Summary
Vi beskriver en protokol til vurdering af hjertemorfologi og funktion hos voksne zebrafisk ved hjælp af højfrekvent ekkokardiografi. Metoden gør det muligt at visualiseringe hjertet og efterfølgende kvantificering af funktionelle parametre, såsom puls (HR), hjerteoutput (CO), fraktioneret områdeændring (FAC), udslyngningsfraktion (EF) og blodindstrømnings- og udstrømningshastigheder.
Abstract
Zebrafisken (Danio rerio) er blevet en meget populær model organisme i hjerte-kar-forskning, herunder menneskelige hjertesygdomme, hovedsagelig på grund af sin embryonale gennemsigtighed, genetiske tractability, og faciliteter til hurtige, høj-throughput undersøgelser. Men tabet af gennemsigtighed begrænser hjertefunktionsanalyse på voksenstadiet, hvilket komplicerer modelleringen af aldersrelaterede hjertesygdomme. For at overvinde sådanne begrænsninger, højfrekvente ultralyd ekkokardiografi i zebrafisk er ved at opstå som en farbar vej. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til vurdering af hjertefunktion hos voksne zebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjælp af højfrekvent ultralyd. Metoden giver mulighed for visualisering og analyse af zebrafisk hjertedimension og kvantificering af vigtige funktionelle parametre, herunder puls, slagtilfælde volumen, hjerte-output, og udslyngning fraktion. Ved denne metode, fiskene er bestøvet og holdes under vandet og kan inddrives efter proceduren. Selvom højfrekvent ultralyd er en dyr teknologi, kan den samme billeddannelsesplatform bruges til forskellige arter (f.eks. murine og zebrafisk) ved at tilpasse forskellige transducers. Zebrafisk ekkokardiografi er en robust metode til hjertefænotypebestemmelse, nyttig i validering og karakterisering af sygdomsmodeller, især sene debut sygdomme; narkotika skærme; undersøgelser af hjerteskade, restitution og regenerativ kapacitet.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) er en veletableret hvirveldyrmodel for undersøgelser af udviklingsprocesser og sygdomme hos mennesker1. Zebrafisk har høj genetisk lighed med mennesker (70%), genetisk tractability, høj frugtbarhed, og optisk gennemsigtighed under embryonale udvikling, som giver mulighed for direkte visuel analyse af organer og væv, herunder hjertet. På trods af kun at have et atrium og en ventrikel, zebrafisk hjerte (Figur 1) er fysiologisk ligner pattedyr fire-chambered hjerter. Vigtigere er det, zebrafisk puls, elektrokardiogram morfologi, og handling potentielle form ligner dem af mennesker mere end murine arter2. Disse funktioner har gjort zebrafisk en fremragende model for hjerte-kar-forskning og har givet stor indsigt i hjerteudvikling3,4, regenerering5, og patologiske betingelser1,,3,,4, herunder åreforkalkning, kardiomyopatier, arytmier, medfødte hjertesygdomme, og amyloid lyskæde kardiotoksicitet1,4,6. Vurdering af hjertefunktion har været mulig i fosterstadiet (1 dage efter befrugtning) gennem direkte videoanalyse ved hjælp af højhastighedsvideomikroskopi7,8. Zebrafisk mister dog deres gennemsigtighed ud over fosterstadiet, hvilket begrænser funktionelle evalueringer af normale modne hjerter og sene hjertesygdomme. For at overvinde denne begrænsning er ekkokardiografi med succes blevet anvendt som et a-løsningsalternativ i realtid , noninvasive imaging til vurdering af voksne zebrafiskhjertefunktion9,10,11,12,13,14,15.
