Summary
우리는 고주파 심초음파를 사용하여 성인 제브라피시의 심장 형태와 기능을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 심장의 시각화를 허용하고 심장 박동 (HR), 심장 출력 (CO), 분수 영역 변화 (FAC), 배출 분획 (EF), 및 혈액 유입 및 유출 속도와 같은 기능적 매개 변수의 후속 정량화를 허용합니다.
Abstract
Zebrafish(Danio rerio)는배아 투명성, 유전 성 및 빠른 처리량 연구에 대한 편의성으로 인해 인간 심장 질환을 포함한 심혈관 연구에서 매우 인기있는 모델 유기체가되었습니다. 그러나, 투명성의 손실은 나이 관련 심혼 조건의 모델링을 복잡하게 하는 성인 단계에서 심장 기능 분석을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 제브라피시의 고주파 초음파 심초음파가 실행 가능한 옵션으로 부상하고 있습니다. 여기에서, 우리는 고주파 초음파를 사용하여 비침범성 심초음파에 의하여 성인 zebrafish에 있는 심장 기능을 평가하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 제브라피시 심장 치수의 시각화 및 분석과 심박수, 뇌졸중 량, 심장 출력 및 배출 분율을 포함한 중요한 기능 적 매개 변수의 정량화를 할 수 있습니다. 이 방법에서, 물고기는 마취및 수중 유지및 절차 후 복구 할 수 있습니다. 고주파 초음파는 고가의 기술이지만, 동일한 이미징 플랫폼은 다른 트랜스듀서를 적용하여 다른 종 (예를 들어, 뮤린과 제브라피시)에 사용할 수 있습니다. Zebrafish 심초음파는 심장 자형질에 대한 강력한 방법이며, 질병 모델, 특히 후기 발병 질병의 유효성 검사 및 특성화에 유용합니다. 약물 화면; 심장 부상의 연구, 복구, 및 재생 능력.
Introduction
제브라피쉬(Daniorerio)는발달 과정과 인간 질병에 대한 연구를 위한 잘 확립된 척추동물모델1. Zebrafish는 인간 (70 %), 유전 성, 높은 fecundity 및 배아 발달 중 광학 투명성과 높은 유전 적 유사성을 가지고 있으며, 이는 심장을 포함한 장기와 조직의 직접적인 시각적 분석을 가능하게합니다. 심방하나와 심실1개에 불과하지만, 제브라피쉬심장(그림 1)은포유류 4체강 심장과 생리적으로 유사하다. 중요한 것은, 제브라피쉬 심박수, 심전도 형태, 및 행동 전위 모양은 뮤린 종2보다더 많은 인간의 것과 유사합니다. 이러한 특징은 제브라피쉬를 심혈관 연구를 위한 훌륭한 모델로 만들었으며 심장 발달3,4,4재생5,병리학 적 조건1,33,4,동맥 경화증, 심근병증, 부정맥, 선천성 심장 질환 및 아밀로이드 경쇄 심장 독성,1,,4,,6에대한 주요 통찰력을 제공했습니다. 고속 비디오 현미경7,,8을이용한 직접 영상 분석을 통해 배아 단계(1일 후 수정)동안 심장 기능 평가가 가능하였다. 그러나, 얼룩말 물고기는 정상적인 성숙한 심혼 및 늦은 개시 심혼 조건의 기능적인 평가를 제한하는 배아 단계를 넘어 그들의 투명성을 분실합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 심초음파는 성인 제브라피쉬 심장 기능9,,,,,10,,11,,12,13,14,15를평가하기 위한 고해상도, 실시간, 비침습적 영상 대안으로 성공적으로 채택되었다.
