Summary
نحن نصف بروتوكول لتقييم مورفولوجيا القلب ووظيفة في حمار وحشي بالغ باستخدام تخطيط صدى القلب عالي التردد. تسمح الطريقة بتصور القلب والقياس الكمي اللاحق للمعلمات الوظيفية ، مثل معدل ضربات القلب (HR) ، وناتج القلب (CO) ، وتغيير المنطقة الكسرية (FAC) ، وجزء القذف (EF) ، وتدفق الدم وسرعات التدفق إلى الخارج.
Abstract
أصبح حمار وحشي(Danio rerio)كائنًا نموذجيًا شائعًا جدًا في أبحاث القلب والأوعية الدموية ، بما في ذلك أمراض القلب البشري ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى شفافيته الجنينية ، وقابلية النقل الجينية ، ووسائل الراحة للدراسات السريعة عالية الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن فقدان الشفافية يحد من تحليل وظائف القلب في مرحلة البالغين ، مما يعقد نمذجة أمراض القلب المرتبطة بالعمر. للتغلب على هذه القيود ، يظهر تصوير صدى القلب بالموجات فوق الصوتية عالي التردد في سمك الحمار الوحشي كخيار قابل للتطبيق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لتقييم وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي الكبار عن طريق تخطيط صدى القلب غير الغازية باستخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد. تسمح الطريقة بتصور وتحليل بُعد قلب الحمار الوحشي وقياس المعلمات الوظيفية الهامة ، بما في ذلك معدل ضربات القلب وحجم السكتة الدماغية والإخراج القلبي وجزء القذف. في هذه الطريقة ، يتم تم ّت ّ تَدْوّر السمكَ وتبقى تحت الماء، ويمكن استردادها بعد العملية. على الرغم من أن الموجات فوق الصوتية عالية التردد هي تقنية مكلفة ، يمكن استخدام نفس منصة التصوير لأنواع مختلفة (على سبيل المثال ، المورين وسمك الحمار الوحشي) عن طريق تكييف محولات مختلفة. تصوير صدى القلب حمار وحشي هو طريقة قوية لفينوبة القلب، مفيدة في التحقق من صحة وتوصيف نماذج الأمراض، وخاصة الأمراض في وقت متأخر من ظهور; شاشات المخدرات؛ ودراسات من إصابة القلب، والانتعاش، والقدرة على التجديد.
Introduction
وحمار وحشي(Danio rerio)هو نموذج الفقاريات راسخة لدراسات عمليات التنمية والأمراض البشرية1. وللحمار الوحشي تشابه وراثي كبير مع البشر (70%)، وقابلية للحصول على السمية الوراثية، وخصوبة عالية، وشفافية بصرية أثناء التطور الجنيني، مما يسمح بالتحليل البصري المباشر للأعضاء والأنسجة، بما في ذلك القلب. على الرغم من وجود الأذين واحد فقط والبطين واحد، وقلب حمار وحشي(الشكل 1)يشبه من الناحية الفسيولوجية إلى قلوب الثدييات أربع غرف. الأهم من ذلك ، فإن معدل ضربات القلب حمار وحشي ، ومورفولوجيا تخطيط القلب ، وشكل العمل المحتمل تشبه تلك التي من البشر أكثر من أنواع المورين2. وقد جعلت هذه الميزات حمار وحشي نموذجا ممتازا لأبحاث القلب والأوعية الدموية وقدمت رؤى رئيسية في تطور القلب3،4، تجديد5، والظروف المرضية1،3،4، بما في ذلك تصلب الشرايين ، اعتلال عضلة القلب ، عدم انتظام ضربات القلب ، أمراض القلب الخلقية ، وسلسلة الأميلويد الضوئية السمية القلبية1،4،6. وقد تم تقييم وظيفة القلب ممكن خلال المرحلة الجنينية (1 أيام بعد الإخصاب) من خلال تحليل الفيديو المباشر باستخدام المجهر الفيديو عالية السرعة7،8. ومع ذلك، تفقد سمك الحمار الوحشي شفافيتها خارج المرحلة الجنينية، مما يحد من التقييمات الوظيفية للقلوب الناضجة العادية وأمراض القلب المتأخرة. للتغلب على هذا القيد ، تم استخدام تخطيط صدى القلب بنجاح كبديل تصويري عالي الدقة وفي الوقت الحقيقي وغير باضع لتقييم وظيفة قلب الحمار الوحشي البالغ9،10،11،12،13،14،15.