I zebrafisk, er hjertet placeret ventrally i brysthulen umiddelbart efter gællerne med atrium placeret dorsal til hjertetrikel. Atriet indsamler venøs blod fra sinus venosus og overfører det til hjertekammer, hvor det er yderligere pumpes til bulbus arteriosus (Figur 1). Her beskriver vi en fysiologisk, undersøisk protokol til vurdering af hjertefunktion hos voksne zebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjælp af en lineær array ultralydssonde med en centerfrekvens på 50 MHz for B-tilstandsbilleddannelse ved en opløsning på 30 μm. Da ultralydbølger nemt kan rejse gennem vand, giver det at holde nærhed mellem fisken og scanningsonden under vandet nok kontaktflade til hjertedetektering uden behov for ultralydsgel og er generelt mindre stressende for fisken. Selv om alternative zebrafisk ekkokardiografi systemer blev rapporteret af flere forfattere9,12,13, her præsenterer vi den generelle og mest almindeligt anvendte setup, der gælder for højfrekvente ultralyd hos dyr.
Metoden giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af den voksne zebrafisk hjerte, sporing af hjertestrukturer, og kvantificering af peak-hastigheder fra Doppler blodgennemstrømning målinger. Vi viser pålidelig in vivo-kvantificering af vigtige systoliske og diastoliske parametre, såsom udslyngningsfraktion (EF), fraktioneret områdeændring (FAC), ventrikulær blodindstrømning og udstrømningshastigheder, puls (HR) og hjerteoutput (CO). Vi bidrager til at etablere et pålideligt udvalg af normale raske voksne zebrafisk hjertefunktionelle og dimensionelle parametre for at muliggøre en mere præcis evaluering af patologiske tilstande. Samlet set tilbyder vi en robust metode til at vurdere hjertefunktion hos zebrafisk, som har vist sig yderst nyttig til at etablere og validere zebrafisk hjertesygdom modeller6,16, hjerteskade og nyttiggørelse10,13, og regenerering11,12, og kan yderligere bruges til at vurdere potentielle lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer zebrafisk blev godkendt af vores institutionelle Animal Care and Use Udvalg og er i overensstemmelse med USDA Animal Welfare Act.
1. Eksperimentel opsætning
-
Opsætning af platformen til billedanskaffelse
- Ved hjælp af små saks eller en skalpel gøre et snit på en svamp på 12:00 position til at holde fiskunder scanning. Svampen anbringes i en glasbeholder (figur 2A).
BEMÆRK: Snittets position skal give tilstrækkelig plads til at bevæge transduceren og også holde fiskebælgen vandledningen, når platformen vippes til scanning (figur 2). Snittet kan variere afhængigt af størrelsen af fisken; For en standardstørrelse og -vægt skal snittet dog være ca. 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (henholdsvis længde, bredde og dybde). Glasbeholderen skal være mindst 6 cm dyb for at undgå vandlækage under billeddannelse af fisken. - Anbring glaskassen, der indeholder svampen på ultralydsplatformen, for eksempel ved hjælp af dobbeltklæbende tape. Sørg for, at glaskassen er midt på perronen og sidder godt fast (figur 2B).
- Vip platformen ca. 30° med knappen i venstre side af platformsholderen (figur 2B). Glaspladsen fyldes med 200-250 ml fiskesystemvand indeholdende 0,2 mg/ml tricainmetanulfonat (MS222).
BEMÆRK: Tricaine kan fremstilles som en 4 mg/ml bestandopløsning i Tris 40 mM pH 7 og yderligere fortyndet til den ønskede koncentration i fiskesystemets vand; 0,2 mg/ml blev anset for at være den bedste koncentration16. Opløsningen på 4 mg/ml tricaine kan opbevares i længere tid ved -20 °C eller ved 4 °C i en måned. - Sæt transduceren i mikromanipulatorholderen på arbejdsbanegården, og drej transducerens hak mod operatøren. Hold arrayet parallelt med jorden med arbejdssiden i længderetningen med hensyn til scenen (se figur 2B). Lad nok plads (10 cm på begge sider) til, at det nu tilsluttede transducer-skinnesystem kan bevæge sig langs x- og y-akserne.
- Log på kontrolsoftwaren, og vælg Mouse (Small) Vascular. Opret en ny undersøgelse samt en ny serie for hvert dyr, der indgår i undersøgelsen. Find den nye studieknap i nederste venstre side af skærmen på browsersiden (visningen starter i B-tilstand).
