Summary
Vi beskriver en protokoll for å vurdere hjertemorfologi og funksjon i voksen sebrafisk ved hjelp av høyfrekvent ekkokardiografi. Metoden tillater visualisering av hjertet og påfølgende kvantifisering av funksjonelle parametere, for eksempel hjertefrekvens (HR), hjerteutgang (CO), fraksjonell områdeendring (FAC), utstøtingsfraksjon (EF) og blodstrøm og utstrømningshastigheter.
Abstract
Sebrafisken (Danio rerio) har blitt en svært populær modellorganisme i kardiovaskulær forskning, inkludert menneskelige hjertesykdommer, hovedsakelig på grunn av embryonisk gjennomsiktighet, genetisk tractability og fasilitet til raske, høygjennomstrømningsstudier. Tap av åpenhet begrenser imidlertid hjertefunksjonsanalyse på voksenstadiet, noe som kompliserer modellering av aldersrelaterte hjertesykdommer. For å overvinne slike begrensninger, er høyfrekvent ultralyd ekkokardiografi i sebrafisk fremsom et levedyktig alternativ. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å vurdere hjertefunksjon hos voksen sebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjelp av høyfrekvent ultralyd. Metoden tillater visualisering og analyse av sebrafisk hjertedimensjon og kvantifisering av viktige funksjonelle parametere, inkludert hjertefrekvens, slagvolum, hjerteutgang og utstøtingsfraksjon. I denne metoden blir fisken bedøvet og holdt under vann og kan gjenopprettes etter prosedyren. Selv om høyfrekvent ultralyd er en dyr teknologi, kan den samme bildeplattformen brukes til forskjellige arter (f.eks. murine og sebrafisk) ved å tilpasse forskjellige transdusere. Sebrafisk ekkokardiografi er en robust metode for hjerte fenotyping, nyttig i validering og karakterisering av sykdomsmodeller, spesielt sen sykdommer; narkotika skjermer; studier av hjerteskade, restitusjon og regenerativ kapasitet.
Introduction
Sebrafisken (Danio rerio) er en veletablert virveldyrmodell for studier av utviklingsprosesser og menneskelige sykdommer1. Sebrafisk har høy genetisk likhet med mennesker (70%), genetisk tractability, høy fecundity, og optisk åpenhet under embryonisk utvikling, som tillater direkte visuell analyse av organer og vev, inkludert hjertet. Til tross for å ha bare ett atrium og ett ventrikkel, er sebrafiskhjertet (Figur 1) fysiologisk lik pattedyr fire-kammerhjerter. Viktigere, sebrafisk hjertefrekvens, elektrokardiogram morfologi, og virkning ser potensial form på mennesker mer enn murine arter2. Disse funksjonene har gjort sebrafisk til en utmerket modell for kardiovaskulær forskning5og har gitt stor innsikt i hjerteutvikling3,,4, regenerering 5 , og patologiske forhold1,3,4 ,inkludertarteriosklerose, kardiomyopatier, arytmier, medfødte hjertesykdommer, og amyloid lyskjede kardiotoksisitet1,4,6. Vurdering av hjertefunksjon har vært mulig i embryonale stadiet (1-dagers etter befruktning) gjennom direkte videoanalyse ved hjelp av høyhastighets videomikroskopi7,,8. Sebrafisk mister imidlertid sin åpenhet utover embryonale stadium, og begrenser funksjonelle evalueringer av normale modne hjerter og sene hjertesykdommer. For å overvinne denne begrensningen, har ekkokardiografi blitt vellykket ansatt som en høyoppløselig, sanntid, ikke-invasiv bildebehandling alternativ for å evaluere voksen sebrafisk hjertefunksjon9,10,11,12,13,14,15.
I sebrafisk ligger hjertet ventrally i thoraxhulen umiddelbart bakre til gjellene med atriumet som ligger dorsal til ventrikkelen. Atriet samler venøs blod fra sinusvenosus og overfører det til ventrikkelen hvor det pumpes videre til bulbus arteriosus (Figur 1). Her beskriver vi en fysiologisk, undervannsprotokoll for å vurdere hjertefunksjon hos voksen sebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjelp av en lineær array ultralydsonde med en senterfrekvens på 50 MHz for B-modusavbildning med en oppløsning på 30 μm. Siden ultralydbølger lett kan reise gjennom vann, holder nærhet mellom fisken og skannesonden under vann gir nok kontaktoverflate for hjertedeteksjon uten behov for ultralydgel og er generelt mindre stressende for fisken. Selv om alternative sebrafisk ekkokardiografisystemer ble rapportert av flere forfattere9,12,13, her presenterer vi det generelle og mest brukte oppsettet som gjelder for høyfrekvent ultralyd hos dyr.