في حمار وحشي، يقع القلب ventrally في تجويف الصدر الخلفي مباشرة إلى الخياشيم مع الأذين تقع الظهر إلى البطين. يجمع الأذين الدم الوريدي من الوريد الالجيوب الأنفية وينقلها إلى البطين حيث يتم ضخه إلى الشرايين اللمبية(الشكل 1). هنا، نصف بروتوكول فسيولوجية تحت الماء لتقييم وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي البالغ عن طريق تخطيط صدى القلب غير الغازيباستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية الصفيف الخطي مع تردد مركز 50 ميغاهرتز للتصوير B-الوضع بدقة 30 ميكرومتر. منذ الموجات فوق الصوتية يمكن السفر بسهولة من خلال المياه، والحفاظ على القرب بين الأسماك ومسبار المسح تحت الماء يوفر ما يكفي من سطح الاتصال للكشف عن القلب مع عدم الحاجة إلى هلام الموجات فوق الصوتية وعموما أقل إرهاقا للأسماك. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن أنظمة تخطيط صدى صدى الحمار الوحشي البديلة من قبل العديد من المؤلفين9،12،13، هنا نقدم الإعداد العام والأكثر استخدامًا الذي ينطبق على الموجات فوق الصوتية عالية التردد في الحيوانات.
تسمح هذه الطريقة بالتصوير عالي الدقة لقلب سمك الحمار الوحشي البالغ ، وتتبع هياكل القلب ، وقياس سرعات الذروة من قياسات تدفق الدم دوبلر. نظهر موثوقية في القياس الكمي الجسمي للمعلمات الانقباضي والانبساطي الهامة، مثل كسر القذف (EF)، وتغيير المنطقة الكسرية (FAC)، وتدفق الدم البطيني وسرعات التدفق، ومعدل ضربات القلب (HR)، وناتج القلب (CO). نحن نساهم في إنشاء مجموعة موثوقة من المعلمات القلبية والوظائف والأبعاد الصحية للبالغين العاديين للسماح بإجراء تقييم أكثر دقة للحالات المرضية. عموما، ونحن نقدم طريقة قوية لتقييم وظيفة القلب في حمار وحشي، والتي أثبتت مفيدة للغاية6في إنشاء والتحقق من صحة نماذج أمراض القلب حمار وحشي6،16،إصابة القلب والانتعاش10،,13،وتجديد11،,12،ويمكن استخدامها كذلك لتقييم الأدوية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على حمار وحشي من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية والاستخدام وهي متوافقة مع قانون رعاية الحيوان في وزارة الزراعة الأميركية.
1- الإعداد التجريبي
-
إعداد النظام الأساسي للحصول على الصور
- باستخدام مقص صغير أو مشرط إجراء شق على الاسفنج في موقف 12:00 لعقد الأسماك أثناء المسح الضوئي. ضع الاسفنجة في وعاء زجاجي(الشكل 2A).
ملاحظة: يجب أن يسمح موضع الشق بمساحة كافية لتحريك المحول وكذلك للحفاظ على الأسماك رفع الصوت عاليا خط المياه عندما يميل منصة للمسح الضوئي(الشكل 2). يمكن أن يختلف الشق حسب حجم السمك. ومع ذلك ، بالنسبة للحجم والوزن القياسيين ، يجب أن يكون الشق حوالي 2.5 سم × 0.7 سم × 0.5 سم (الطول والعرض والعمق ، على التوالي). يجب أن يكون عمق الحاوية الزجاجية 6 سم على الأقل لتجنب تسرب المياه أثناء تصوير الأسماك. - لصق مربع الزجاج الذي يحتوي على الاسفنج على منصة الموجات فوق الصوتية، على سبيل المثال باستخدام الشريط على الوجهين. تأكد من أن الصندوق الزجاجي في وسط المنصة ومتصل بإحكام(الشكل 2B).
- إمالة المنصة إلى الأمام حوالي 30 درجة باستخدام مقبض الباب على الجانب الأيسر من حامل المنصة(الشكل 2B). ملء مربع زجاجي مع 200-250 مل من المياه نظام الأسماك التي تحتوي على 0.2 ملغ / مل tricaine الميثانسولنات (MS222).