제브라피시에서 심장은 심실에 위치한 심방이있는 심방과 함께 아가미의 바로 후부인 흉강 구멍에 통풍구에 있습니다. 심방은 부비동 정맥에서 정맥 혈액을 수집하고 더 전구 동맥에 펌핑되는 심실로 전송합니다(그림 1). 여기서, 우리는 30 μm의 해상도에서 B 모드 이미징을 위한 50 MHz의 중심 주파수를 가진 선형 배열 초음파 프로브를 사용하여 비침습적 심초음파에 의해 성인 제브라피시의 심장 기능을 평가하는 생리적, 수중, 프로토콜을 기술한다. 초음파파는 물을 통해 쉽게 이동할 수 있기 때문에 수중에서 물고기와 스캐닝 프로브 사이의 근접성을 유지하면 초음파 젤없이 심장 검출을위한 충분한 접촉 면을 제공하며 물고기에 대한 스트레스가 전반적으로 적습니다. 대체 제브라피시 심초음파 시스템은 여러 저자에 의해 보고되었지만9,12,,13,여기에서 우리는 동물의 고주파 초음파에 적용되는 일반적이고 가장 일반적으로 사용되는 설정을 제시합니다.
이 방법은 성인 제브라피시 심장의 고해상도 이미징, 심장 구조 추적 및 도플러 혈류 측정에서 피크 속도의 정량화를 허용합니다. 우리는 배출 분획 (EF), 분수 영역 변화 (FAC), 심실 혈액 유입 및 유출 속도, 심박수 (HR) 및 심장 출력 (CO)과 같은 중요한 수축기 및 확장기 매개 변수의 생체 내 정량화를 보여줍니다. 우리는 병리학 상태의 보다 정확한 평가를 허용하기 위하여 일반적인 건강한 성숙한 얼룩말 물고기 심장 기능 및 치수 매개변수의 믿을 수 있는 범위를 확립하는 것을 기여합니다. 전반적으로, 우리는 제브라피쉬 심장 질환 모델6,16,심장 손상 및 회복10,13,및 재생,11,,12,및 잠재적 인 약물을 평가하는 데 매우 유용하다는 것이 입증 된 제브라피시의 심장 기능을 평가하는 강력한 방법을 제공합니다.,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
제브라피시와 관련된 모든 절차는 당사의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 USDA 동물 복지법을 준수합니다.
1. 실험적인 설정
-
이미지 수집을 위한 플랫폼 설정
- 작은 가위 또는 메스를 사용하여 스캔하는 동안 물고기를 잡기 위해 12시 위치에 스폰지에 절개를합니다. 스폰지를 유리 용기에놓습니다(그림 2A).
참고 : 절개의 위치는 트랜스듀서를 이동하고 플랫폼이 스캔을 위해 기울어질 때 물고기가 물 라인을 울부 짖는 유지 하기에 충분한 공간을 허용해야합니다(그림 2). 절개는 물고기의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나 표준 크기와 무게의 경우 절개는 약 2.5cm x 0.7 cm x 0.5cm(각각 길이, 너비 및 깊이)여야 합니다. 유리 용기는 물고기를 이미징하는 동안 누수를 피하기 위해 적어도 6cm 깊이여야합니다. - 예를 들어 양면 테이프를 사용하여 초음파 플랫폼에 스폰지가 들어있는 유리 상자를 부착하십시오. 유리 상자가 플랫폼의 중앙에 있고 단단히 부착되었는지 확인하십시오(그림 2B).
- 플랫폼 홀더 왼쪽의 손잡이를 사용하여 플랫폼을 약 30° 앞으로 기울입니다(그림2B). 0.2 mg/mL 의 트리카인 메탄설포네이트(MS222)를 함유한 200-250 mL의 생선 시스템 물로 유리 광장을 채웁니다.
참고 : 트리카인은 Tris 40 mM pH 7에서 4 mg / mL 스톡 솔루션으로 제조 될 수 있으며 어류 시스템 물에서 원하는 농도로 더 희석 할 수 있습니다. 0.2 mg/mL은 최고의 농도인 것으로 나타났다16. 4 mg/mL 트리카인 스톡 용액은 -20°C 또는 4°C에서 1개월 동안 장기간 보관할 수 있습니다. - 작동 레일 스테이션의 마이크로 조작기 홀더 내에 트랜스듀서를 삽입하여 트랜스듀서의 노치를 작업자쪽으로 돌립니다. 스테이지에 대해 작업 면과 함께 지면에 평행하게 배열을 유지합니다(그림 2B참조). 이제 연결된 트랜스듀서 레일 시스템이 x축과 y 축을 따라 이동할 수 있도록 충분한 공간(양쪽에 10cm)을 남겨 둡니다.
