Summary
Descrevemos um protocolo para avaliar a morfologia cardíaca e a função em zebrafish adultos usando ecocardiografia de alta frequência. O método permite a visualização do coração e posterior quantificação de parâmetros funcionais, como freqüência cardíaca (HR), saída cardíaca (CO), mudança de área fracionada (FAC), fração de ejeção (EF), e velocidades de fluxo e fluxo sanguíneo.
Abstract
O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo muito popular em pesquisas cardiovasculares, incluindo doenças cardíacas humanas, em grande parte devido à sua transparência embrionária, trabilidade genética e amenidade a estudos rápidos e de alto nível. No entanto, a perda de transparência limita a análise da função cardíaca na fase adulta, o que complica a modelagem das condições cardíacas relacionadas à idade. Para superar tais limitações, a ecocardiografia de ultrassom de alta frequência em zebrafish está emergindo como uma opção viável. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar a função cardíaca em zebrafish adultos por ecocardiografia não invasiva usando ultrassom de alta frequência. O método permite a visualização e análise da dimensão cardíaca do zebrafish e a quantificação de parâmetros funcionais importantes, incluindo freqüência cardíaca, volume de derrame, saída cardíaca e fração de ejeção. Neste método, os peixes são anestesiados e mantidos debaixo d'água e podem ser recuperados após o procedimento. Embora o ultrassom de alta frequência seja uma tecnologia cara, a mesma plataforma de imagem pode ser usada para diferentes espécies (por exemplo, murina e zebrafish) adaptando diferentes transdutores. A ecocardiografia do zebrafish é um método robusto para fenotipagem cardíaca, útil na validação e caracterização de modelos de doenças, particularmente doenças de início tardio; telas de drogas; e estudos de lesão cardíaca, recuperação e capacidade regenerativa.
Introduction
O zebrafish (Danio rerio) é um modelo de vertebrados bem estabelecido para estudos de processos de desenvolvimento e doenças humanas1. Os zebrafish têm alta similaridade genética aos seres humanos (70%), trabilidade genética, alta fecundidade e transparência óptica durante o desenvolvimento embrionário, o que permite a análise visual direta de órgãos e tecidos, incluindo o coração. Apesar de ter apenas um átrio e um ventrículo, o coração de zebrafish (Figura 1) é fisiologicamente semelhante aos corações de quatro câmaras dos mamíferos. É importante ressaltar que a freqüência cardíaca do zebrafish, a morfologia eletrocardiograma e a forma potencial de ação se assemelham às dos seres humanos mais do que as espécies de murina2. Essas características tornaram o zebrafish um excelente modelo para a pesquisa cardiovascular e forneceram grandes insights sobre o desenvolvimento cardíaco3,4, regeneração5, e condições patológicas1,3,4, incluindo arteriosclerose, cardiomiopatias, arritmias, doenças cardíacas congênitas e cardiotoxicidade da cadeia de luz amilóide1,4,6. A avaliação da função cardíaca tem sido possível durante o estágio embrionário (1 dias após a fertilização) por meio da análise direta de vídeo utilizando microscopia de vídeo de alta velocidade7,8. No entanto, os zebrafish perdem sua transparência além do estágio embrionário, limitando avaliações funcionais de corações maduros normais e condições cardíacas de início tardio. Para superar essa limitação, a ecocardiografia tem sido empregada com sucesso como uma alternativa de imagem não invasiva de alta resolução, em tempo real e não invasiva para avaliar a função cardíaca do zebrafish adulto9,,10,,11,,12,,13,14,15.
Em zebrafish, o coração está localizado ventralmente na cavidade torácica imediatamente posterior às brânquias com o átrio localizado dorsal ao ventrículo. O átrio coleta sangue venoso do venoso sinusal e transfere-o para o ventrículo onde é ainda mais bombeado para o bulbo arterioso(Figura 1). Aqui, descrevemos um protocolo fisiológico, subaquático, para avaliar a função cardíaca em zebrafish adultos por ecocardiografia não invasiva usando uma sonda de ultrassom de matriz linear com uma freqüência central de 50 MHz para imagem de modo B em uma resolução de 30 μm. Uma vez que as ondas de ultrassom podem facilmente viajar através da água, manter a proximidade entre o peixe e a sonda de varredura debaixo d'água fornece superfície de contato suficiente para detecção cardíaca sem necessidade de gel de ultrassom e é no geral menos estressante para o peixe. Embora sistemas alternativos de ecocardiografia de zebrafish tenham sido relatados por vários autores9,12,13, aqui apresentamos a configuração geral e mais comumente utilizada que se aplica ao ultrassom de alta frequência em animais.
