Summary
Vi beskriver ett protokoll för att bedöma hjärtmorfologi och funktion hos vuxna zebrafiskar med högfrekvent ekokardiografi. Metoden möjliggör visualisering av hjärtat och efterföljande kvantifiering av funktionella parametrar, såsom puls (HR), hjärtutgång (CO), fraktionerad områdeförändring (FAC), utmatningsfraktion (EF) och blodflödeoch utflödeshastigheter.
Abstract
Zebrafisken (Danio rerio) har blivit en mycket populär modellorganism inom kardiovaskulär forskning, inklusive mänskliga hjärtsjukdomar, till stor del på grund av dess embryonala öppenhet, genetiska tractability och bekvämligheter till snabba, höggenomströmningsstudier. Förlusten av öppenhet begränsar dock hjärtfunktionsanalysen i vuxenstadiet, vilket komplicerar modelleringen av åldersrelaterade hjärtproblem. För att övervinna sådana begränsningar, högfrekvent ultraljud ekokardiografi i zebrafisk växer fram som ett hållbart alternativ. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att bedöma hjärtfunktionen hos vuxna zebrafiskar med icke-invasiv ekokardiografi med högfrekvent ultraljud. Metoden möjliggör visualisering och analys av zebrafisk hjärta dimension och kvantifiering av viktiga funktionella parametrar, inklusive puls, stroke volym, hjärtminut, och utmatning fraktion. I denna metod snarasseder och hålls under vattnet och kan återvinnas efter ingreppet. Även om högfrekvent ultraljud är en dyr teknik, kan samma bildplattform användas för olika arter (t.ex. murine och zebrafisk) genom att anpassa olika givare. Zebrafisk ekokardiografi är en robust metod för hjärt fenotypning, användbar i validering och karakterisering av sjukdomsmodeller, särskilt sena sjukdomar; drogskärmar; studier av hjärtskada, återhämtning och regenerativ kapacitet.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) är en väletablerad ryggradsdjursmodell för studier av utvecklingsprocesser och mänskliga sjukdomar1. Zebrafisk har hög genetisk likhet med människor (70%), genetisk tractabilitet, hög fruktbarhet och optisk transparens under embryonal utveckling, vilket möjliggör direkt visuell analys av organ och vävnader, inklusive hjärtat. Trots att zebrafiskhjärtat (figur 1)bara har ett atrium och en kammare, är det fysiologiskt liknar däggdjursfyra kaminerade hjärtan. Viktigt, zebrafisk puls, elektrokardiogram morfologi, och åtgärder potential form liknar människors mer än murine arter2. Dessa funktioner har gjort zebrafisk en utmärkt modell för kardiovaskulär forskning och har gett stora insikter i hjärtutveckling3,4,förnyelse5, och patologiskt villkor31,,3,4, inklusive åderförkalkning, kardiomyopatier, arytmier, medfödda hjärtsjukdomar, och amyloid ljuskedja kardiotoxicitet1,4,,6. Bedömning av hjärtfunktionen har varit möjlig under det embryonala stadiet (1 dagar efter befruktning) genom direkt videoanalys med hjälp av höghastighetsvideomikroskopi7,8. Zebrafisk förlorar dock sin transparens bortom det embryonala stadiet, vilket begränsar funktionella utvärderingar av normala mogna hjärtan och sent debuten hjärtproblem. För att övervinna denna begränsning, ekokardiografi har framgångsrikt använts som en högupplöst, realtid, noninvasive imaging alternativ för att utvärdera vuxna zebrafisk hjärtfunktion9,10,,11,12,13,14,15.
I zebrafiskar ligger hjärtat ventrally i brösthålan omedelbart i bakre hand till gälarna med atriumet som ligger ryggmot ventrikeln. Atriumet samlar venöst blod från sinus venosus och överför det till ventrikeln där det pumpas vidare till bulbus arteriosus (figur 1). Här beskriver vi ett fysiologiskt, under vattnet, protokoll för att bedöma hjärtfunktionen hos vuxna zebrafiskar med icke-invasiv ekokardiografi med hjälp av en linjär matrisultraljudssond med en mittfrekvens på 50 MHz för B-lägesavbildning med en upplösning på 30 μm. Eftersom ultraljudsvågor lätt kan färdas genom vatten, hålla nära närheten mellan fisken och skanningssonden under vattnet ger tillräckligt med kontaktyta för hjärtdetektering utan behov av ultraljud gel och är totalt sett mindre stressande för fisken. Även alternativa zebrafisk ekokardiografi system rapporterades av flera författare9,12,13, här presenterar vi den allmänna och vanligaste installationen som gäller för högfrekventultraljud hos djur.