- 컨트롤 소프트웨어에 로그인하고 마우스(작은) 혈관을 선택합니다. 연구에 포함된 각 동물에 대한 새로운 시리즈와 새로운 스터디를 만듭니다. 브라우저 페이지에서 화면 왼쪽 하단에 있는 새 스터디 버튼을 찾습니다(보기는 B 모드에서 시작됨).
- 작은 가위 또는 메스를 사용하여 스캔하는 동안 물고기를 잡기 위해 12시 위치에 스폰지에 절개를합니다. 스폰지를 유리 용기에놓습니다(그림 2A).
2. 물고기 취급
참고: 본 연구에서 사용된 제브라피쉬는 야생형 균주 AB/튜빙겐(AB/TUebingen)의 성인, 11개월 된 수컷이었습니다. Zebrafish는 14 시간 빛 / 10 h 어두운 것으로 설정된 일정한 광 주기에서 28 °C에서 독립형 유동 수족관 시스템에서 유지되었습니다. 얼룩말새우는 소금물새우(아르테미아 나우플리)와마른 음식 조각으로 하루에 두 번 먹였습니다.
- 그물을 사용하여 0.2 mg / mL 트리카인이있는 시스템 물을 포함하는 작은 탱크로 물고기를 옮김하십시오. 물고기가 완전히 마취 될 때까지 기다립니다 (움직임과 터치에 대한 반응이 없음).
- 플라스틱 티스푼을 사용하여, 부드럽게 빠르게 스폰지를 포함하는 유리 상자에 물고기를 전송하는 것은 물고기의 복부 측면이 위로 향하고 이전에 만든 절개로.
참고 : 물고기의 머리가 더 나은 심장 시각화를 달성하기 위해 신체의 나머지 부분에 비해 약간 높은 수준에서 연산자 (트랜스 듀서의 노치와 같은 방향)를 향해 위치하고 있는지 확인하십시오. - 레일 시스템의 핸들을 사용하여 트랜스듀서(원래 위치를 유지)를 부드럽게 낮추고, 트랜스듀서의 노치가 운전자를 향하게 하여 물고기의 복부쪽에 세로로 가깝게 놓습니다. 물고기에서 2-3mm (1cm 이하) 간격을 둡니다. 물고기 심장이 시각화 될 때까지 모든 3 축에서 마이크로 조작기를 사용하여 트랜스듀서에 대한 플랫폼을 조정한 다음 이미지 수집을 시작합니다. 변환기의 각도는 전체 이미지 수집 중에 변경되지 않아야합니다(그림 2C).
참고 : 충분한 근접 (최대 1cm)이있는 한, 물고기 의 상단에있는 물은 프로브와 물고기 사이의 초음파 파를 전달 할 수있는 액체 표면 장력을 통해 접촉 표면을 제공합니다. 따라서, 물고기에 대해 트랜스듀서를 밀어 필요가 없습니다. 이 단계를 완료하고 3분 이내에 스캔을 완료하여 물고기의 사망이나 이미지 수집 중 심박수 감소를 방지합니다. 필요한 경우 타이머를 사용합니다. 심장은 화면의 위쪽에서 눈의 왼쪽을 향해 찾을 수 있으며, x축을 오른쪽으로 이동하면 쉽게 시각화할 수 있습니다. B 모드에있는 동안 심장을 찾는 데 어려움이 계속되면 혈류를 추적하고 심장을 찾을 수있는 색상 도플러 모드로 전환하십시오 .
3. 이미지 수집
참고: 이미징 시스템 및 이미지 분석 소프트웨어는 재료 표를 참조하십시오.