O método permite imagens de alta resolução do coração de zebrafish adulto, rastreamento de estruturas cardíacas e quantificação de velocidades de pico das medidas de fluxo sanguíneo Doppler. Mostramos quantificação in vivo confiável de parâmetros sistólicos e diastólicos importantes, como fração de ejeção (EF), mudança de área fracionada (FAC), fluxo de sangue ventricular e velocidades de saída, freqüência cardíaca (HR) e saída cardíaca (CO). Contribuímos para estabelecer uma gama confiável de parâmetros funcionais e dimensionais cardíacos adultos saudáveis e saudáveis para permitir uma avaliação mais precisa dos estados patológicos. No geral, fornecemos um método robusto para avaliar a função cardíaca em zebrafish, que tem se mostrado extremamente útil no estabelecimento e validação de doenças cardíacas zebrafishmodelos 6,16, lesão cardíaca e recuperação10,13, e regeneração11,12, e pode ser usado ainda para avaliar drogas potenciais.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo zebrafish foram aprovados pelo nosso Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e estão em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal do USDA.
1. Configuração experimental
-
Configuração da plataforma para aquisição de imagens
- Usando uma tesoura pequena ou um bisturi faça uma incisão em uma esponja na posição das 12 horas para segurar o peixe durante a varredura. Coloque a esponja em um recipiente de vidro(Figura 2A).
NOTA: A posição da incisão deve permitir espaço suficiente para mover o transdutor e também manter o peixe berrando a linha de água quando a plataforma estiver inclinada para digitalização (Figura 2). A incisão pode variar dependendo do tamanho do peixe; no entanto, para um tamanho e peso padrão, a incisão deve ser de aproximadamente 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (comprimento, largura e profundidade, respectivamente). O recipiente de vidro deve ter pelo menos 6 cm de profundidade para evitar vazamento de água durante a imagem do peixe. - Afixar a caixa de vidro contendo a esponja na plataforma de ultrassom, por exemplo, usando fita dupla face. Certifique-se de que a caixa de vidro está no centro da plataforma e firmemente presa(Figura 2B).
- Incline a plataforma para a frente cerca de 30° usando o botão no lado esquerdo do porta-plataforma(Figura 2B). Encha o quadrado de vidro com 200-250 mL de água do sistema de peixe contendo 0,2 mg/mL de metanosulfonato tricaine (MS222).
NOTA: O tricaine pode ser preparado como uma solução de estoque de 4 mg/mL em Tris 40 mM pH 7 e ainda diluído à concentração desejada na água do sistema de peixes; 0,2 mg/mL foi considerada a melhor concentração16. A solução de estoque tricaine de 4 mg/mL pode ser armazenada por um longo período de tempo a -20 °C ou a 4 °C por um mês. - Insira o transdutor dentro do suporte do micromanipulador na estação ferroviária de trabalho, girando o entalhe do transdutor em direção ao operador. Mantenha a matriz paralela ao solo com o lado de trabalho longitudinal em relação ao estágio (ver Figura 2B). Deixe espaço suficiente (10 cm em ambos os lados) para que o sistema transdutor-ferroviário agora conectado se mova ao longo dos eixos x e y.
- Faça login no software de controle e escolha Mouse (Pequeno) Vascular. Crie um novo estudo, bem como uma nova série para cada animal incluído no estudo. Encontre o novo botão de estudo localizado no lado inferior esquerdo da tela na página do navegador (a exibição começa no modo B).
- Usando uma tesoura pequena ou um bisturi faça uma incisão em uma esponja na posição das 12 horas para segurar o peixe durante a varredura. Coloque a esponja em um recipiente de vidro(Figura 2A).
2. Manipulação do Peixe
NOTA: Os zebrafish utilizados neste estudo eram adultos, machos de 11 meses de idade da cepa do tipo selvagem AB/Tuebingen (AB/TU). Os zebrafish foram mantidos em um sistema de aquário autônomo a 28 °C em um ciclo de luz constante definido como 14 h luz/10 h escuro. Os zebrafish eram alimentados duas vezes por dia com camarão de salmoura(Artemia nauplii)e flocos de alimentos secos.