Metoden möjliggör högupplöst avbildning av det vuxna zebrafiskhjärtat, spårning av hjärtstrukturer och kvantifiering av topphastigheter från Dopplerblodflödesmätningar. Vi visar tillförlitlig in vivo kvantifiering av viktiga systoliska och diastoliska parametrar, såsom utmatningfraktion (EF), fraktionerad områdesförändring (FAC), ventrikulärt blodflöde och utflödeshastigheter, hjärtfrekvens (HR) och hjärtminutvolym (CO). Vi bidrar till att etablera ett tillförlitligt utbud av normala friska vuxna zebrafiskar hjärt funktionella och dimensionella parametrar för att möjliggöra en mer exakt utvärdering av patologiskt tillstånd. Sammantaget ger vi en robust metod för att bedöma hjärtfunktionen hos zebrafisk, som har visat sig vara mycket användbar för att etablera och validera zebrafisk hjärtsjukdommodeller66,16,hjärtskada och återhämtning10,,13,och förnyelse11,,12,och kan användas ytterligare för att utvärdera potentiella läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar zebrafisk godkändes av vår kommitté för institutionsvård och användning av djur och bruk och är i enlighet med LAGEN om djurskydd.
1. Experimentell upplägg
-
Ställa in plattformen för bildförvärv
- Med hjälp av små saxar eller en skalpell gör ett snitt på en svamp vid 12-tiden position för att hålla fisken under skanning. Placera svampen i en glasbehållare (figur 2A).
OBS: Snittets placering bör ge tillräckligt med utrymme för att flytta givaren och även för att hålla fisken bälg vattenlinjen när plattformen lutas för skanning(bild 2). Snittet kan variera beroende på fiskens storlek; För en standardstorlek och vikt bör dock snittet vara cirka 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (längd, bredd respektive djup). Glasbehållaren bör vara minst 6 cm djup för att undvika vattenläckage medan du avvisar fisken. - Fäst glaslådan som innehåller svampen på ultraljudsplattformen, till exempel med dubbelhäftande tejp. Se till att glaslådan är i mitten av plattformen och ordentligt fäst(bild 2B).
- Luta plattformen framåt ca 30° med hjälp av ratten på plattformshållarens vänstra sida(bild 2B). Fyll glastorget med 200-250 ml fisksystemvatten som innehåller 0,2 mg/mL tricainmetansulfonat (MS222).
OBS: Tricaine kan beredas som en 4 mg/ml lagerlösning i Tris 40 mM pH 7 och ytterligare spädas ut till önskad koncentration i vatten i fisksystemet; 0,2 mg/ml befanns vara den bästa koncentrationen16. 4 mg/mL tricaine-lagerlösningen kan lagras under en längre tid vid -20 °C eller vid 4 °C under en månad. - För in givaren i mikromanipulatorhållaren på arbetsstationen och vrid givarens skåra mot föraren. Håll matrisen parallellt med marken med arbetssidan längsgående med avseende på scenen (se figur 2B). Lämna tillräckligt med utrymme (10 cm på båda sidor) för det nu anslutna givaren-skena systemet för att röra sig längs x- och y-axlarna.
- Logga in på kontrollprogramvaran och välj Mus (Liten) Vaskulär. Skapa en ny studie samt en ny serie för varje djur som ingår i studien. Hitta den nya studieknappen längst ned till vänster på skärmen på webbläsarsidan (vyn startar i B-läge).
- Med hjälp av små saxar eller en skalpell gör ett snitt på en svamp vid 12-tiden position för att hålla fisken under skanning. Placera svampen i en glasbehållare (figur 2A).