Metoden tillater høyoppløselig avbildning av voksen sebrafisk hjerte, sporing av hjertestrukturer, og kvantifisering av peak-hastigheter fra Doppler blodstrøm målinger. Vi viser pålitelig in vivo kvantifisering av viktige systoliske og diastoliske parametere, for eksempel utstøtingsfraksjon (EF), fraksjonell områdeendring (FAC), ventrikulær blodstrøm og utstrømningshastigheter, hjertefrekvens (HR) og hjerteutgang (CO). Vi bidrar til å etablere et pålitelig utvalg av normale friske voksne sebrafisk hjertefunksjonelle og dimensjonale parametere for å tillate en mer presis evaluering av patologiske tilstander. Samlet sett gir vi en robust metode for å vurdere hjertefunksjon i sebrafisk, som har vist seg svært nyttig i å etablere og validere sebrafisk hjertesykdom modeller6,16, hjerteskade og utvinning10,13, og regenerering11,12, og kan videre brukes til å evaluere potensielle legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer sebrafisk ble godkjent av vår institusjonelle dyreomsorgs- og brukskomité og er i samsvar med USDA Animal Welfare Act.
1. Eksperimentell oppsett
-
Sette opp plattformen for bildeanskaffelse
- Ved hjelp av liten saks eller en skalpell gjør et snitt på en svamp på 12-posisjonen for å holde fisken under skanning. Plasser svampen i en glassbeholder (Figur 2A).
MERK: Plasseringen av snittet skal gi nok plass til å bevege svingeren og også for å holde fisken belg vannledningen når plattformen er vippet for skanning (Figur 2). Snittet kan variere avhengig av fiskens størrelse; Men for en standard størrelse og vekt bør snittet være ca. 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (henholdsvis lengde, bredde og dybde). Glassbeholderen skal være minst 6 cm dyp for å unngå vannlekkasje mens du forestiller fisken. - Fest glassboksen som inneholder svampen på ultralydplattformen, for eksempel ved hjelp av dobbeltsidig tape. Kontroller at glassboksen er midt på plattformen og godt festet (figur 2B).
- Vipp plattformen forover ca. 30° ved hjelp av knotten på venstre side av plattformholderen (Figur 2B). Fyll glassplassen med 200-250 ml fiskesystemvann som inneholder 0,2 mg/ml trikainmetut (MS222).
MERK: Tricaine kan tilberedes som en 4 mg/ml lageroppløsning i Tris 40 mM pH 7 og ytterligere fortynnet til ønsket konsentrasjon i fiskesystemvann; 0,2 mg/ml ble funnet å være den beste konsentrasjonen16. Den 4 mg/ml tricaine lageroppløsningen kan oppbevares i lang tid ved -20 °C eller ved 4 °C i én måned. - Sett svingeren inn i mikromanipulatorholderen på arbeidsbanestasjonen, og vri tilhengerens hakk mot operatøren. Hold matrisen parallelt med bakken med arbeidssiden langsgående med hensyn til scenen (se figur 2B). La nok plass (10 cm på begge sider) for det nå tilkoblede transduserskinnesystemet til å bevege seg langs x- og y-aksene.
- Logg inn på kontrollprogramvaren og velg Mus (liten) Vaskulær. Lag en ny studie samt en ny serie for hvert dyr som inngår i studien. Finn den nye studieknappen nederst til venstre på skjermen på lesersiden (visningen starter i B-modus).
- Ved hjelp av liten saks eller en skalpell gjør et snitt på en svamp på 12-posisjonen for å holde fisken under skanning. Plasser svampen i en glassbeholder (Figur 2A).
2. Håndtering av fisken
MERK: Sebrafisk som ble brukt i denne studien var voksne, 11 måneder gamle hanner av villtypestammen AB/Tuebingen (AB/TU). Sebrafisk ble opprettholdt i et frittstående gjennomstrømningsakvariumsystem ved 28 °C i en konstant lyssyklus satt som 14 timer lett/10 timer mørkt. Sebrafisk ble matet to ganger daglig med saltlake reker (Artemia nauplii) og tørr mat flak.