- Usando uma rede de peixe, transfira o peixe para um pequeno tanque contendo água do sistema com tricaine de 0,2 mg/mL. Aguarde até que o peixe esteja totalmente anestesiado (sem movimento e sem resposta ao toque).
- Usando uma colher de chá de plástico, transfira suavemente e rapidamente o peixe para a caixa de vidro contendo a esponja para a incisão anteriormente feita com o lado ventral do peixe voltado para cima.
NOTA: Certifique-se de que a cabeça do peixe está posicionada em direção ao operador (mesma direção do entalhe do transdutor) e em um nível ligeiramente mais alto em comparação com o resto do corpo para obter uma melhor visualização cardíaca. - Abaixe suavemente o transdutor (mantendo sua posição original) usando a alça no sistema ferroviário, colocando-o longitudinalmente e perto do lado ventral do peixe com o entalhe do transdutor voltado para o operador. Deixe 2-3 mm (não mais de 1 cm) de saque do peixe. Ajuste a plataforma em relação ao transdutor usando o micromanipulador em todos os 3 eixos até que o coração do peixe seja visualizado e, em seguida, iniciar a aquisição de imagem. O ângulo do transdutor não deve ser alterado durante toda a aquisição da imagem (Figura 2C).
NOTA: Enquanto houver proximidade suficiente (até 1 cm), a água em cima do peixe fornecerá uma superfície de contato através da tensão da superfície líquida que permite a transmissão das ondas de ultrassom entre a sonda e o peixe. Portanto, não há necessidade de empurrar o transdutor contra o peixe. Tente completar esta etapa e termine a varredura em menos de 3 minutos para evitar a morte do peixe ou uma diminuição da freqüência cardíaca durante a aquisição de imagens. Se necessário, use um temporizador. O coração pode ser encontrado no lado superior da tela em direção ao lado esquerdo do olho, que pode ser facilmente visualizado se mover o eixo x todo o caminho para a direita. Se houver dificuldade contínua em encontrar o coração durante o Modo B, mude para o modo Doppler de cor, que permitirá rastrear o fluxo sanguíneo (vermelho indica sangue fluindo em direção ao operador) e localizar o coração.
3. Aquisição de imagens
NOTA: Consulte A Tabela de Materiais para sistema de imagem e software de análise de imagens.
- Modo B de exibição longitudinal
- Depois de localizar o coração, selecione ou fique no Modo B (encontrado no lado inferior esquerdo da tela sensível ao toque depois de ter iniciado uma nova série) e reduza o campo para ampliar e ter um olhar mais atento ao coração para facilitar o rastreamento durante a análise.
- Para ter uma visão mais próxima e clara do coração na aquisição de imagem do Modo B, reduza o campo com zoom. Use a tela sensível ao toque para estreitar manualmente o campo nos eixos x e y.
- Se necessário, melhore a qualidade/contraste da imagem definindo o intervalo dinâmico para 45-50 dB. Vá para os controles do modo B na opção Mais Controles e, posteriormente, salve a alteração em Predefinições de Modo. Toque em Predefinições de modo para selecionar a configuração de aquisição de imagem otimizada todas as vezes antes de começar a visualizar uma nova série.
- Tire quantas imagens desejarem no plano de eixo longo selecionando Salvar imagem.
NOTA: Informações mais detalhadas e recursos de treinamento sobre aquisição de imagens podem ser encontrados em https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab e https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Onda de pulso de visão longitudinal
- Mude para Color Doppler para detecção de fluxo sanguíneo (selecione botão Cor) e aquisição (encontrado no lado inferior esquerdo da tela sensível ao toque depois de ter iniciado uma nova série).
- Usando a tela de toque posicione o quadrante na parte superior da válvula atrioventricular e localize a entrada, que será distinguida pelo sinal de cor vermelha(Figura 3A). Reduza a área do quadrante o máximo possível para aumentar a taxa de quadros.