2. Hantering av fisken
OBS: Zebrafisk som användes i denna studie var vuxna, 11 månader gamla hanar av vilda stammen AB/Tuebingen (AB/TU). Zebrafisk hölls i ett fristående flödesgenomförande akvariumsystem vid 28 °C i en konstant ljuscykel som sattes som 14 h ljus/10 h mörkt. Zebrafisk matades två gånger dagligen med saltlake räkor (Artemia nauplii) och torrmat flingor.
- Använd ett fisknät, överför fisken till en liten tank som innehåller systemvatten med 0,2 mg/mL tricaine. Vänta tills fisken är helt sövd (ingen rörelse och inget svar på beröring).
- Med hjälp av en plast tesked, försiktigt och snabbt överföra fisken i glaslådan som innehåller svampen i tidigare gjorda snitt med ventrala sidan av fisken uppåt.
OBS: Se till att fiskens huvud är placerat mot operatören (samma riktning som givarens hack) och på en något högre nivå jämfört med resten av kroppen för att uppnå bättre hjärtvisualisering. - Sänk försiktigt givaren (håll sitt ursprungliga läge) med handtaget på järnvägssystemet, placera den längsgående och nära fiskens ventrala sida med skåran av givaren vänd mot operatören. Låt 2-3 mm (högst 1 cm) fritt utrymme från fisken. Justera plattformen med avseende på givaren med hjälp av mikromanipulatorn i alla 3 axlarna tills fiskhjärtat visualiseras och starta sedan bildinlärning. Givarens vinkel bör inte ändras under hela bildförvärvet (figur 2C).
OBS: Så länge det finns tillräckligt med närhet (upp till 1 cm), kommer vattnet ovanpå fisken att ge en kontaktyta via flytande ytspänning som möjliggör överföring av ultraljudsvågorna mellan sonden och fisken. Därför finns det ingen anledning att driva givaren mot fisken. Försök att slutföra detta steg och avsluta skanningen på mindre än 3 minuter för att förhindra fisk död eller en minskning av hjärtfrekvensen under bildförvärv. Om det behövs, använd en timer. Hjärtat finns på den övre sidan av skärmen mot vänster sida av ögat, som lätt kan visualiseras om du flyttar x-axeln hela vägen till höger. Om det finns fortsatt svårigheter att hitta hjärtat medan du är i B-läge, växla till färg Doppler-läge, vilket gör det möjligt att spåra blodflödet (rött indikerar blodflödet som flyter mot operatören) och lokalisera hjärtat.
3. Bild förvärv
Se Materialtabell för bildsystem och bildanalysprogram.
- Longitudinell vy B-läge
- Efter att ha lokaliserat hjärtat väljer eller stannar du i B-läge (finns längst ned till vänster på pekskärmen efter att ha initierat en ny serie) och reducerat fältet för att zooma in och ta en närmare titt på hjärtat för enklare spårning under analys.
- För att få en närmare och tydligare bild av hjärtat i B-Mode bildförvärv, minska fältet genom att zooma in. Använd pekskärmen för att begränsa fältet manuellt på både x- och y-axlarna.
- Om det behövs, förbättra bildens kvalitet/kontrast genom att ställa in det dynamiska omfånget till 45-50 dB. Gå till B-lägeskontrollerna i alternativet Fler kontroller och spara sedan ändringen i förinställningar för läge. Tryck på Förinställningar för läge för att välja den optimerade bildanskaffningsinställningen varje gång innan du börjar avbilda en ny serie.
- Ta så många bilder som önskas i det långa axelplanet genom att välja Spara bild.
OBS: Mer detaljerad information och utbildningsresurser om bildförvärv finns på https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab och https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Longitudinell vy Puls Wave
- Växla till FärgDoppler för blodflödesdetektering (välj Färgknapp) och förvärv (finns längst ner till vänster på pekskärmen efter att ha initierat en ny serie).
- Med hjälp av pekskärmen placerakvadranten ovanpå atrioventricular ventilen och lokalisera inflödet, som kommer att särskiljas av den röda färgsignalen(bild 3A). Minska kvadrantområdet så mycket som möjligt för att öka bildrutehastigheten.