- Ved hjelp av et fiskenett overfører du fisken til en liten tank som inneholder systemvann med 0,2 mg/ml tricaine. Vent til fisken er fullstendig bedøvet (ingen bevegelse og ingen respons på berøring).
- Ved hjelp av en plast teskje, forsiktig og raskt overføre fisken inn i glassboksen som inneholder svampen til tidligere gjort snitt med ventral side av fisken vendt opp.
MERK: Pass på at fiskens hode er plassert mot operatøren (samme retning som transduserens hakk) og på et litt høyere nivå sammenlignet med resten av kroppen for å oppnå bedre hjertevisualisering. - Senk svingeren forsiktig (hold sin opprinnelige posisjon) ved hjelp av håndtaket på skinnesystemet, plasser den langsgående og nær ventralsiden av fisken med hakket av svingeren vendt mot operatøren. La 2-3 mm clearance fra fisken stå klart. Juster plattformen i forhold til svingeren ved hjelp av mikromanipulatoren i alle 3 akser til fiskehjertet visualiseres og deretter starte bildeoppkjøp. Vinkelen på svingeren bør ikke endres under hele bildeanskaffelsen (figur 2C).
MERK: Så lenge det er nok nærhet (opptil 1 cm), vil vannet på toppen av fisken gi en kontaktflate via flytende overflatespenning som tillater overføring av ultralydbølgene mellom sonden og fisken. Derfor er det ikke nødvendig å presse svingeren mot fisken. Prøv å fullføre dette trinnet og fullføre skanningen på mindre enn 3 minutter for å forhindre fiskedød eller en reduksjon av hjertefrekvensen under bildeinnhenting. Bruk eventuelt en timer. Hjertet kan bli funnet på oversiden av skjermen mot venstre side av øyet, som lett kan visualiseres hvis du flytter x-aksen helt til høyre. Hvis det fortsatt er problemer med å finne hjertet mens du er i B-modus, bytt til farge Doppler-modus, som vil tillate sporing av blodstrøm (rødt indikerer blod som strømmer mot operatøren) og lokaliserer hjertet.
3. Bildeoppkjøp
MERK: Se Materialtabellen for bildebehandlingssystem og bildeanalyseprogramvare.
- Lengdegrad B-modus
- Når du har lokalisert hjertet, velger eller forblir i B-modus (finnes nederst til venstre på berøringsskjermen etter å ha startet en ny serie) og reduserer feltet for å zoome inn og ta en nærmere titt på hjertet for enklere sporing under analysen.
- For å ha en nærmere og klarere visning av hjertet i B-Mode bildeoppkjøp, reduser feltet ved å zoome inn. Bruk berøringsskjermen til å begrense feltet manuelt på både x- og y-aksene.
- Hvis det er nødvendig, kan du forbedre kvaliteten/kontrasten til bildet ved å sette det dynamiske området til 45-50 dB. Gå til B-moduskontrollene i alternativet Flere kontroller, og lagre deretter endringen i Modusforhåndsinnstillinger. Trykk på Modusforhåndsinnstillinger for å velge innstillingen for optimalisert bildeanskaffelse hver gang før du begynner å bilde av en ny serie.
- Ta så mange bilder som ønsket i det lange akseplanet ved å velge Lagre bilde.
MERK: Mer detaljert informasjon og opplæringsressurser om bildeinnhenting finner du på https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab og https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Lengdetred visning pulsbølge
- Bytt til Farge-Doppler for Color visning av blodstrøm (velg Farge-knapp) og oppkjøp (funnet nederst til venstre på berøringsskjermen etter å ha startet en ny serie).
- Ved hjelp av berøringsskjermen plassere kvadranten på toppen av atrioventrikulær ventil og lokalisere tilstrømningen, som vil bli preget av den røde fargesignal (Figur 3A). Reduser kvadrantområdet så mye som mulig for å øke bildefrekvensen.