- 세로 도면 보기 B 모드
- 심장을 현지화한 후 B 모드(새 시리즈를 시작한 후 터치스크린 왼쪽 하단에 있음)를 선택하거나 유지한 후, 확대하기 위해 필드를 줄이고 분석 중에 더 쉽게 추적할 수 있도록 하트를 자세히 살펴보십시오.
- B 모드 이미지 수집에서 하트를 더 가깝고 선명하게 볼 수 있도록 확대하여 필드를 줄입니다. 터치스크린을 사용하여 x축과 y축 모두에서 필드를 수동으로 좁힐 수 있습니다.
- 필요한 경우 동적 범위를 45-50dB로 설정하여 이미지의 품질/대비를 향상시킵니다. 더 많은 컨트롤 옵션의 B 모드 컨트롤로 이동한 후 변경 된 설정을 모드 사전 설정으로저장합니다. 모드 사전 설정을 눌러 새 시리즈 이미지를 시작하기 전에 매번 최적화된 이미지 수집 설정을 선택합니다.
- 이미지 저장을선택하여 긴 축 평면에서 원하는 만큼 이미지를 가져 가라.
참고: 이미지 수집에 대한 자세한 정보 및 교육 리소스는 https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab 및 https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- 세로보기 펄스 웨이브
- 혈류 감지를 위해 컬러 도플러로 전환(색상 버튼 선택) 및 수집(새 시리즈를 시작한 후 터치스크린의 왼쪽 하단에 있음).
- 터치 스크린을 사용하여 방실 밸브의 상부에 사분면을 위치시키고 유입을 국소화하고, 이는 적색 신호에 의해 구별될것이다(도 3A). 프레임 속도를 높이기 위해 사분면 영역을 가능한 한 줄입니다.
참고: 컬러 펄스 반복 주파수(색상 PRF)(속도 범위)를 낮추면 색상 도플러 이미지의 속도 프로파일에서 노란색을 볼 수 있습니다. 이렇게 하면 볼 수 있는 속도의 범위가 증가하고 피크 속도를 보다 명확하게 시각화할 수 있는 색상의 모자이크를 만드는 데 도움이 됩니다. - 심박파(PW선택) 도플러 모드를 활성화하여 심실 혈액 유입 속도를 샘플링합니다. 시료 체적 게이트를 방실 밸브의 중앙(적색 신호가 더 황변되는 위치)에 배치하여 최대 유속을 감지합니다. 혈액 유입 방향에 맞게 손가락을 사용하여 화면의 PW 각도를 조정합니다. 시작 또는 업데이트를 눌러 심실로 흐르는 혈액의 속도를 샘플링하기 시작합니다.
참고: 일관되고 재현 가능한 결과를 제공하기 위해 각도 올바른 선이 혈류와 평행한지 확인합니다. 혈류 방향과 일치하도록 각도 올바른 선을 배치하면 속도가 정확하게 캡처됩니다. - 3.2.3단계를 반복하여 심실과 전구(bulbuventricular valve) 사이의 접합부에 컬러 도플러 사분면을 배치하여 유출 속도를 결정하고, 이는 청색 신호로 구별될 흐름을 국소화한다(도3B). 심실-구부스 접합부 바로 앞에 시료 부피 게이트를 배치하고 혈류 방향에 맞게 각도 보정 선을 조정합니다.
참고: 앞에서 언급했듯이 정확한 속도 값을 얻으려면 PW 각도가 혈류량과 일치하는지 확인합니다. - 신호 피크를 완전히 감지하고 추적하기 위해 유속 패널에서 기준선(bar)을 낮추거나 올리면됩니다(그림 3C,D). 상부/양수 사분면(프로브쪽으로 가는 신호)의 유입 피크와 하부/음의 사분면의 유출 피크(프로브에서 멀어지는 신호)를 식별합니다.
4. 물고기 복구
- 이미지 수집이 완료되는 즉시, 티스푼을 사용하여, 트리카인이없는 일반 시스템 육질 물로 물고기를 전송하고 물고기가 회복하게하십시오 (일반적으로 아가미 운동과 수영을 재개하는 데 30 ~2 분이 걸립니다).