- Ved hjælp af små saks eller en skalpel gøre et snit på en svamp på 12:00 position til at holde fiskunder scanning. Svampen anbringes i en glasbeholder (figur 2A).
2. Håndtering af fisk
BEMÆRK: Zebrafisk, der blev anvendt i denne undersøgelse, var voksne, 11 måneder gamle hanner af vildtypestammen AB/Tuebingen (AB/TU). Zebrafisk blev opretholdt i en stand-alone flow-through akvarium system ved 28 °C i en konstant lys cyklus indstillet som 14 h lys / 10 h mørk. Zebrafisk blev fodret to gange dagligt med saltlage rejer(Artemia nauplii)og tørfoder flager.
- Ved hjælp af et fiskenet overføres fisken til en lille tank, der indeholder systemvand med 0,2 mg/ml tricain. Vent, indtil fisken er helt bestøvet (ingen bevægelse og ingen reaktion på berøring).
- Ved hjælp af en plastik teskefuld, forsigtigt og hurtigt overføre fisk en ind i glaskassen, der indeholder svampen i den tidligere fremstillede snit med ventrale side af fisken vender opad.
BEMÆRK: Sørg for, at hovedet af fisken er placeret mod operatøren (samme retning som spidsen af transduceren) og på et lidt højere niveau i forhold til resten af kroppen for at opnå bedre hjertevisualisering. - Sænk forsigtigt transduceren (hold sin oprindelige position) ved hjælp af håndtaget på skinnesystemet, og placer den langs og tæt på fiskenes ventrale side med transducerens hak mod operatøren. Der er frirum for fisken 2-3 mm (højst 1 cm). Juster platformen i forhold til transduceren ved hjælp af mikromanipulatoren i alle 3 akser, indtil fiskehjertet visualiseres, og start derefter billederhvervelsen. Transducerens vinkel bør ikke ændres under hele billedanskaffelsen (figur 2C).
BEMÆRK: Så længe der er tilstrækkelig nærhed (op til 1 cm), vil vandet på toppen af fisken give en kontaktflade via væskeoverfladespænding, der tillader overførsel af ultralydbølgerne mellem sonden og fisken. Derfor er der ingen grund til at skubbe transduceren mod fisken. Prøv at fuldføre dette trin og afslutte scanningen på mindre end 3 minutter for at forhindre fisk død eller et fald i pulsen under billederhvervelse. Brug en timer, hvis det er nødvendigt. Hjertet kan findes på den øverste side af skærmen mod venstre side af øjet, som let kan visualiseres, hvis du flytter x-aksen hele vejen til højre. Hvis der er fortsat problemer med at finde hjertet, mens i B-mode, skifte til farve Doppler mode, som vil give mulighed for sporing blodgennemstrømning (rød angiver blod flyder mod operatøren) og lokalisere hjertet.
3. Erhvervelse af billeder
BEMÆRK: Se Materialetabel til billedbehandlingssystem og billedanalysesoftware.
- B-tilstand i længderetningen
- Når du har lokaliseret hjertet, skal du vælge eller blive i B-tilstand (findes nederst til venstre på berøringsskærmen efter at have startet en ny serie) og reducere feltet for at zoome ind og se nærmere på hjertet for lettere at spore under analysen.
- For at få et tættere og klarere billede af hjertet i B-Mode billedanskaffelse, skal du reducere feltet ved at zoome ind. Brug berøringsskærmen til manuelt at indsnævre feltet på både x- og y-akserne.
- Hvis det er nødvendigt, skal du forbedre billedets kvalitet/kontrast ved at indstille dynamisk område til 45-50 dB. Gå til kontrolelementerne i B-tilstand i indstillingen Flere kontrolelementer, og gem derefter ændringen til Tilstandsforudindstillinger. Tryk på Tilstandsforudindstillinger for at vælge den optimerede indstilling for billedanskaffelse hver gang, før du begynder at afbilde en ny serie.
- Tag så mange billeder som ønsket i det lange akseplan ved at vælge Gem billede.