MERK: Senk fargepuls-repetisjonsfrekvens (Farge PRF) (hastighetsområde) for å sikre at gul farge kan ses i hastighetsprofilen til Color Doppler-bildet. Dette vil øke omfanget av hastigheter som kan sees og vil bidra til å skape en mosaikk av farge som vil tillate å visualisere tydeligere topp hastigheter. - Aktiver pulsbølge (velg PW) Doppler-modus for å prøve ventrikulær blodstrømhastighet. Plasser prøvevolumporten i midten av atrioventrikulær ventil (der det røde fargesignalet blir mer gulaktig) for å oppdage maksimal strømningshastighet. Juster PW-vinkelen på skjermen ved hjelp av fingrene slik at den justeres med retningen på blodstrømmen. Trykk på start eller oppdater for å starte prøvetaking av hastigheten på blodet som strømmer inn i ventrikkelen.
MERK: Kontroller at vinkelen riktig linje er parallelt med blodstrømmen for å gi konsistente og reproduserbare resultater. Plassere vinkelen riktig linje slik at den samsvarer med retningen av blodstrømmen vil sikre at hastighetene er nøyaktig fanget. - Gjenta trinn 3.2.3 for å bestemme utstrømningshastigheten ved å plassere Color Doppler-kvadranten i krysset mellom ventrikkelen og bulbus (bulbuventricular ventil) og lokalisere strømmen, som vil bli preget av et blått fargesignal (Figur 3B). Plasser prøvevolumporten rett før ventrikkelen og juster vinkelkorreksjonslinjen slik at den samsvarer med retningen på blodstrømmen.
MERK: Som nevnt tidligere, for å oppnå nøyaktige hastighetsverdier, må du kontrollere at PW-vinkelen er på linje med blodstrømmen. - Juster baseline (stolpen), senking eller heving av den i strømningshastighetspanelet for å oppdage og spore signaltoppene helt (figur 3C,D). Identifiser tilsigstoppene i øvre/positiv kvadrant (signalet som går mot sonden) og utstrømningstoppene i nedre/negative kvadrant (signalet går bort fra sonden).
4. Utvinning av fisk
- Så snart bildeoppkjøpet er fullført, ved hjelp av en teskje, overføre fisken til vanlig system luftet vann fri for tricaine og la fisken gjenopprette (vanligvis tar 30 s til 2 min for å gjenoppta gjelle bevegelse og svømming).
- For å hjelpe utvinning, sprutvann gjentatte ganger over gjellene ved hjelp av en overføringspipette for å fremme lufting av vann og oksygenoverføring.
5. Bildeanalyse
- Åpne bildeanalyseprogramvaren.
- Velg et bilde og klikk på bildebehandlingsikonet (Figur 4). Ved hjelp av den tilgjengelige skalaen (Figur 4) justerlysstyrken og kontrasten til bildet for å tillate klar visualisering av ventrikulære vegger eller blodstrømsmønster.
- Bruk B-modusbildet til å åpne rullegardinlisten fra PSLAX-alternativet (parasternal lang akse) på hjertepakken/målingene (figur 4). Velg LV spor og spor ventrikulær indre veggen på systole og diastole for å få ventrikulær området (VA) i systole (VAs) og diastole (VAd), ende diastolisk volum (EDV), og avslutte systolisk volum (ESV) ( Figur5A,B).
MERK: Volumverdier ekstrapoleres fra 2D-bildesporinger og kan avvike fra 3D-enheten. For alle målinger, gjennomsnittlig minst 3 representative hjertesykluser per dyr. - Legg merke til slagvolum og utstøtingsfraksjon som automatisk beregnes og vises av programvaren.
MERK: Strøkvolum og utstøtingsfraksjon kan også beregnes manuelt ved hjelp av formlene
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
der SV er slagvolum, EDV er endediastolisk volum, ESV er slutt systolisk volum, og EF er utstøtingsfraksjon - Beregne endring av brøkområde ved hjelp av formelen
FAC = (VAd - VAd)/ VAd
der FAC er fraksjonelt område endring, VAd er ventrikulær område i diastole, og VAs er ventrikulær område i systole. - Beregne hjerteutgangen ved hjelp av formelen
CO = HR x SV
der CO er hjerteutgang, HR er hjertefrekvens, og SV er hjerneslag volum - Bruk bildet Pulsed Wave Doppler Mode til å måle tilsigsblodstrømmen ved å velge MV Flow-alternativet under hjertepakken (Figur 4). Velg Henholdsvis E eller A for tidlig diastole og sen diastole, og bestem topphastighetenpå grafen (figur 3C).
- Mål utstrømningshastigheten ved å velge AoV Flow og bestemme toppene på sporingen (figur 3D).