ملاحظة: يمكن إعداد التريكين كحل مخزون 4 ملغ/مل في تريس 40 ممل درجة الحموضة 7 ومخففة إلى التركيز المطلوب في مياه نظام السمك؛ تم العثور على 0.2 ملغ / مل ليكون أفضل تركيز16. يمكن تخزين محلول مخزون التريكائين 4 ملغم/مل لفترة طويلة من الزمن عند -20 درجة مئوية أو عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. - أدخل محول داخل حامل micromanipulator على محطة السكك الحديدية العاملة، وتحويل درجة من محول نحو المشغل. الحفاظ على مجموعة موازية للأرض مع الجانب العامل الطولية فيما يتعلق المرحلة (انظر الشكل 2B). اترك مساحة كافية (10 سم على كلا الجانبين) لنظام محول السكك الحديدية المتصل الآن للتحرك على طول محاور x و y.
- تسجيل الدخول إلى برنامج التحكم واختيار الماوس (صغير) الأوعية الدموية. إنشاء دراسة جديدة وكذلك سلسلة جديدة لكل الحيوانات المدرجة في الدراسة. ابحث عن زر الدراسة الجديد الموجود على الجانب الأيسر السفلي من الشاشة على صفحة المستعرض (يبدأ العرض في وضع B).
- باستخدام مقص صغير أو مشرط إجراء شق على الاسفنج في موقف 12:00 لعقد الأسماك أثناء المسح الضوئي. ضع الاسفنجة في وعاء زجاجي(الشكل 2A).
2. التعامل مع الأسماك
ملاحظة: كان سمك الحمار الوحشي المستخدم في هذه الدراسة من الذكور البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين من العمر 11 شهرًا من سلالة AB/Tuebingen البرية (AB/TU). تم الحفاظ على حمار وحشي في نظام حوض السمك التدفق القائم بذاته من خلال في 28 درجة مئوية في دورة ضوء ثابت تعيين كما 14 ساعة ضوء / 10 ح الظلام. تم تغذية حمار وحشي مرتين يوميا مع الروبيان محلول ملحي(أرتيميا nauplii)ورقائق الطعام الجاف.
- باستخدام شبكة سمك، نقل الأسماك إلى خزان صغير يحتوي على مياه النظام مع 0.2 ملغ / مل tricaine. انتظر حتى يتم تم تهيأ السمك بالكامل (لا حركة ولا استجابة للمس).
- باستخدام ملعقة صغيرة بلاستيكية، بلطف وبسرعة نقل الأسماك إلى مربع زجاجي يحتوي على الاسفنج ة في شق المحرز سابقا مع الجانب البطني من الأسماك التي تواجه لأعلى.
ملاحظة: تأكد من وضع رأس السمكة نحو المشغل (نفس اتجاه درجة المحول) وعلى مستوى أعلى قليلاً مقارنة ببقية الجسم لتحقيق تصور قلب أفضل. - خفض بلطف محول (الحفاظ على موقفها الأصلي) باستخدام مقبض على نظام السكك الحديدية، ووضعه طوليا وعلى مقربة من الجانب البطني من الأسماك مع الشق من محول التي تواجه المشغل. ترك 2-3 ملم (لا يزيد عن 1 سم) إزالة من الأسماك. ضبط منصة فيما يتعلق محول باستخدام micromanipulator في جميع المحاور 3 حتى يتم تصور قلب السمك ومن ثم البدء في الحصول على صورة. لا ينبغي تغيير زاوية المحول خلال الحصول على الصورة بأكملها(الشكل 2C).
ملاحظة: طالما أن هناك ما يكفي من القرب (تصل إلى 1 سم)، فإن الماء على رأس الأسماك سيوفر سطح اتصال عن طريق التوتر السطحي السائل الذي يسمح بنقل موجات الموجات فوق الصوتية بين المسبار والأسماك. لذلك ، ليست هناك حاجة لدفع محول ضد الأسماك. حاول إكمال هذه الخطوة والانتهاء من الفحص في أقل من 3 دقائق لمنع موت الأسماك أو انخفاض معدل ضربات القلب أثناء الحصول على الصورة. إذا لزم الأمر، استخدم جهاز ضبط وقت. يمكن العثور على القلب على الجانب العلوي من الشاشة نحو الجانب الأيسر من العين ، والتي يمكن تصورها بسهولة إذا كان تحريك المحور س على طول الطريق إلى اليمين. إذا كان هناك صعوبة مستمرة في العثور على القلب أثناء وجوده في وضع B، والتحول إلى وضع دوبلر اللون، والتي سوف تسمح لتتبع تدفق الدم (الأحمر يشير إلى تدفق الدم نحو المشغل) وتحديد موقع القلب.
3. الحصول على صورة
ملاحظة: راجع جدول المواد لنظام التصوير وبرامج تحليل الصور.