NOTA: Reduza a freqüência de repetição de pulso de cor (Color PRF) (faixa de velocidade) para garantir que a cor amarela possa ser vista no perfil de velocidade da imagem Color Doppler. Isso aumentará a gama de velocidades que podem ser vistas e ajudará a criar um mosaico de cores que permitirá visualizar mais claramente as velocidades de pico. - Ativar o modo doppler de onda de pulso (selecione PW) para amostrar a velocidade de entrada de sangue ventricular. Posicione o portão de volume da amostra no centro da válvula atrioventricular (onde o sinal de cor vermelha se torna mais amarelado) para detectar a velocidade máxima de fluxo. Ajuste o ângulo PW na tela usando os dedos para que ele se alinhe com a direção da entrada de sangue. Pressione iniciar ou atualizar para começar a amostragem da velocidade do sangue que flui para o ventrículo.
NOTA: Certifique-se de que a linha correta do ângulo é paralela ao fluxo sanguíneo, a fim de fornecer resultados consistentes e reprodutíveis. Colocar a linha correta do ângulo para que corresponda à direção do fluxo sanguíneo garantirá que as velocidades sejam capturadas com precisão. - Repita a etapa 3.2.3 para determinar a velocidade de saída colocando o quadrante Color Doppler na junção entre o ventrículo e o bulbo (válvula bulbuventricular) e localize o fluxo, que será distinguido por um sinal de cor azul(Figura 3B). Posicione o portão de volume da amostra antes da junção ventrículo-bulbus e ajuste a linha de correção do ângulo para corresponder à direção do fluxo sanguíneo.
NOTA: Como mencionado anteriormente, para obter valores de velocidade precisos, certifique-se de que o ângulo PW esteja alinhado com o fluxo sanguíneo. - Ajuste a linha de base (barra), baixando-a ou elevando-a no painel de velocidade de fluxo, a fim de detectar e rastrear completamente os picos de sinal(Figura 3C,D). Identifique os picos de entrada no quadrante superior/positivo (sinal indo em direção à sonda) e os picos de fluxo no quadrante inferior/negativo (sinal que se afasta da sonda).
4. Recuperação de peixes
- Assim que a aquisição da imagem estiver completa, usando uma colher de chá, transfira o peixe para o sistema regular aterrou água aerada livre de tricaine e deixe o peixe recuperar (geralmente leva de 30 s a 2 min para retomar o movimento da brânquia e natação).
- Para ajudar na recuperação, esguiche água repetidamente sobre as brânquias usando uma pipeta de transferência para promover a aeração da transferência de água e oxigênio.
5. Análise de imagens
- Abra o software de análise de imagens.
- Selecione uma imagem e clique no ícone de processamento de imagem(Figura 4). Utilizando a escala disponível(Figura 4),ajuste o brilho e o contraste da imagem para permitir uma visualização clara das paredes ventriculares ou do padrão de fluxo sanguíneo.
- Usando a imagem do modo B, abra a lista de parada da opção PSLAX (eixo longo parasternal) no pacote cardíaco/medidas(Figura 4). Selecione o traço de LV e trace a parede interna ventricular em sístole e diastole para obter a área ventricular (VA) em sístole (VAs) e diastole (VAd), volume diastólico final (EDV) e volume sistólica final (ESV) ( Figura5A,B).
NOTA: Os valores de volume são extrapolados a partir de rastreamentos de imagens 2D e podem desviar-se da entidade 3D. Para todas as medições, média de pelo menos 3 ciclos cardíacos representativos por animal. - Observe o volume de traçado e a fração de ejeção que serão automaticamente calculados e exibidos pelo software.
NOTA: Volume de traçado e fração de ejeção também podem ser calculados manualmente usando as fórmulas
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
onde SV é volume de traçado, EDV é volume diastólico final, ESV é volume sistólica final, e EF é fração de ejeção - Calcular mudança de área fracionada usando a fórmula
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
onde FAC é mudança de área fracionada, VAd é área ventricular em diastole, e VAs é área ventricular em sístole. - Calcule a saída cardíaca usando a fórmula
CO = HR x SV
onde CO é saída cardíaca, HR é freqüência cardíaca, e SV é volume de derrame - Usando a imagem do modo doppler de onda pulsada, meça a velocidade sanguínea de entrada selecionando a opção Fluxo MV o pacote cardíaco(Figura 4). Selecione E ou A para diastole precoce e diastole tardia, respectivamente, e determine as velocidades de pico no gráfico(Figura 3C).