- Mål hjertefrekvensen ved hjelp av 2 forskjellige metoder for en mer pålitelig vurdering:
- Når hjertet visualiseres på skjermen under bildeinnhenting, telle beats innen 10 s og multiplisere det med 6.
- Ved hjelp av Pulse Wave Doppler-bildet på Vevo LAB-programvaren velger du pulsknappen og sporingsintervallene mellom 3 påfølgende aortastrømningstopper (Figur 4 og Figur 6).
- Hvis du vil eksportere data til et regneark etter å ha sporet LV og toppene i blodstrømmen, klikker du på rapport | eksport | lagre som | excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokollen gjør det mulig å måle viktige hjertedimensjonale og funksjonelle parametere, analog ti digre med teknikken som brukes i human og dyr ekkokardiografi. B-Mode-bildene gjør det mulig å spore ventrikulær indre vegg i systole og diastole (Figur 5) og innhenting av dimensjonale data, for eksempel kammer- og veggdimensjoner, og funksjonelle data, for eksempel hjertefrekvens, slagvolum og hjerteutgang, samt parametere for ventrikulær systolisk funksjon, for eksempel fraksjonell områdeendring og utstøtingsfraksjon (tabell 1). Målinger på nivået av atrioventrikulær ventil ved hjelp av farge Doppler Mode bilder gir også ventrikulær tilstrømning og utstrømning blodstrømmen (hastighet der blodet fyller og utavventrikkelen, henholdsvis) (Figur 3 og tabell 1).
Parametrene som ble oppnådd i denne studien var sammenlignbare med de som ble rapportert i tidligere studier ved hjelp av lignende eksperimentelle forhold6,,16,17 ( Tabell1), som ytterligere viser reproduserbarheten av metoden. Samlet sett viser vi at ved hjelp av denne detaljerte protokollen kan man effektivt og konsekvent vurdere sebrafisk hjertefunksjon, noe som er avgjørende når man sammenligner forskjellige hjertefenotyper under en studie.
Figur 1: Illustrasjon av voksen sebrafisk hjerte. Blodstrømmen sirkulasjon er representert av piler: blodet strømmer fra sinus venosus til atrium og overføres videre til ventrikkelen, hvor det pumpes til bulbus arteriosus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fiskebildekammer. (A) For å forberede et fiskebilde "kammer", er en svamp med et snitt mot den ene enden i en vertikal orientering plassert i en glassbeholder. (B) Glassbeholderen er deretter godt teipet på den skrånende bildeplattformen. (C) Svingeren er montert på manipulatoren og plassert parallelt med snittet for riktig bildebehandlingsposisjonering (svingerhakket peker mot operatøren). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Atrioventrikulær innstrømning (A) og utstrømning (B) i fargedopplermodus og tilsvarende pulsert bølgedoppler for å vurdere hastigheter på de respektive ventrikulære diastoliske bølgetoppene (C) og ventrikulær utstrømning (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bildeanalyse. Etter bildebehandling (for å oppnå ønsket kontrast og lysstyrke på bildet), kan målinger utføres i PW Doppler-modus (venstre) og B-modus (høyre) bilder. Hvis du vil spore LV-veggen i B-modusbildet, velger du Hjertepakke fra rullegardinmenyen, går til PSLAXog velger LV Trace. Hvis du vil måle topphastigheter i PW Doppler-modusbildet, velger du Hjertepakke fra rullegardinmenyen. For å måle ventrikulær blodstrømhastighet, velg MV Flow-alternativet og velg E eller A for tidlig diastole og sen diastole, henholdsvis. For å bestemme utstrømningshastigheten, velg AoV Flow og AV topphastighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bilder i B-modus. (A) B-Mode bilde av ventrikkelen (V) i diastole, fylt med blod som kommer fra atrium (A). (B) B-Mode bilde av ventrikkelen i systole, kaste ut blod gjennom bulbus arteriosus (B, grønn sporing). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Pulse Wave Doppler bilde. En pulsverdi kan genereres ved å spore 3 påfølgende aortastrømningstopper. De aortastrømningstoppene kan vises ved å velge pulsknappen i kategorien målinger i analyseprogramvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parametere, enheter ± sd | Denne studien | Wang, L. et al, 2017; Lee, L. et al, 2016 & Mishra, S. et al, 2019 | Kommentarer/Beskrivelse |