- عرض طولي B-وضع
- بعد توطين القلب، اختر أو ابق في B-Mode (تم العثور عليه في الجانب الأيسر السفلي من شاشة اللمس بعد بدء سلسلة جديدة) وتقليل الحقل من أجل التكبير وإلقاء نظرة فاحصة على القلب لتسهيل التتبع أثناء التحليل.
- من أجل الحصول على رؤية أقرب وأوضح للقلب في اكتساب صورة B-Mode ، قم بتقليل الحقل عن طريق التكبير. استخدم شاشة اللمس لتضييق الحقل يدويًا على كل من المحورين س وص.
- إذا لزم الأمر، قم بتحسين جودة/تباين الصورة عن طريق تعيين النطاق الديناميكي إلى 45-50 ديسيبل. انتقل إلى عناصر التحكم في وضع B في خيار المزيد من عناصر التحكم ثم احفظ التغيير إلى إعدادات الوضع المسبقة. اضغط على الإعدادات المسبقة لوضع لتحديد إعداد الحصول على الصور الأمثل في كل مرة قبل البدء في تصوير سلسلة جديدة.
- التقاط العديد من الصور كما هو مطلوب في مستوى المحور الطويل عن طريق تحديد حفظ الصورة.
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات التفصيلية وموارد التدريب على الحصول على الصور في https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- عرض طولي موجة نبض
- التبديل إلى دوبلر اللون للكشف عن تدفق الدم (حدد زر اللون) واقتناء (وجدت في الجانب الأيسر السفلي من شاشة اللمس بعد أن بدأت سلسلة جديدة).
- باستخدام الشاشة التي تعمل باللمس موقف الربع على رأس الصمام الأذيني البطيني وتوطين تدفق، والتي سوف تتميز إشارة اللون الأحمر(الشكل 3A). تقليل مساحة الربع قدر الإمكان لزيادة معدل الإطار.
ملاحظة: خفض لون نبض التكرار-التردد (لون PRF) (نطاق السرعة) لضمان اللون الأصفر يمكن أن ينظر إليه في التشكيل الجانبي للسرعة من صورة دوبلر اللون. وهذا سيزيد من نطاق السرعات التي يمكن رؤيتها وسيساعد على إنشاء فسيفساء من الألوان التي من شأنها أن تسمح لتصور أكثر وضوحا سرعات الذروة. - تنشيط موجة النبض (حدد PW)وضع دوبلر لأخذ عينة من سرعة تدفق الدم البطيني. ضع بوابة حجم العينة في مركز الصمام الأذيني البطيني (حيث تصبح إشارة اللون الأحمر أكثر صفراء) للكشف عن سرعة التدفق القصوى. ضبط زاوية PW على الشاشة باستخدام أصابعك بحيث تتماشى مع اتجاه تدفق الدم. اضغط على البدء أو التحديث لبدء أخذ عينات من سرعة تدفق الدم إلى البطين.
ملاحظة: تأكد من أن الخط الصحيح للزاوية يوازي تدفق الدم من أجل توفير نتائج متسقة وقابلة للتكرار. وضع خط الزاوية الصحيح بحيث يطابق اتجاه تدفق الدم سيضمن التقاط السرعات بدقة. - كرر الخطوة 3.2.3 لتحديد سرعة التدفق إلى الخارج عن طريق وضع رباعي اللون دوبلر عند التقاطع بين البطين واللمبة (صمام لمبة) وتوطين التدفق ، والذي سيتم تمييزه بإشارة اللون الأزرق(الشكل 3B). ضع بوابة حجم العينة مباشرة قبل تقاطع البطين واللمبة وضبط خط تصحيح الزاوية لتتناسب مع اتجاه تدفق الدم.
ملاحظة: كما ذكر من قبل، لتحقيق قيم السرعة الدقيقة، تأكد من محاذاة زاوية PW مع تدفق الدم. - ضبط خط الأساس (شريط)، وخفض أو رفعه في لوحة سرعة التدفق، من أجل الكشف عن وتتبع تماما قمم إشارة(الشكل 3C، D). تحديد قمم التدفق الداخلي في الربع العلوي/الإيجابي (إشارة تتجه نحو المسبار) وقمم التدفق إلى الخارج في الربع السفلي/السالب (إشارة تبتعد عن المسبار).
4- استعادة الأسماك
- بمجرد اكتمال الحصول على الصورة ، وذلك باستخدام ملعقة صغيرة ، ونقل الأسماك إلى نظام المياه المهواة النظام العادي خالية من tricaine والسماح للأسماك استرداد (عادة ما يستغرق 30 ق إلى 2 دقيقة لاستئناف حركة الخياشيم والسباحة).