- Meça a velocidade sanguínea de saída selecionando Fluxo AoV e determine os picos no traçado(Figura 3D).
- Meça a freqüência cardíaca usando 2 metodologias diferentes para uma avaliação mais confiável:
- Quando o coração é visualizado na tela durante a aquisição da imagem, conte as batidas dentro de 10 s e multiplique-o por 6.
- Usando a imagem Pulse Wave Doppler no software Vevo LAB, escolha o botão de freqüência cardíaca e os intervalos de rastreamento entre 3 picos de fluxo aórtico consecutivos(Figura 4 e Figura 6).
- Para exportar dados para uma planilha depois de ter rastreado o LV e os picos do fluxo sanguíneo, clique no relatório | exportação | save as | excel.
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Representative Results
O protocolo descrito permite a medição de importantes parâmetros cardíacos dimensionais e funcionais, análogos à técnica utilizada na ecocardiografia humana e animal. As imagens do Modo B permitem o rastreamento da parede interna ventricular em sístole e diastole(Figura 5) e a obtenção de dados dimensionais, como dimensões de câmara e parede, e dados funcionais, como freqüência cardíaca, volume de derrame e saída cardíaca, bem como parâmetros de função sistólica ventricular, como mudança de área fracionada e fração de ejeção(Tabela 1). As medições ao nível da válvula atrioventricular utilizando imagens do Modo Doppler de cor também fornecem velocidades sanguíneas de entrada ventricular e de fluxo de saída (velocidade na qual o sangue preenche e sai do ventrículo, respectivamente) (Figura 3 e Tabela 1).
Os parâmetros obtidos neste estudo foram comparáveis aos relatados em estudos anteriores utilizando condições experimentais semelhantes6,16,17 (Tabela 1),demonstrando ainda a reprodutibilidade do método. No geral, mostramos que usando este protocolo detalhado pode-se avaliar de forma eficaz e consistente a função cardíaca do zebrafish, que é fundamental ao comparar diferentes fenótipos cardíacos durante um estudo.
Figura 1: Ilustração do coração de zebrafish adulto. A circulação do fluxo sanguíneo é representada por flechas: o sangue flui do seio venoso para o átrio e é posteriormente transferido para o ventrículo, onde é bombeado para o bulbo arterioso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Câmara de imagem de peixe. (A)Para preparar uma "câmara" de imagem de peixe, uma esponja com uma incisão em direção a uma extremidade em uma orientação vertical é colocada em um recipiente de vidro. (B) O recipiente de vidro é então firmemente colado na plataforma de imagem inclinada. (C) O transdutor é montado sobre o manipulador e colocado paralelamente à incisão para o posicionamento correto da imagem (o entalhe transdutor está apontando para o operador). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Entrada atrioventricular (A) e saída (B) no modo Color Doppler e correspondente Doppler de Onda Pulsada para avaliar as velocidades dos respectivos picos de onda diáslica ventricular (C) e fluxo ventricular (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de imagem. Após o processamento da imagem (para alcançar o contraste e o brilho desejados da imagem), as medições podem ser realizadas nas imagens do modo PW Doppler (esquerda) e B-mode (direita). Para rastrear a parede LV na imagem do modo B, selecione Pacote Cardíaco no menu suspenso, vá para PSLAXe selecione LV Trace. Para medir as velocidades de pico na imagem do modo PW Doppler, selecione Pacote Cardíaco no menu suspenso. Para medir a velocidade de entrada de sangue ventricular, selecione a opção Fluxo MV e selecione E ou A para diastole precoce e diastole tardia, respectivamente. Para determinar a velocidade sanguínea de saída, selecione Fluxo AoV e velocidade de pico AV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens em modo B. ( A) Imagem do ventrículo B (V) em diastole, cheia de sangue proveniente do átrio (A). (B) Imagem do modo B do ventrículo em sístole, ejetando sangue através do bulbo arterioso (B, rastreamento verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem do Doppler de ondas de pulso. Um valor de freqüência cardíaca pode ser gerado rastreando 3 picos de fluxo aórtico consecutivos. Os picos de fluxo aórtico podem ser exibidos selecionando o botão de freqüência cardíaca na guia de medidas no software de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros, unidades ± sd | Este estudo | Wang, L. et al, 2017; Lee, L. et al, 2016 & Mishra, S. et al, 2019 | Comentários/Descrição |