| Hjertefrekvens (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | Villtyper AB/ABTU menn og kvinner mellom 3-12 måneder bedøvet i tricaine 0,2 mg/ml |
| Brøkdelsområdeendring (FAC) | 0,38 ± 0,03 | 0,29 ± 0,07 - 0,39 ± 0,05 | |
| Utstøtingsfraksjon (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0,04 - 48 ± 0,03 | |
| Stroke volum (SV), μL | 0,21 ± 0,01 | 0,18 ± 0,06 - 0,28 ± 0,08 | |
| Hjerteutgang (CO), μL min-1 | 27,3 ± 1,69 | 19 ± 9,5 - 36,1 ± 7,8 | |
| E topphastighet (tidlig ventrikulær innstrømning), mm/s | 30 ± 6,8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| En topphastighet (sen ventrikulær innstrømning), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| Ventrikulær utstrømning, mm/s | 86,6 ± 19 | N/a |
Tabell 1: Ekkokardiografiske parametere hos voksne sebrafisk. Verdier oppnådd for hjertefunksjonsparametrene evaluert i den nåværende studien for voksen mannlig eller kvinnelig sebrafisk mellom 3 og 12 måneder bedøvet i en 0,2 mg/ml tricainoppløsning. Et område av verdiene oppnådd for de samme parametrene i tidligere studier6,16,17 utført under lignende forhold presenteres for validering og for å bidra til å standardisere metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en systematisk metode for ekkokardiografisk avbildning og vurdering av hjertefunksjon hos voksen sebrafisk. Ekkokardiografi er den eneste tilgjengelige ikke-invasive og mest robuste metoden for levende voksen fisk hjerteavbildning og funksjonell analyse, og det blir stadig mer populært i sebrafisk kardiovaskulær forskning. Mengden av tid som trengs er kort og gir mulighet for høy gjennomstrømning og langsgående studier. Det er imidlertid stor variasjon i metodikken som er brukt og dataanalyse. Standardisering av sebrafisk ekkokardiografi er svært vanskelig når så mange variabler kan påvirke de kommende parametrene. Når man utfører eksperimentelle studier, bør man vurdere forhold som kan produsere variasjon, inkludert anestesi, kroppsvekt, alder, kjønn og bakgrunnsbelastning. Wang, L et al.16 vurderte variabiliteten introdusert av disse faktorene og utarbeidet tilgjengelige data om sebrafisk hjertefunksjon for å bidra til å standardisere metoden. Deres studie er en svært nyttig ressurs for å designe eksperimentelle studier som involverer sebrafisk ekkokardiografisk vurdering. Basert på informasjonen fra Wang, L et al.16 og referanser innenfor og våre egne observasjoner6, gir vi en oversikt over kritiske skritt og betingelser vi betraktet som viktige for protokolloptimalisering og reproduserbarhet:
Valg av prøven: Tidligere studier tyder på at selv om systolisk funksjonsparametre (EF, FAC) ikke påvirkes betydelig av kjønnsforskjeller, kan diastolisk funksjon (nemlig toppbølge E/A-forhold) være betydelig lavere hos kvinner eldre enn 6 måneder. Det ble også observert at ventrikulære områder og volumer øker betydelig med fiskealder (3 måneder og eldre) og er betydelig høyere hos kvinner på grunn av høyere kroppsvekt og størrelse. Indeksering av diastoliske volumer til kroppsmasseindeks (BMI) og kroppsoverflate (BSA) kan bidra til å avskaffe forskjeller mellom alderstilpassede kvinner og menn, og indeksering til BSA og vekt kan bidra til å overvinne aldersrelaterte diastoliske volumforskjeller16. Det var også rapporter om ulike diastoliske funksjoner mellom fisk med ulike bakgrunnstammer16. Samlet sett, når du velger eksperimentell design, er det tilrådelig å bruke alders- og belastningstilpassede kontroller og unngå å blande forskjellige kjønn. Bruk av menn anbefales, da bildekvaliteten var lavere hos gravide kvinner.
Skanneposisjon: I dette oppsettet er to skanneposisjoner mulige: langsgående akse og kort akse. Vi fant ut at i kort aksemodus var det svært vanskelig å identifisere hjertekamrene. Derfor brukte vi bare langsgående akse og anbefaler sistnevnte for avgrense av hjertekamrene i B-modus og avledning av ventrikulær størrelse og funksjon.