- للمساعدة في الانتعاش، بخ المياه مرارا وتكرارا على الخياشيم باستخدام ماصة نقل لتعزيز تهيئة المياه ونقل الأكسجين.
5- تحليل الصور
- افتح برنامج تحليل الصور.
- حدد صورة وانقر على رمز معالجة الصور(الشكل 4). باستخدام المقياس المتاح(الشكل 4)، قم بضبط السطوع والتباين في الصورة للسماح بتصور واضح للجدران البطينية أو نمط تدفق الدم.
- باستخدام صورة وضع B، افتح القائمة المنسدلة من خيار PSLAX (محور طويل باراستيرنال) على حزمة/قياسات القلب(الشكل 4). حدد تتبع LV وتتبع الجدار الداخلي البطيني عند الانقباض والانبساط للحصول على منطقة البطين (VA) في التصريف (VAs) والانبساط (VAd) ، ونهاية الحجم الانبساطي (EDV) ، ونهاية الحجم الانقباضي (ESV)(الشكل 5A ،B).
ملاحظة: يتم استقراء قيم وحدة التخزين من تتبع الصور 2D وقد تنحرف عن الكيان ثلاثي الأبعاد. بالنسبة لجميع القياسات، متوسط 3 دورات قلبية تمثيلية على الأقل لكل الحيوان. - لاحظ حجم الحد وكسر الإخراج الذي سيتم حسابه وعرضه تلقائيًا بواسطة البرنامج.
ملاحظة: يمكن أيضًا حساب حجم السكتة الدماغية وكسر الإخراج يدويًا باستخدام الصيغ
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
حيث SV هو حجم السكتة الدماغية، EDV هو نهاية حجم الانبساطي، ESV هو نهاية حجم الانقباضي، وEF هو طرد كسر - حساب تغيير المساحة الكسرية باستخدام الصيغة
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
حيث FAC هو تغيير المنطقة الكسرية، VAd هو منطقة البطين في انبساط، وVAs هي منطقة البطين في systole. - حساب الناتج القلبي باستخدام الصيغة
CO = الموارد البشرية x SV
حيث CO هو الناتج القلبي، والموارد البشرية هو معدل ضربات القلب، وSV هو حجم السكتة الدماغية - باستخدام صورة وضع دوبلر موجة نبضية، قياس سرعة تدفق الدم من خلال اختيار الخيار تدفق MV تحت حزمة القلب(الشكل 4). حدد E أو A للانجراف المبكر والانجراف المتأخر ، على التوالي ، وحدد سرعات الذروة على الرسم البياني(الشكل 3C).
- قياس سرعة تدفق الدم عن طريق اختيار تدفق AoV وتحديد القمم على التتبع(الشكل 3D).
- قياس معدل ضربات القلب باستخدام منهجيتين مختلفتين لتقييم أكثر موثوقية:
- عندما يتم تصور القلب على الشاشة أثناء الحصول على الصورة، عد يدق في غضون 10 ق وتتضاعف في 6.
- باستخدام صورة نبض موجة دوبلر على برنامج Vevo LAB ، اختر زر معدل ضربات القلب وفترات التتبع بين 3 قمم تدفق أبهري متتالية(الشكل 4 والشكل 6).
- لتصدير البيانات إلى جدول بيانات بعد تتبع LV وقمم تدفق الدم ، انقر على تقرير | تصدير | حفظ كما | التفوق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح البروتوكول الموصوف بقياس الأبعاد القلبية المهمة والمعلمات الوظيفية ، على غرار التقنية المستخدمة في تخطيط صدى القلب البشري والحيواني. تسمح صور B-Mode بتتبع الجدار الداخلي البطيني في الانقباض والانانبساط(الشكل 5)والحصول على بيانات الأبعاد ، مثل أبعاد الغرفة والجدار ، والبيانات الوظيفية ، مثل معدل ضربات القلب ، وحجم السكتة الدماغية ، وإخراج القلب وكذلك معلمات الوظيفة الانقباضية البطينية ، مثل تغيير المنطقة الكسرية وكسر القذف(الجدول 1). كما توفر القياسات على مستوى الصمام الأذيني البطيني باستخدام صور وضع دوبلر الملونة سرعات الدم في البطين والخارج (السرعة التي يملأ بها الدم البطين ويخرج منه على التوالي)(الشكل 3 والجدول 1).