| Freqüência cardíaca (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | Machos e fêmeas de tipos selvagens AB/ABTU entre 3-12 meses anestesiados em tricaine 0,2 mg/mL |
| Mudança de área fracionada (FAC) | 0,38 ± 0,03 | 0,29 ± 0,07 - 0,39 ± 0,05 | |
| Fração de ejeção (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0,04 - 48 ± 0,03 | |
| Volume de traçado (SV), μL | 0,21 ± 0,01 | 0,18 ± 0,06 - 0,28 ± 0,08 | |
| Saída cardíaca (CO), μL min-1 | 27,3 ± 1,69 | 19 ± 9,5 - 36,1 ± 7,8 | |
| E velocidade de pico (entrada ventricular precoce), mm/s | 30 ± 6,8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| Uma velocidade máxima (entrada ventricular tardia), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| Fluxo ventricular, mm/s | 86,6 ± 19 | n/a |
Tabela 1: Parâmetros ecocardiográficos em zebrafish adultos. Valores obtidos para os parâmetros de função cardíaca avaliados no presente estudo para zebrafish masculino ou feminino adulto entre 3 e 12 meses anestesiados em uma solução tricaine de 0,2 mg/mL. Uma faixa dos valores obtidos para os mesmos parâmetros em estudos anteriores6,16,17 realizados em condições semelhantes é apresentada para validação e para ajudar a padronizar o método.
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Discussion
Descrevemos um método sistemático para a imagem ecocardiográfica e avaliação da função cardíaca em zebrafish adultos. A ecocardiografia é o único método não invasivo e mais robusto disponível para imagem cardíaca de peixe adulto vivo e análise funcional, e está se tornando cada vez mais popular na pesquisa cardiovascular de zebrafish. O tempo necessário é curto e permite estudos longitudinais de alta duração e de alta duração. No entanto, há uma variação considerável na metodologia empregada e na análise dos dados. A padronização da ecocardiografia de zebrafish é muito difícil quando tantas variáveis podem influenciar os parâmetros de saída. Ao realizar estudos experimentais, deve-se considerar condições que podem produzir variabilidade, incluindo anestesia, peso corporal, idade, sexo e tensão de fundo. Wang, L et al.16 avaliaram a variabilidade introduzida por esses fatores e compilaram os dados disponíveis sobre a função cardíaca do zebrafish, a fim de ajudar a padronizar o método. Seu estudo é um recurso muito útil para projetar estudos experimentais envolvendo avaliação ecocardiográfica de zebrafish. Com base nas informações fornecidas por Wang, L et al.16 e referências dentro e em nossas próprias observações6,fornecemos um esboço de etapas e condições críticas que consideramos importantes para otimização e reprodutibilidade de protocolos:
Escolha da amostra: Estudos anteriores sugerem que, enquanto os parâmetros de função sistólica (EF, FAC) não são significativamente afetados por diferenças sexuais, a função diastólica (ou seja, a razão e/A do pico) pode ser consideravelmente menor em fêmeas com mais de 6 meses. Observou-se também que as áreas ventriculares e os volumes aumentam significativamente com a idade do peixe (3 meses ou mais) e são consideravelmente maiores em fêmeas devido ao seu maior peso corporal e tamanho. A indexação dos volumes diastólicos para o índice de massa corporal (IMC) e a área da superfície corporal (BSA) pode ajudar a abolir as diferenças entre mulheres e homens compatíveis com a idade, e a indexação à BSA e ao peso podem ajudar a superar as diferenças de volume diastólicas relacionadas à idade16. Houve também relatos de diferentes funções diastólicas entre peixes com diferentes cepas de fundo16. No geral, ao escolher o design experimental, é aconselhável usar controles de idade e tensão e evitar misturar diferentes sexos. Recomenda-se o uso de machos, pois a qualidade da imagem foi menor em fêmeas gravídicas.
Posição de digitalização: Nesta configuração são possíveis duas posições de varredura: eixo longitudinal e eixo curto. Descobrimos que no modo de eixo curto era muito difícil identificar as câmaras cardíacas. Por isso, utilizou-se apenas o eixo longitudinal e recomendamos este último para delineamento das câmaras cardíacas no modo B e derivação do tamanho e função ventricular.