OBS: Sänk färgpuls-repetition-frekvens (Färg PRF) (hastighetsområde) för att säkerställa gul färg kan ses i hastighetsprofilen för färgdoppler bilden. Detta kommer att öka utbudet av hastigheter som kan ses och kommer att bidra till att skapa en mosaik av färg som gör det möjligt att visualisera tydligare topphastigheter. - Aktivera pulsvåg (välj PW)Dopplerläge för att prova ventrikulärt blodflödehastighet. Placera provvolymens grind i mitten av atrioventricularventilen (där den röda färgsignalen blir mer gulaktig) för att upptäcka den maximala flödeshastigheten. Justera PW-vinkeln på skärmen med fingrarna så att den ligger i linje med blodflödets riktning. Tryck på start eller uppdatering för att börja provtagning hastigheten på blodet som strömmar in i ventrikeln.
OBS: Se till att vinkeln rätt linje är parallell med blodflödet för att ge konsekventa och reproducerbara resultat. Placera vinkeln rätt linje så att den matchar riktningen på blodflödet kommer att se till att hastigheter fångas exakt. - Upprepa steg 3.2.3 för att bestämma utflödeshastigheten genom att placera färgdopplerkvadranten vid korsningen mellan ventrikeln och bulbus (bulbuventricular ventil) och lokalisera flödet, som kommer att särskiljas genom en blå färgsignal (figur 3B). Placera provvolymens grind precis före ventrikel-bulbus-korsningen och justera vinkelkorrigeringslinjen så att den matchar blodflödets riktning.
OBS: Som tidigare nämnts, för att uppnå korrekta hastighetsvärden, se till att PW-vinkeln är i linje med blodflödet. - Justera baslinjen (stapeln), sänka eller höja den i flödeshastighetspanelen för att upptäcka och spåra signaltopparna helt (figur 3C,D). Identifiera inflödestopparna i den övre/positiva kvadranten (signal som går mot sonden) och utflödestopparna i den nedre/negativa kvadranten (signalen som går bort från sonden).
4. Fisk återhämtning
- Så snart bilden förvärvet är klar, med hjälp av en tesked, överföra fisken till vanligt system kolsyrat vatten fritt från tricaine och låt fisken återhämta sig (vanligtvis tar 30 s till 2 min för att återuppta gälrörelse och simning).
- För att hjälpa till att återhämta sig, spruta vatten upprepade gånger över gälarna med hjälp av en överföring pipett för att främja aeration av vatten och syreöverföring.
5. Bildanalys
- Öppna bildanalysprogrammet.
- Markera en bild och klicka på bildbehandlingsikonen (Bild 4). Med hjälp av den tillgängliga skalan (bild 4), justera ljusstyrka och kontrast av bilden för att möjliggöra tydlig visualisering av ventrikulära väggar eller blodflödet mönster.
- Öppna listrutan med b-läge från alternativet PSLAX (parasternal lång axel) på hjärtpaketet/måtten (figur 4). Välj LV-spår och spåra ventrikulära innerväggen vid systole och diastole för att erhålla ventrikulärt området (VA) i systole (VAs) och diastole (VAd), avsluta diastolisk volym (EDV) och avsluta systolisk volym (ESV)(figur 5A,B).
Volymvärden extrapoleras från 2D-bildspårningar och kan avvika från 3D-entiteten. För alla mätningar, i genomsnitt minst 3 representativa hjärtcykler per djur. - Observera linjevolymen och utmatningsfraktionen som beräknas och visas automatiskt av programvaran.
Linjevolym och utmatningsfraktion kan också beräknas manuellt med hjälp av formlerna
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
där SV är linjevolym är EDV slutet diastolisk volym, ESV är slutet systoliskt volym, och EF är utmatning fraktion - Beräkna ändring av bråkområde med formeln
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
där FAC är fraktionerad områdeförändring, vad är ventrikulärt område i diastole, och Virtuella datorer är Ventrikulärt område i systole. - Beräkna hjärtproduktionen med hjälp av formeln
CO = HR x SV
där CO är hjärtminutvolym är HR puls, och SV är strokevolym - Mät inflödets blodflödegenom att välja mv flow-alternativet under hjärtpaketet ( Bild4). Välj E eller A för tidig diastole och sen diastole, respektive, och bestämma topphastigheter på diagrammet (figur 3C).