كانت المعلمات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة باستخدام ظروف تجريبية مماثلة6،16،17 (الجدول 1)، مما يدل على تكرار الأسلوب. بشكل عام ، نظهر أنه باستخدام هذا البروتوكول التفصيلي ، يمكن للمرء تقييم وظيفة قلب الحمار الوحشي بشكل فعال ومستمر ، وهو أمر بالغ الأهمية عند مقارنة الأنماط الظاهرية القلبية المختلفة أثناء الدراسة.
الشكل 1: توضيح لقلب سمك الحمار الوحشي البالغ. يتم تمثيل دوران تدفق الدم بواسطة السهام: يتدفق الدم من الوريد الالجيوب الأنفي إلى الأذين ويتم نقله إلى البطين ، حيث يتم ضخه إلى الشرايين اللمبية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: غرفة تصوير الأسماك. (أ)لإعداد "غرفة" تصوير السمك، يتم وضع اسفنجة مع شق نحو نهاية واحدة في اتجاه عمودي في وعاء زجاجي. (ب)ثم يتم تسجيل الحاوية الزجاجية بحزم على منصة التصوير المائلة. (C)يتم تركيب المحول على المتلاعب ووضعه بالتوازي مع الشق لتحديد موقع التصوير الصحيح (يشير شق المحول نحو المشغل). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تدفق البطين (A) والخارج (B) في وضع اللون دوبلر وما يقابله من موجة دوبلر النبضية لتقييم سرعات قمم الموجات الانبساطية البطينية المعنية (C) وتدفق البطين (D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الصور. بعد معالجة الصور (لتحقيق التباين المطلوب وسطوع الصورة)، يمكن إجراء القياسات في وضع PW دوبلر (يسار) وصور وضع B (يمين). لتتبع جدار LV في صورة وضع B، حدد حزمة القلب من القائمة المنسدلة، انتقل إلى PSLAX،وحدد LV التتبع. لقياس سرعات الذروة في صورة وضع PW دوبلر، حدد حزمة القلب من القائمة المنسدلة. لقياس سرعة تدفق الدم البطيني، حدد خيار تدفق MV وحدد E أو A للانبساط المبكر والانبساط المتأخر، على التوالي. لتحديد سرعة تدفق الدم، حدد تدفق AoV وسرعة ذروة AV. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور وضع B. (أ)B-وضع صورة البطين (V) في انبساط، مليئة بالدم القادمة من الأذين (A). (B)B-وضع صورة البطين في systole, إخراج الدم من خلال الشرايين لمبة (B, تتبع الأخضر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نبض موجة دوبلر الصورة. يمكن توليد قيمة معدل ضربات القلب عن طريق تتبع 3 قمم تدفق الأبهر متتالية. يمكن عرض قمم التدفق الأبهري عن طريق تحديد زر معدل ضربات القلب في علامة التبويب القياسات في برنامج التحليل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المعلمات والوحدات ± sd | هذه الدراسة | وانغ، ل. وآخرون،2017. لي، ل. وآخرون،2016 وميشرا، س. وآخرون،2019 | تعليقات / وصف |
| معدل ضربات القلب (HR)، bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | الأنواع البرية AB/ABTU الذكور والإناث بين 3-12 أشهر يجري فيها التهنّج في التريكين 0.2 ملغم/مل |
| تغيير المساحة الكسرية (FAC) | 0.38 ± 0.03 | 0.29 ± 0.07 - 0.39 ± 0.05 | |
| كسر الإخراج (EF)، [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0.04 - 48 ± 0.03 | |
| حجم السكتة الدماغية (SV)، μL | 0.21 ± 0.01 | 0.18 ± 0.06 - 0.28 ± 0.08 | |
| خرج القلب (CO)، μL دقيقة-1 | 27.3 ± 1.69 | 19 ± 9.5 - 36.1 ± 7.8 | |
| سرعة الذروة E (تدفق البطين المبكر)، مم/س | 30 ± 6.8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| سرعة الذروة (تدفق البطين المتأخر)، مم/ث | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| تدفق البطين، مم/س | 86.6 ± 19 | ن/أ |