- 회복을 돕기 위해, 물과 산소 전달의 폭기를 촉진하기 위해 전달 파이펫을 사용하여 아가미 위에 반복적으로 물을 분출.
5. 이미지 분석
- 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 이미지를 선택하고 이미지 처리 아이콘을클릭합니다(그림 4). 사용 가능한척도(그림 4)를사용하여 이미지의 밝기와 대비를 조정하여 심실 벽 또는 혈류 패턴을 명확하게 시각화할 수 있도록 합니다.
- B 모드 이미지를 사용하여 심장 패키지/측정에서 PSLAX(파라스테른 긴 축) 옵션에서 드롭다운 목록을 엽니다(그림4). LV 추적을 선택하고 수축기 및 익아또의 심실 내벽을 추적하여 수축기(VaA) 및 익아톨(Vad)의 심실 영역, 끝 확장기 부피(EDV) 및 끝 수축기 부피(ESV)를 얻습니다(그림5A,B).
참고: 볼륨 값은 2D 이미지 추적에서 추정되며 3D 엔터티에서 벗어날 수 있습니다. 모든 측정의 경우, 동물당 최소 3회의 대표적인 심장 주기를 평균합니다. - 소프트웨어에서 자동으로 계산되고 표시되는 획 볼륨 및 배출 분율을 기록합니다.
참고: 수식을 사용하여 스트로크 볼륨 및 배출 분획을 수동으로 계산할 수도 있습니다.
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV) / EDV
여기서 SV는 스트로크 볼륨, EDV는 끝 확장기 볼륨, ESV는 끝 수축기 볼륨, EF는 배출 분율 - 수식을 사용하여 소수 영역 변경 계산
FAC = (VAd - 바)/ VAd
FAC가 분수 영역 변화인 경우, VAd는 이톨의 심실 영역이고, VA는 실목의 심실 영역입니다. - 수식을 사용하여 심장 출력 계산
CO = HR x SV
CO가 심장 출력인 경우 HR은 심박수이고 SV는 뇌졸중 볼륨입니다. - 펄스 웨이브 도플러 모드 이미지를 사용하여 심장 패키지 에서 MV 흐름 옵션을 선택하여 유입 혈액 속도를 측정합니다(그림4). 초기 이퍼스톨및 후기 이월에 대해 각각 E 또는 A를 선택하고 그래프에서 피크 속도를 결정합니다(그림3C).
- AoV 흐름을 선택하여 유출 혈속을 측정하고 추적의 피크를결정합니다(그림 3D).
- 보다 신뢰할 수 있는 평가를 위해 2가지 방법론을 사용하여 심박수를 측정합니다.
- 이미지 수집 중에 하트가 화면에 시각화되면 10s 내의 비트를 계산하고 6을 곱합니다.
- Vevo LAB 소프트웨어의 펄스 웨이브 도플러 이미지를 사용하여 3연속 대동맥 흐름 피크 사이의 심박수 버튼과 추적 간격을 선택합니다(그림4 및 그림 6).
- LV와 혈류의 피크를 추적 한 후 스프레드 시트로 데이터를 내보내려면 보고서를 클릭 | 수출 | | 엑셀로 저장.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
기재된 프로토콜은 인간 및 동물 심초음파에 사용되는 기술과 유사한 중요한 심장 치수 및 기능적 파라미터를 측정할 수 있게 한다. B-모드 이미지는 시스톨 및 익스로펠에서 심실 내벽을추적하고(그림 5)챔버 및 벽 치수와 같은 치수 데이터, 심박수, 스트로크 볼륨 및 심장 출력과 같은 기능 적 데이터뿐만 아니라 심실 수축기 기능의 파라미터(예: 분수 영역 변화 및 배출 분획 분수)를 얻을 수있습니다(표 1). 컬러 도플러 모드 이미지를 사용하여 방실 판막의 수준에서 측정은 또한 심실 유입 및 유출 혈액 속도 (혈액이 각각 심실을 채우고 종료하는 속도)를 제공합니다(그림 3 및 표 1).