- Mät utflödesblodflödets blodflöde genom att välja AoV Flow och bestämma topparna på spårningen (figur 3D).
- Mät pulsen med hjälp av 2 olika metoder för en mer tillförlitlig bedömning:
- När hjärtat visualiseras på skärmen under bildförvärv, räkna beats inom 10 s och multiplicera den med 6.
- Med hjälp av Pulse Wave Doppler-avbildningen på Vevo LAB-programvaran väljer du pulsknappen och spårintervallen mellan 3 på varandra följande aortaflödestoppar(figur 4 och figur 6).
- Om du vill exportera data till ett kalkylblad efter att ha spårat LV och toppar blodflödet, klicka på rapport | export | spara som | excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna protokollet möjliggör mätning av viktiga hjärtdimensionella och funktionella parametrar, analoga med den teknik som används i human- och djurekokardiografi. B-lägesbilderna möjliggör spårning av Ventrikulärt inre vägg i systole och diastole(figur 5)och erhålla dimensionsdata, såsom kammar- och väggdimensioner, och funktionella data, såsom puls, linjevolym och hjärtutgång samt parametrar för ventrikulärt systolisk funktion, såsom fraktionerad områdesförändring och utmatningsfraktion (tabell 1). Mätningar i nivå med atrioventricular ventil med hjälp av färg Doppler Mode bilder ger också Ventrikulärt inflöde och utflöde blodhastigheter (hastighet med vilken blodet fyller och lämnar ventrikeln, respektive)(figur 3 och tabell 1).
De parametrar som erhölls i denna studie var jämförbara med de parametrar som rapporterats i tidigare studier med liknande experimentella tillstånd6,,16,17 ( tabell1), vilket ytterligare visar metodens reproducerbarhet. Sammantaget visar vi att med hjälp av detta detaljerade protokoll kan man effektivt och konsekvent bedöma zebrafisk hjärtfunktion, vilket är avgörande när man jämför olika hjärt fenotyper under en studie.
Figur 1: Illustration av vuxna zebrafiskhjärta. Blodflödet cirkulationen representeras av pilar: blodet strömmar från sinus venosus till atriumet och överförs ytterligare till ventrikeln, där det pumpas till bulbus arteriosus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fisk-imaging kammare. (A)För att förbereda en "kammare för fiskavbildning" placeras en svamp med ett snitt mot ena änden i vertikal riktning i en glasbehållare. (B)Glasbehållaren tejpas sedan fast på den lutande bildplattformen. (C)Givaren är monterad på manipulatorn och placeras parallellt med snittet för korrekt bildåtergivningsplacering (givaren stommen pekar mot operatören). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Atrioventricular inflöde (A) och utflöde (B) i färgdopplerläge och motsvarande Pulsed Wave Doppler för att bedöma hastigheter för respektive ventrikulära diastoliska vågtoppar (C) och Ventrikulärt utflöde (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Bildanalys. Efter bildbehandling (för att uppnå önskad kontrast och ljusstyrka på bilden), kan mätningar utföras i PW Doppler läge (vänster) och B-läge (höger) bilder. Om du vill spåra LV-väggen i B-lägesbilden väljer du Hjärtpaket på rullgardinsmenyn, går till PSLAXoch väljer LV Trace. Om du vill mäta topphastigheter i bilden AV PW Doppler-läge väljer du Hjärtpaket på rullgardinsmenyn. Om du vill mäta ventrikulärt blodflödehastighet väljer du mv Flow-alternativet och väljer E eller A för tidig diastole respektive sen diastole. För bestämning av utflödesblodflödet sen, välj AoV Flow och AV-topphastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: B-lägesbilder. (A) B-läge bild av ventrikeln (V) i diastole, fylld med blod som kommer från atrium (A). (B) B-läge bild av ventrikeln i systole, mata ut blod genom bulbus arteriosus (B, grön spårning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Pulse Wave Doppler bild. Ett pulsvärde kan genereras genom att spåra 3 på varandra följande kolorektal flödestoppar. De aortaflödestopparna kan visas genom att välja pulsknappen i fliken mått i analysprogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametrar, enheter ± sd | Denna studie | Wang, L. et al, 2017; Lee, L. et al, 2016 & Mishra, S. et al, 2019 | Kommentarer/beskrivning |