الجدول 1: معلمات صدى القلب في سمك الحمار الوحشي البالغ. القيم التي تم الحصول عليها لمعلمات وظيفة القلب التي تم تقييمها في الدراسة الحالية لسمك الحمار الوحشي الذكور أو الإناث البالغين بين 3 و 12 شهرًا من التمسيد في محلول tricaine 0.2 ملغم/مل. يتم تقديم مجموعة من القيم التي تم الحصول عليها لنفس المعلمات في الدراسات السابقة6،16،17 التي أجريت في ظروف مماثلة للتحقق من الصحة وللمساعدة في توحيد الأسلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نصف طريقة منهجية لتصوير صدى القلب وتقييم وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي الكبار. تخطيط صدى القلب هو الأسلوب الوحيد المتاح غير الغازية والأكثر قوة لتصوير القلب الأسماك البالغة الحية والتحليل الوظيفي، وأنها أصبحت شعبية متزايدة في أبحاث القلب والأوعية الدموية حمار وحشي. مقدار الوقت اللازم قصير ويسمح للدراسات عالية الإنتاجية وطولية. ومع ذلك، هناك تباين كبير في المنهجية المستخدمة وتحليل البيانات. توحيد تخطيط صدى صدى الحمار الوحشي من الصعب جدا عندما يمكن أن تؤثر على العديد من المتغيرات المعلمات القادمة. عند إجراء الدراسات التجريبية، ينبغي للمرء أن ينظر في الظروف التي يمكن أن تنتج تقلب، بما في ذلك التخدير، ووزن الجسم، والعمر، والجنس، والإجهاد في الخلفية. قام وانغ وL وآخرون16 بتقييم التباين الذي أدخلته هذه العوامل وجمع البيانات المتاحة عن وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي من أجل المساعدة في توحيد الطريقة. دراستهم هي مورد مفيد جدا لتصميم الدراسات التجريبية التي تنطوي على تقييم صدى القلب حمار وحشي. استنادا إلى المعلومات المقدمة من وانغ، L وآخرون16 والمراجع داخل وملاحظاتنا الخاصة6،ونحن نقدم الخطوط العريضة للخطوات الحرجة والشروط التي اعتبرناها مهمة لتحسين البروتوكول والاستنساخ:
اختيار العينة: تشير الدراسات السابقة إلى أنه في حين أن معلمات الوظيفة الانقباضي (EF ، FAC) لا تتأثر بشكل كبير بالاختلافات بين الجنسين ، فإن الوظيفة الانبساطية (أي نسبة ذروة الموجة E / A) يمكن أن تكون أقل بكثير في الإناث الأكبر سنا ً من 6 أشهر. ولوحظ أيضا أن المناطق والكميات البطينية تزداد زيادة كبيرة مع تقدم عمر الأسماك (3 أشهر فما فوق) وهي أعلى بكثير لدى الإناث بسبب ارتفاع وزن الجسم وحجمه. يمكن أن يساعد فهرسة الأحجام الانبساطية إلى مؤشر كتلة الجسم (BMI) ومساحة سطح الجسم (BSA) في إلغاء الاختلافات بين الإناث والذكور المطابقين للعمر ، ويمكن أن يساعد الفهرسة إلى BSA والوزن في التغلب على اختلافات الحجم الانبساطي المرتبطة بالعمر16. كانت هناك أيضا تقارير عن وظائف انبساطية مختلفة بين الأسماك مع سلالات خلفية مختلفة16. عموما، عند اختيار التصميم التجريبي، فمن المستحسن استخدام الضوابط العمر وسلالة مطابقة وتجنب خلط مختلف الجنسين. يوصى باستخدام الذكور ، حيث كانت جودة الصورة أقل في الإناث المبشرات.
موضع المسح الضوئي:في هذا الإعداد اثنين من مواقف المسح الضوئي ممكنة: محور طولي ومحور قصير. وجدنا أنه في وضع المحور القصير كان من الصعب جدا التعرف على غرف القلب. لذلك ، استخدمنا المحور الطولي فقط ونوصي بهذا الأخير لترسيم غرف القلب في وضع B واشتقاق حجم البطين ووظيفته.
التخدير: التخدير الكافي أمر بالغ الأهمية لتجنب بطء القلب كبيرة أثناء القياس. سيؤثر معدل ضربات القلب على قياس القلب الوظيفي ، مما يعرض دقة الدراسة للخطر. التريكايين هو عامل التخدير الأكثر شيوعا وجرعة من 0.2 ملغ / مل وجدت لتوفير التخدير الكافي. ومع ذلك ، فإن وقت القياس أمر بالغ الأهمية لأن معدل ضربات القلب يبدأ في الانخفاض بعد 3-4 دقيقة تحت التثمين16. لتجنب إدخال التباين ، من الأهمية بمكان الحفاظ على القياسات تحت 3 دقيقة.