본 연구에서 얻어진 파라미터는 유사한 실험 조건을 사용하여 이전 연구에서 보고된것들과비교하였다6,16, 17,17 (표 1),상기 방법의 재현성을 더욱 입증하였다. 전반적으로, 우리는 이 상세한 프로토콜을 사용하여 연구 도중 다른 심장 표현형을 비교할 때 중요한 zebrafish 심장 기능을 효과적이고 일관되게 평가할 수 있다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 성체 얼룩말 심장의 그림. 혈류 순환은 화살표로 표현됩니다 : 부비동 정맥에서 심방으로 혈액이 흐르고 심실로 더 옮겨져 전구 동맥으로 펌핑됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 물고기 이미징 챔버. (a)물고기 이미징 "챔버"를 준비하기 위해, 수직 방향으로 절개가 있는 스폰지가 유리 용기에 놓인다. (B)유리 용기를 경사진 이미징 플랫폼에 단단히 테이프로 고정합니다. (C)트랜스듀서는 조작기에 장착되고 올바른 이미징 포지셔닝을 위해 절개에 평행하게 배치됩니다(트랜스듀서 노치가 운전자를 향하고 있음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 방실 유입(A) 및 유출(B)은 컬러 도플러 모드 및 해당 펄스 웨이브 도플러에서 각각의 심실 확장기 파 피크(C) 및 심실 유출(D)의 속도를 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이미지 분석. 이미지 처리 후(이미지의 원하는 대비와 밝기를 달성하기 위해) PW 도플러 모드(왼쪽)와 B 모드(오른쪽) 이미지에서 측정을 수행할 수 있습니다. B 모드 이미지에서 LV 벽을 추적하려면 드롭다운 메뉴에서 심장 패키지를 선택하고 PSLAX로이동한 다음 LV 추적을선택합니다. PW 도플러 모드 이미지에서 피크 속도를 측정하려면 드롭다운 메뉴에서 심장 패키지를 선택합니다. 심실 혈액 유입 속도를 측정하려면 MV 흐름 옵션을 선택하고 조기 이월 및 후기 이월제의 경우 E 또는 A를 각각 선택합니다. 유출 혈중 속도를 측정하기 위해 AoV 흐름 및 AV 피크 속도를 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: B 모드 이미지. (A)심실 (V)의 B 모드 이미지는 심방 (A)에서 나오는 혈액으로 채워진 디아토르에 있습니다. (B)Systole에서 심실의 B 모드 이미지, 전구 동맥을 통해 혈액을 배출 (B, 녹색 추적). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 펄스 웨이브 도플러 이미지. 3개의 연속적인 대동맥 유동 피크를 추적하여 심박수 값을 생성할 수 있습니다. 대동맥 유동 피크는 분석 소프트웨어의 측정 탭에서 심박수 버튼을 선택하여 표시할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수, 단위 ± sd | 이 연구는 | 왕, L. 외,2017; Lee, L. et al,2016 & Mishra, S. et al,2019 | 댓글/설명 |
| 심박수(HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | 야생 형 AB/ABTU 수컷과 암컷 3-12 개월 트리카인에서 마취 0.2 mg/mL |
| 분수 영역 변경(FAC) | 0.38 ± 0.03 | 0.29 ± 0.07 - 0.39 ± 0.05 | |
| 배출 분율(EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0.04 - 48 ± 0.03 | |
| 스트로크 볼륨(SV), μL | 0.21 ± 0.01 | 0.18 ± 0.06 - 0.28 ± 0.08 | |
| 심장 출력(CO), μL min-1 | 27.3 ± 1.69 | 19 ± 9.5 - 36.1 ± 7.8 | |