| Puls (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | Wild-types AB/ABTU hanar och kvinnor mellan 3-12 månader stylsvis i tricaine 0,2 mg/ml |
| Ändring av bråkområde (FAC) | 0,38 ± 0,03 | 0,29 ± 0,07 - 0,39 ± 0,05 | |
| Utmatningsfraktion (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0,04 - 48 ± 0,03 | |
| Slagvolym (SV), μL | 0,21 ± 0,01 | 0,18 ± 0,06 - 0,28 ± 0,08 | |
| Hjärteffekt (CO), μL min-1 | 27.3 ± 1.69 | 19 ± 9,5 - 36,1 ± 7,8 | |
| E topphastighet (tidigt ventrikulärt inflöde), mm/s | 30 ± 6,8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| En topphastighet (sent ventrikulärt inflöde), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| Ventrikulärt utflöde, mm/s | 86,6 ± 19 | n/a |
Tabell 1: Echocardiographic parametrar i vuxna zebrafiskar. Värden som erhållits för hjärtfunktionsparametrarna som utvärderats i den aktuella studien för vuxna manliga eller kvinnliga zebrafiskar mellan 3 och 12 månader som styvits i en 0,2 mg/mL tricainlösning. Ett intervall av de värden som erhållits för samma parametrar i tidigare studier6,16,17 utförs under liknande förhållanden presenteras för validering och för att standardisera metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en systematisk metod för ekokardiografisk avbildning och bedömning av hjärtfunktion hos vuxna zebrafiskar. Ekokardiografi är den enda tillgängliga icke-invasiva och mest robusta metoden för levande vuxna fisk hjärt avbildning och funktionell analys, och det blir allt populärare i zebrafisk kardiovaskulär forskning. Den tid som behövs är kort och möjliggör höggenomströmning och longitudinella studier. Det finns dock stora skillnader i den metod som används och dataanalys. Standardisering av zebrafisk ekokardiografi är mycket svårt när så många variabler kan påverka de outcoming parametrarna. När man genomför experimentella studier bör man överväga villkor som kan ge variationer, inklusive anestesi, kroppsvikt, ålder, kön och bakgrundsstam. Wang, L et al.16 bedömde den variation som infördes av dessa faktorer och sammanställt tillgängliga data om zebrafisk hjärtfunktion för att hjälpa standardisera metoden. Deras studie är en mycket användbar resurs för att utforma experimentella studier med zebrafisk echocardiographic bedömning. Baserat på den information som Wang, L et al.16 och referenser inom och våra egna observationer6,ger vi en översikt över kritiska steg och villkor som vi ansåg vara viktiga för protokolloptimering och reproducerbarhet:
Val av exemplar: Tidigare studier tyder på att medan systoliskt funktionsparametrar (EF, FAC) inte påverkas nämnvärt av könsskillnader, kan diastolisk funktion (nämligen toppvåg E/A-förhållande) vara betydligt lägre hos kvinnor äldre än 6 månader. Det konstaterades också att ventrikulärt områden och volymer avsevärt ökar med fiskålder (3 månader och äldre) och är betydligt högre hos kvinnor på grund av deras högre kroppsvikt och storlek. Indexering diastoliska volymer till BODY-mass Index (BMI) och kroppsyta (BSA) kan bidra till att avskaffa skillnaderna mellan åldersmatchade kvinnor och män, och indexering till BSA och vikt kan bidra till att övervinna åldersrelaterade diastoliska volymskillnader16. Det fanns också rapporter om olika diastoliska funktioner mellan fisk med olika bakgrundsstammar16. Sammantaget, när man väljer experimentell design, är det lämpligt att använda ålder- och stammatchade kontroller och undvika att blanda olika kön. Använda män rekommenderas, eftersom bildkvaliteten var lägre hos gravida kvinnor.
Skanningsposition: I den här inställningen är två skanningspositioner möjliga: längsgående axel och kort axel. Vi fann att i kort axelläge var det mycket svårt att identifiera hjärtkamrarna. Därför använde vi endast längsgående axel och rekommenderar den senare för avgränsning av hjärtkamrarna i B-läge och härledning av Ventrikulärt storlek och funktion.