المعلمات الحرجة:يمكن اعتبار معدل ضربات القلب معلمة حرجة عند التوصل إلى الاتساق والدقة. يجب أن يكون معدل ضربات القلب قابلًا للمقارنة بين المجموعات التجريبية التي تم اختبارها وضمن نطاق القيم المبلغ عنها للحالات المستخدمة. وجدنا أن مجموعة من 118 ± 14 إلى 162 ± 32 bpm يمكن أن تمثل القيم العادية لحمار وحشي من النوع البري 3-12 أشهر البالغين البالغين مع 0.2mg/mL من التريكين لمدة تقل عن 3 دقيقة.
دقة النتائج:لضمان الدقة ، يجب أخذ القياسات على الأقل 3 دورات قلبية. للحصول على مزيد من الدقة تتبع الصور اليدوية ، وينبغي أن يتم التحليل بطريقة عمياء.
وإلى جانب اختيار أنسب الظروف، هناك عدة جوانب حاسمة لضمان القياس الدقيق. من الناحية المثالية ، يجب الحفاظ على الظروف أقرب إلى الحالة الفسيولوجية الطبيعية للأسماك قدر الإمكان. إجراء المسح تحت الماء لديه ميزة الحفاظ على الأسماك في بيئتها الطبيعية وعلى مقربة من الظروف العادية لتبادل الغاز، وتكوين المياه، والضغط الهيدروستاتيكي، ودرجة الحرارة. هذه مزايا واضحة على الدراسات السابقة ، حيث يتم وضع الأسماك أثناء المسح الضوئي في إسفنجة مبللة تتعرض لهواء الغرفة ويتم تمكين الموصلية عن طريق هلام الموجات فوق الصوتية بدلاً من الماء9،10. كما يسمح المسح تحت الماء باستعادة الأسماك بعد العملية ، شريطة أن يتم الاحتفاظ بالوقت بين التخدير والانتعاش تحت 3 دقيقة ويتم إرجاع الأسماك إلى مياه الانتعاش مباشرة بعد القياس. ولضمان تنفيذ الإجراء بأسرع ما يمكن وبفعالية، يُنصح بإنفاق قدر كبير من الوقت على التدريب قبل إجراء التجارب.
تخطيط صدى القلب هو طريقة راسخة جدا لتقييم وظيفة القلب في الممارسة السريرية وكذلك في الفئران (أو الثدييات الأخرى) نماذج الحيوانات. ومع ذلك ، على عكس المورين أو تخطيط صدى القلب البشري ، فإن إجراء الموجات فوق الصوتية للأسماك تحت الماء لا يسمح باتصال العينة بالأقطاب الكهربائية. لذلك ، لا يمكن قياس معدلات القلب والجهاز التنفسي مباشرة. في هذه الحالة ، يمكن قياس معدل ضربات القلب عن طريق عد الدقات في الدقيقة في فاصل زمني 10 أو 15 دقيقة أو عن طريق تتبع 3 قمم تدفق الأبهر المتتالية يدويًا(الشكل 6). يؤثر معدل ضربات القلب أيضًا على تحديد المعلمات الأخرى، مثل ناتج القلب، التي يجب حسابها يدويًا بمجرد الحصول على معلمات مثل حجم السكتة الدماغية من خلال تتبع الجدار الداخلي البطيني. جانب آخر للنظر هو أن مورفولوجيا قلب السمك يختلف تماما عن الثدييات. في قلب حمار وحشي ذي غرفتين ، يتم تحديد ملء البطين في الغالب عن طريق الانكماش الأذيني ، وعادة ما تقدم الأسماك نسبة ملء أقل بكثير في وقت مبكر إلى وقت متأخر من البطين بالمقارنة مع الثدييات18. وهذا ما يفسر التشكيل الجانبي المختلفة التي تم الحصول عليها من قبل موجة النبض دوبلر في A و E قمم بين حمار وحشي وقلوب الثدييات صحية.
يتيح تخطيط صدى القلب توصيفًا شاملًا لصورة قلب السمك وقياسًا كميًا للمعلمات الوظيفية المتعددة. القيم التي تم الحصول عليها لكسر القذف، وتغير المنطقة الكسرية، وتدفق الدم وسرعات التدفق، ومعدل ضربات القلب، والناتج القلبي هي في النطاق الذي أبلغت عنه الدراسات السابقة(الجدول 1)،مما يسلط الضوء على استنساخ الطريقة. إذا ما تم جمعنا، تظهر بياناتنا أن تصوير صدى القلب بالموجات فوق الصوتية عالي التردد هو طريقة قوية وقابلة للتكرار لقياس مورفولوجيا القلب ووظيفة حمار وحشي عند تقييم نماذج المرض أو اختبار الدواء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر دعم فريد روبرتس التقني وتنقيحه للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