| E 피크 속도(초기 심실 유입), mm/s | 30 ± 6.8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| 피크 속도(심실 후기 유입), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| 심실 유출, mm/s | 86.6 ± 19 | 해당 /a |
표 1: 성인용 제브라피시의 심초음파 파라미터. 0.2 mg/mL 트리카인 용액에서 마취된 성인 남성 또는 암컷 제브라피시에 대한 현재 연구에서 평가된 심장 기능 파라미터에 대해 얻은 값. 이전 연구에서 동일한 파라미터에 대해 수득된 값의 범위는6,,16,,17에서 유사한 조건에서 수행되어 검증 및 표준화 방법을 돕기 위해 제시된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 성체 얼룩말어에서 심장 기능의 심초음파 이미징 및 평가를위한 체계적인 방법을 설명합니다. 심초음파는 살아있는 성인 물고기 심장 화상 진찰 및 기능 분석을 위한 유일한 유효한 비침범성 및 가장 강력한 방법이고, zebrafish 심장 혈관 연구에서 점점 더 대중화되고 있습니다. 필요한 시간은 짧으며 높은 처리량과 세로 연구를 할 수 있습니다. 그러나 사용되는 방법론과 데이터 분석에는 상당한 차이가 있습니다. 많은 변수가 다가오는 매개 변수에 영향을 미칠 수 있을 때 얼룩말 피시 심초음파의 표준화는 매우 어렵습니다. 실험 연구를 수행 할 때, 하나는 가변성을 생성 할 수있는 조건을 고려해야한다, 마취를 포함, 체중, 나이, 성별, 배경 변형. Wang, L 등16은 이러한 요인에 의해 도입된 가변성을 평가하고 방법을 표준화하기 위해 제브라피시 심장 기능에 대한 사용 가능한 데이터를 컴파일했습니다. 그들의 연구는 제브라피시 심초음파 평가와 관련된 실험 연구를 설계하는 데 매우 유용한 자원입니다. Wang, L 등16에서 제공하는 정보와 내부 참조 및 자체 관찰6을기반으로 프로토콜 최적화 및 재현성에 중요한 것으로 간주되는 중요한 단계및 조건에 대한 개요를 제공합니다.
표본의 선택: 이전 연구는 수축기 기능 매개 변수 (EF, FAC)가 성별 차이에 의해 크게 영향을받지 않지만, 확장기 기능 (즉 피크 웨이브 E / A 비율)이 6 개월 이상 여성에서 상당히 낮을 수 있음을 시사한다. 그것은 또한 관찰 되었다 심 실 영역 및 볼륨 물고기 나이 함께 크게 증가 (3 개월 이상) 그리고 그들의 높은 체중 및 크기 때문에 여성에서 상당히 높은. 확장기 부피를 체질량 지수(BMI)와 체표면적(BSA)으로 인덱싱하면 연령과 일치하는 여성과 남성의 차이를 폐지하는 데 도움이 될 수 있으며, BSA와 체중으로 인덱싱하면 연령과 관련된 확장기 부피 차이를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다16. 또한 다른 배경 균주16물고기 사이의 다른 확장기 기능의 보고가 있었다 . 전반적으로, 실험 디자인을 선택할 때, 연령 및 변형 일치 컨트롤을 사용하고 다른 남녀를 혼합하지 않는 것이 좋습니다. 이미지 품질이 중력 여성의 낮은로 남성을 사용하는 것이 좋습니다.
스캐닝 위치: 이 설정에서 두 개의 스캐닝 위치가 가능합니다: 세로 축과 짧은 축. 우리는 짧은 축 모드에서 심장 챔버를 식별하는 것이 매우 어렵다는 것을 발견했습니다. 따라서, 우리는 단지 세로 축을 사용하고 B 모드에서 심장 챔버의 묘사및 심실 크기와 기능의 유도에 대한 후자를 추천합니다.
마취: 측정 중에 중요한 서맥을 피하기 위해 적절한 식신분이 중요합니다. 심박수는 심장 기능 측정에 영향을 주어 연구의 정확도를 손상시게 합니다. 트리카인은 가장 흔한 마취제이며 0.2 mg/mL의 투여량은 적절한 완화를 제공하는 것으로 나타났다. 그러나, 측정 시간은 심박수가16에서3-4 분 후에 감소하기 시작하기 때문에 중요합니다. 가변성을 도입하지 않으려면 측정값을 3분 미만으로 유지하는 것이 중요합니다.