Anestesi: Adekvat sedering är avgörande för att undvika betydande bradykardi under mätning. Hjärtfrekvensen kommer att påverka hjärtfunktionell mätning och äventyra noggrannheten i studien. Tricaine är det vanligaste bedövningsmedlet och en dos på 0,2 mg/ml befanns ge tillräcklig sedering. Mättiden är dock kritisk eftersom hjärtfrekvensen börjar minska efter 3-4 min under sedering16. För att undvika att införa variationer är det viktigt att hålla mätningarna under 3 min.
Kritiska parametrar: Puls kan betraktas som en kritisk parameter när man strävar efter konsekvens och noggrannhet. Hjärtfrekvensen bör vara jämförbar mellan testade försöksgrupper och inom det värdeintervall som rapporteras för de tillstånd som används. Vi fann att ett intervall på 118 ± 14 till 162 ± 32 slagper kan representera normalvärdena för vild typ zebrafisk 3-12 månader gamla vuxna svämmar med 0.2mg/mL tricaine i mindre än 3 min.
Resultatnoggrannhet: För att säkerställa noggrannhetbör mätningar tas över minst 3 hjärtcykler. För att få mer exakta manuella bildspårningar bör analysen göras på ett förblindat sätt.
Förutom att välja de lämpligaste förhållandena är flera aspekter avgörande för att säkerställa korrekt mätning. Helst bör förhållandena hållas så nära det normala fiskfysiologiska tillståndet som möjligt. Utföra genomsökningen under vatten har fördelen av att hålla fisken i sin naturliga miljö och nära normala förhållanden för gasutbyte, vattensammansättning, hydrostatiskt tryck och temperatur. Dessa är tydliga fördelar jämfört med tidigare studier, där under skanningsfisken placeras i en våt svamp utsätts för rumsluft och ledningsförmåga möjliggörs av ultraljudgel istället för vatten9,10. Undervattensskanning möjliggör också återvinning av fisken efter ingreppet, förutsatt att tiden mellan anestesi och återhämtning hålls under 3 min och fisken återförs till återvinningsvatten omedelbart efter mätningen. För att säkerställa att proceduren utförs så snabbt och effektivt som möjligt är en avsevärd tid på utbildning tillrådlig innan experiment utförs.
Ekokardiografi är en mycket väletablerad metod för att utvärdera hjärtfunktion i klinisk praxis samt i murine (eller andra däggdjur) djurmodeller. Men till skillnad från murine eller human ekokardiografi, utför fisk ultraljud under vattnet tillåter inte anslutning av exemplaret till elektroderna. Därför är direkt mätning av hjärt- och andningsfrekvens inte möjlig. I så fall kan pulsen mätas genom att slå per minut i ett intervall på 10 eller 15 min eller genom att manuellt spåra 3 på varandra följande kolorektal flödestoppar(figur 6). Pulsen påverkar också bestämning av andra parametrar, såsom hjärtminutvolym, som måste beräknas manuellt när parametrar som strokevolym har erhållits genom Ventrikulärt inre väggspårning. En annan aspekt att tänka på är att fisk hjärta morfologi är helt annorlunda än däggdjur. I tvåkammarn zebrafisk hjärtat, Ventrikulärt fyllning bestäms mestadels av density kontraktion, och fisk vanligtvis presentera en mycket lägre tidigt till sent Ventrikulärt fyllning förhållandet jämfört med däggdjur18. Detta förklarar den olika profil som erhålls genom pulsvåg Doppler i A och E toppar mellan zebrafisk och friska däggdjur hjärtan.
Echokardiografi möjliggör en grundlig karakterisering av fisken sion profil och kvantifiering av flera funktionella parametrar. De värden som erhålls för utmatningsfraktion, fraktionerad områdesförändring, blodflödeoch utflödeshastigheter, hjärtfrekvens och hjärtminutvolym ligger i det intervall som rapporterats av tidigare studier (tabell 1),vilket belyser metodens reproducerbarhet. Sammantaget visar våra data att högfrekvent ultraljudekardiografi är en robust och reproducerbar metod för att mäta zebrafisk hjärt morfologi och funktion vid utvärdering av sjukdomsmodeller eller drogtester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Fred Roberts tekniska stöd och revidering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
