effiziente DNA-Verstärkung zu gewährleisten. Für Multiplexing sollten Primer unabhängig ausgelegt werden, die auf eine Schmelztemperatur (Tm) von 60-65 °C abzielen. Darüber hinaus wird, wie bei anderen 3C-Techniken, die Auflösung der quantitativen 4C-Methode durch das im Protokoll25verwendete Restriktionsenzym bestimmt. Dieses Protokoll verwendet ein Restriktionsenzym mit einer 4 bp Erkennungsstelle, MboI. Die maximale Auflösung mit diesem Enzym ist etwa 500 bp, aber dies ist stark Lok-abhängig und selten erreicht. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass Interaktionen, die zwischen Elementen im gleichen Einschränkungsfragment auftreten, nicht nachweisbar sind. Darüber hinaus können Interaktionen, die in einem Abstand von einer Einschränkungsstelle auftreten, nicht vom unverdauten Hintergrund unterschieden werden. Die Verwendung eines Einfüllschritts vor der Ligation kann die Erkennung dieser Wechselwirkungen ermöglichen.
Quantitative 4C ist ideal geeignet, um Chromatinkontakte von gezielten Loci abzuhören. Der spezifische PCR-Verstärkungsschritt begrenzt jedoch die Anzahl der Loci, die gleichzeitig untersucht werden können. Eine Möglichkeit, die Anzahl der Ziel-Loci zu erhöhen, besteht darin, die PCR-Schritte zu multiplen, um mehrere Ziele gleichzeitig zu verstärken, aber dies erfordert kompatibilität der verwendeten Primer und das Testen jedes Primer-Paares vor der Implementierung. Wenn globale Änderungen der Chromatinarchitektur bei Promotoren gewünscht werden, wären genomweite Ansätze wie Hi-C, PC Hi-C oder HiChIP besser geeignet29,30,31.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken F. Le Dily, R. Stadhouders und Mitgliedern des Graf-Labors für ihre Beratung und Diskussionen. G.S. wurde von einem Marie Sklodowska-Curie-Stipendium (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T, von einem Juan de la Cierva Postdoktorandenstipendium (MINECO, FJCI-2014-22946) unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des7. Rahmenprogramms RP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, Grant Agreement 609989 an T.G.), dem spanischen Ministerium für Wirtschaft, Industrie und Wettbewerbsfähigkeit (MEIC) an die EMBL-Partnerschaft Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 und CERCA Program Generalitat de Catalunya unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
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