BEMÆRK: Mere detaljerede oplysninger og uddannelse ressourcer på image acquisition kan findes på https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab og https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Langsgående View Pulse Wave
- Skift til Color Doppler for blodgennemstrømning afsløring (vælg Farve knap) og erhvervelse (findes i nederste venstre side af touchscreen efter at have indledt en ny serie).
- Ved hjælp af berøringsskærmen placeres kvadranten oven på atrioventrikulære ventil, og indstrøms, som vil blive kendetegnet ved det røde farvesignal (Figur 3A). Reducer kvadrantområdet så meget som muligt for at øge billedhastigheden.
BEMÆRK: Sænk farvepuls-gentagelsesfrekvensen (Color PRF) (hastighedsområde) for at sikre, at gul farve kan ses i hastighedsprofilen for Color Doppler-billedet. Dette vil øge rækken af hastigheder, der kan ses og vil bidrage til at skabe en mosaik af farve, der vil gøre det muligt at visualisere mere klart peak hastigheder. - Aktiver pulsbølge (vælg PW) Doppler Mode for at prøve ventrikulær blodindløbshastighed. Placer prøvevolumenporten i midten af atrioventrikulær ventilen (hvor det røde farvesignal bliver mere gulligt) for at detektere den maksimale strømningshastighed. Juster PW-vinklen på skærmen ved hjælp af fingrene, så den flugter med retningen af blodtilstrømningen. Tryk på start eller opdatering for at begynde prøveudtagning hastigheden af blod, der strømmer ind i ventrikel.
BEMÆRK: Sørg for, at vinklen korrekt linje er parallel med blodgennemstrømningen for at give ensartede og reproducerbare resultater. Placering af vinkel korrekte linje, så det matcher retningen af blodgennemstrømningen vil sikre, at hastigheder er nøjagtigt fanget. - Gentag trin 3.2.3 for at bestemme udstrømningshastigheden ved at placere Color Doppler kvadranten i krydset mellem ventrikel og bulbus (bulbuventricular valve) og lokalisere strømmen, som vil blive kendetegnet ved en blå farve signal (Figur 3B). Placer prøvevolumenporten lige før ventrikel-pærens kryds, og juster vinklenkorrektionslinjen, så den passer til blodgennemstrømningens retning.
BEMÆRK: Som nævnt før skal du sikre, at PW-vinklen er på linje med blodgennemstrømningen, for at opnå nøjagtige hastighedsværdier. - Juster grundlinjen (bjælken), sænke eller hæve den i flowhastighedspanelet for at registrere og spore signalspidserne helt (figur 3C,D). Identificer tilstrømningsspidserne i den øvre/positive kvadrant (signal, der går mod sonden) og udstrømningsspidserne i den nedre/negative kvadrant (signal, der går væk fra sonden).
4. Genopretning af fisk
- Så snart billedet erhvervelse er færdig, ved hjælp af en teskefuld, overføre fisk en regelmæssig system luftet vand fri for tricaine og lad fiskene komme sig (normalt tager 30 s til 2 min at genoptage gælle bevægelse og svømning).
- For at hjælpe opsving, sprøjte vand gentagne gange over gællerne ved hjælp af en overførsel pipette til at fremme bestigning af vand og ilt overførsel.
5. Billedanalyse
- Åbn billedanalysesoftwaren.
- Vælg et billede, og klik på billedbehandlingsikonet (Figur 4). Brug den tilgængelige skala (Figur 4), justere lysstyrke og kontrast af billedet for at tillade klar visualisering af ventrikulære vægge eller blodgennemstrømning mønster.
- Ved hjælp af B-tilstandsbilledet skal du åbne rullelisten fra PSLAX-indstillingen (parasternal lang akse) på hjertepakken/målingerne (figur 4). Vælg LV spore og spore ventrikulære indre væg på systole og diastole at opnå ventrikulære område (VA) i systoli (VAs) og diastole (VAd), ende diastolisk volumen (EDV), og ende systolisk volumen (ESV) ( Figur5A, B).