중요 파라미터: 일관성과 정확성을 목표로 할 때 심박수는 중요한 매개 변수로 간주될 수 있습니다. 심박수는 테스트된 실험 군과 사용된 조건에 대해 보고된 값의 범위 내에서 비교되어야 합니다. 우리는 118 ±14 내지 162±32 bpm의 범위가 3분 미만의 트리카인 0.2mg/mL로 마취된 야생형 제브라피시 3-12개월 에 대한 정상 값을 나타낼 수 있음을 발견하였다.
결과 정확도: 정확도를 보장하기 위해 최소 3회 의 심장 주기동안 측정을 수행해야 합니다. 보다 정확한 수동 이미지 추적을 얻으려면 분석이 블라인드 방식으로 수행되어야 합니다.
가장 적합한 조건을 선택하는 것 외에도 정확한 측정을 보장하기 위해 여러 측면이 중요합니다. 이상적으로, 조건은 가능한 한 정상적인 물고기 생리 적 상태에 가깝게 유지되어야한다. 물 속에서 스캔을 수행하면 물고기를 자연 환경에 유지하고 가스 교환, 물 조성, 정수압 및 온도에 대한 정상 조건에 가깝게 유지하는 장점이 있습니다. 이들은 스캐닝 물고기가 실내 공기에 노출 된 젖은 스폰지에 배치되는 이전 연구에 비해 명확한 장점이며 전도도는 물9,,10대신 초음파 젤에 의해 활성화됩니다. 수중 스캐닝은 또한 마취와 회복 사이의 시간이 3 분 미만으로 유지되고 물고기가 측정 후 즉시 회복 물로 반환되는 경우 시술 후 물고기를 복구 할 수 있습니다. 절차가 가능한 한 빠르고 효과적으로 수행되도록하려면 실험을 수행하기 전에 교육에 상당한 시간을 소비하는 것이 좋습니다.
심초음파는 뮤린(또는 다른 포유류) 동물 모델뿐만 아니라 임상 실습에서 심장 기능을 평가하는 아주 잘 확립된 방법입니다. 그러나, 뮤린 또는 인간의 심초음파와는 달리, 수중에서 물고기 초음파를 수행하는 것은 전극에 표본의 연결을 허용하지 않습니다. 따라서 심장과 호흡률을 직접 측정할 수 없습니다. 이 경우, 심박수는 10 분 또는 15 분 간격으로 분당 비트를 계산하거나 수동으로 3 개의 연속 대동맥 흐름 피크를 추적하여 측정 할 수 있습니다(그림 6). 심박수는 또한 심실 내벽 추적을 통해 뇌졸중 부피와 같은 파라미터가 얻어지면 수동으로 계산해야 하는 심장 출력과 같은 다른 매개 변수의 결정에도 영향을 미칩니다. 고려해야 할 또 다른 측면은 물고기 심장 형태가 포유류와 매우 다르다는 것입니다. 2 체면 제브라피시 심장에서, 심실 충진은 주로 심방 수축에 의해 결정되며, 물고기는 일반적으로 포유류18에비해 초기에서 후기 심실 충진 비율을 훨씬 낮게 제시한다. 이것은 제브라피시와 건강한 포유류 심장 사이의 A와 E 봉우리에서 펄스 파 도플러에 의해 얻은 다른 프로파일을 설명합니다.
심초음파를 통해 물고기 심장 프로필의 철저한 특성화와 여러 기능적 매개 변수의 정량화를 가능하게 합니다. 배출 분획, 분획면적 변화, 혈액 유입 및 유출 속도, 심박수 및 심장 출력에 대해 얻어진 값은 이전 연구에서 보고된범위(표 1)에있으며, 그 방법의 재현성을 강조한다. 종합하면, 우리의 데이터는 고주파 초음파 심초음파가 질병 모형 또는 약 시험을 평가할 때 zebrafish 심장 형태및 기능을 측정하는 강력하고 재현 가능한 방법임을 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 프레드 로버츠의 기술 지원 및 원고의 개정에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