Anestesia: A sedação adequada é fundamental para evitar bradicardia significativa durante a medição. A freqüência cardíaca afetará a medição funcional cardíaca, comprometendo a precisão do estudo. Tricaine é o agente anestésico mais comum e uma dose de 0,2 mg/mL foi encontrada para fornecer sedação adequada. No entanto, o tempo de medição é crítico, uma vez que a freqüência cardíaca começa a diminuir após 3-4 min sedação16. Para evitar a introdução de variabilidade, é fundamental manter as medições abaixo de 3 min.
Parâmetros críticos: A freqüência cardíaca pode ser considerada como um parâmetro crítico ao apontar consistência e precisão. A freqüência cardíaca deve ser comparável entre os grupos experimentais testados e dentro da faixa de valores relatados para as condições utilizadas. Verificou-se que uma faixa de 118 ± 14 a 162 ± 32 bpm pode representar os valores normais para zebrafish tipo selvagem 3-12 meses de idade anestesiados com 0,2mg/mL de tricaine por menos de 3 min.
Precisão do resultado: Para garantir a precisão, as medidas devem ser tomadas ao longo de um mínimo de 3 ciclos cardíacos. Para obter rastreamentos manuais de imagens mais precisos, a análise deve ser feita de forma cega.
Além de escolher as condições mais adequadas, vários aspectos são fundamentais para garantir uma medição precisa. Idealmente, as condições devem ser mantidas o mais próximo possível do estado fisiológico normal do peixe. A realização da varredura a água tem a vantagem de manter o peixe em seu ambiente natural e perto das condições normais para troca de gás, composição da água, pressão hidrostática e temperatura. Estas são claras vantagens em relação aos estudos anteriores, onde durante a varredura os peixes são colocados em uma esponja úmida exposta ao ar ambiente e a condutividade é habilitada por gel de ultrassom em vez de água9,10. A varredura subaquática também permite a recuperação do peixe após o procedimento, desde que o tempo entre anestesia e recuperação seja mantido abaixo de 3 min e o peixe seja devolvido à água de recuperação imediatamente após a medição. Para garantir que o procedimento seja realizado o mais rápido e eficazmente possível, é aconselhável um tempo considerável gasto no treinamento antes de realizar experimentos.
A ecocardiografia é um método muito bem estabelecido para avaliar a função cardíaca na prática clínica, bem como em modelos animais de murina (ou outros mamíferos). No entanto, ao contrário da murina ou da ecocardiografia humana, a realização de ultrassom de peixe sumido debaixo d'água não permite a conexão do espécime aos eletrodos. Portanto, a medição direta das taxas cardíacas e respiratórias não é possível. Nesse caso, a freqüência cardíaca pode ser medida contando as batidas por minuto em um intervalo de 10 ou 15 minutos ou traçando manualmente 3 picos de fluxo aórtico consecutivos(Figura 6). A freqüência cardíaca também afeta a determinação de outros parâmetros, como a saída cardíaca, que devem ser calculados manualmente uma vez que parâmetros como o volume de derrame tenham sido obtidos através do rastreamento da parede interna ventricular. Outro aspecto a considerar é que a morfologia do coração dos peixes é bem diferente dos mamíferos. No coração de zebrafish de duas câmaras, o enchimento ventricular é determinado principalmente por contração atrial, e os peixes normalmente apresentam uma proporção de enchimento ventricular muito menor no início ao final quando comparado com os mamíferos18. Isso explica o perfil diferente obtido pela onda de pulso Doppler em picos De e A entre zebrafish e corações de mamíferos saudáveis.
A ecocardiografia permite uma caracterização completa do perfil cardíaco do peixe e quantificação de múltiplos parâmetros funcionais. Os valores obtidos para fração de ejeção, alteração de área fracionada, fluxo sanguíneo e velocidades de saída, frequência cardíaca e saída cardíaca estão na faixa relatada por estudos anteriores(Tabela 1),destacando a reprodutibilidade do método. Juntos, nossos dados mostram que a ecocardiografia de ultrassom de alta frequência é um método robusto e reprodutível para medir a morfologia e a função cardíaca de zebrafish ao avaliar modelos de doenças ou testes medicamentosos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio técnico de Fred Roberts e a revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
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