Anestesi: Tilstrekkelig sedasjon er avgjørende for å unngå betydelig bradykardi under måling. Hjertefrekvensen vil påvirke hjertefunksjonell måling, noe som går på bekostning av nøyaktigheten av studien. Tricaine er det vanligste bedøvelsesmidlet, og en dose på 0,2 mg/ml ble funnet å gi tilstrekkelig sedasjon. Måletiden er imidlertid kritisk siden hjertefrekvensen begynner å avta etter 3-4 min under sedasjon16. For å unngå å innføre variabilitet, er det avgjørende å holde målinger under 3 min.
Kritiske parametere:Hjertefrekvens kan betraktes som en kritisk parameter når du sikter mot konsistens og nøyaktighet. Hjertefrekvensen bør være sammenlignbar mellom eksperimentelle grupper testet og innenfor verdiområdet som rapporteres for forholdene som brukes. Vi fant at et område på 118 ± 14 til 162 ± 32 bpm kan representere de normale verdiene for villtype sebrafisk 3-12 måneder gamle voksne bedøvet med 0,2mg/ ml tricaine i mindre enn 3 min.
Resultatnøyaktighet: For å sikre nøyaktighet bør målinger tas over minst 3 hjertesykluser. For å oppnå mer nøyaktige manuelle bildesporinger, bør analysen gjøres på en blindet måte.
I tillegg til å velge de mest hensiktsmessige forholdene, er flere aspekter avgjørende for å sikre nøyaktig måling. Ideelt sett bør forholdene holdes så nær den normale fiskefysiologiske tilstanden som mulig. Å utføre skanningen under vann har fordelen av å holde fisken i sitt naturlige miljø og nær normale forhold for gassutveksling, vannsammensetning, hydrostatisk trykk og temperatur. Dette er klare fordeler i forhold til tidligere studier, hvor under skanningen fisk er plassert i en våt svamp utsatt for romluft og ledningsevne er aktivert av ultralyd gel i stedet for vann9,10. Undervannsskanning gjør det også mulig å utvinning av fisken etter prosedyren, forutsatt at tiden mellom anestesi og utvinning holdes under 3 min og fisken returneres til utvinning vann umiddelbart etter måling. For å sikre at prosedyren utføres så raskt og effektivt som mulig, er en betydelig mengde tid brukt på trening tilrådelig før du utfører eksperimenter.
Ekkokardiografi er en meget veletablert metode for å evaluere hjertefunksjon i klinisk praksis, så vel som i murine (eller andre pattedyr) dyremodeller. Men i motsetning til murine eller menneskelig ekkokardiografi, tillater ikke det å utføre fiskeultralyd under vann tilkobling av prøven til elektrodene. Direkte måling av hjerte- og respirasjonsfrekvenser er derfor ikke mulig. I så fall kan hjertefrekvensen måles ved å telle slagene per min i et intervall på 10 eller 15 minutter eller ved å spore 3 påfølgende aortastrømningstopper manuelt (figur 6). Hjertefrekvensen påvirker også bestemmelse av andre parametere, for eksempel hjerteutgang, som må beregnes manuelt når parametere som slagvolum er oppnådd gjennom ventrikulær indre veggsporing. Et annet aspekt å vurdere er at fiskehjertemorfologi er ganske forskjellig fra pattedyr. I det to-kamret sebrafiskhjertet bestemmes ventrikulær fylling for det meste av atriekontraksjon, og fisk presenterer vanligvis et mye lavere tidlig til sent ventrikulært fyllingsforhold sammenlignet med pattedyr18. Dette forklarer den forskjellige profilen oppnådd av pulsbølge Doppler i A- og E-topper mellom sebrafisk og friske pattedyrhjerter.
Ekkokardiografi muliggjør en grundig karakterisering av fiskens hjerteprofil og kvantifisering av flere funksjonelle parametere. Verdiene oppnådd for utstøtingsfraksjon, fraksjonell områdeendring, blodtilførsel og utstrømningshastigheter, hjertefrekvens og hjerteutgang er i området rapportert av tidligere studier (Tabell 1), som fremhever reproduserbarheten av metoden. Samlet sett viser våre data at høyfrekvent ultralydekkokardiografi er en robust og reproduserbar metode for å måle sebrafisk hjertemorfologi og funksjon ved evaluering av sykdomsmodeller eller narkotikatesting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Fred Roberts' tekniske støtte og revisjon av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