BEMÆRK: Lydstyrkeværdier ekstrapoleres fra 2D-billedsporinger og kan afvige fra 3D-objektet. For alle målinger, gennemsnit mindst 3 repræsentative hjertecyklusser pr dyr. - Bemærk den stregvolumen og udslyngningsfraktion, der automatisk beregnes og vises af softwaren.
BEMÆRK: Slagtilfælde volumen, og udslyngning fraktion kan også manuelt beregnes ved hjælp af formler
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
hvor SV er slagvolumen, EDV er endediastolisk volumen, ESV er endesystolisk volumen, og EF er udslyngning fraktion - Beregne ændring af brøkområde ved hjælp af formlen
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
hvor FAC er fraktioneret område ændring, VAd er ventrikulær område i diastole, og VM er ventrikelområde i systole. - Beregn hjerteoutputtet ved hjælp af formlen
CO = HR x SV
hvor CO er hjerteoutput, HR er puls, og SV er slagtilfælde volumen - Brug billedet af Pulserende Wave Doppler Mode til at måle indløbsblodhastigheden ved at vælge indstillingen MV Flow under hjertepakken ( figur4). Vælg E eller A for tidlig diastole og sen diastole, henholdsvis, og bestemme peak-hastigheder på grafen (Figur 3C).
- Udstrømningshastigheden måles ved at vælge AoV Flow, og spidserne bestemmes på sporingen (figur 3D).
- Mål pulsen ved hjælp af 2 forskellige metoder for en mere pålidelig vurdering:
- Når hjertet visualiseres på skærmen under billederhvervelse, tælle slag inden for 10 s og gange det med 6.
- Brug pulse wave doppler-billedet på Vevo LAB-softwaren til at vælge pulsknappen og spore intervallermellem 3 på hinanden følgende aortaflowtoppe(figur 4 og figur 6).
- Hvis du vil eksportere data til et regneark efter at have sporet LV'et og blodgennemstrømningens toppe, skal du klikke på rapport | eksport | undtagen som | excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokol giver mulighed for måling af vigtige hjertedimensionelle og funktionelle parametre, svarende til den teknik, der anvendes i human- og dyreekkokardiografi. B-mode billederne giver mulighed for sporing af ventrikulær indre væg i systoli og diastol (Figur 5) og opnåelse af dimensionelle data, såsom kammer og væg dimensioner, og funktionelle data, såsom puls, slagtilfælde volumen, og hjerteoutput samt parametre for ventrikulær systolisk funktion, såsom fraktioneret område ændring og udslyngning fraktion (Tabel 1). Målinger på niveau med atrioventrikulær ventil ved hjælp af farve Doppler Mode billeder giver også ventrikulær indstrømning og udstrømning blodhastigheder (hastighed, hvormed blodet fylder og forlader ventrikel, henholdsvis) (Figur 3 og Tabel 1).
De parametre, der blev opnået i denne undersøgelse, var sammenlignelige med dem, der blev rapporteret i tidligere undersøgelser under anvendelse af lignende forsøgsbetingelser6,16,17 ( tabel1), hvilket yderligere påviste metodens reproducerbarhed. Samlet set viser vi, at man ved hjælp af denne detaljerede protokol effektivt og konsekvent kan vurdere zebrafisks hjertefunktion, hvilket er afgørende, når man sammenligner forskellige hjertefænotyper i løbet af en undersøgelse.
Figur 1: Illustration af voksen zebrafisk hjerte. Blodgennemstrømningen er repræsenteret ved pile: blodet flyder fra sinus venosus til atrium og overføres yderligere til hjertekammer, hvor det pumpes til bulbus arteriosus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fiskebilleddannende kammer. (A) For at forberede et "kammer" til fisk, placeres en svamp med et snit mod den ene ende i lodret retning i en glasbeholder. (B) Glasbeholderen er derefter solidt tapede på den skrå billeddannelsesplatform. (C) Transduceren monteres på manipulatoren og placeres parallelt med snittet til korrekt billedplacering (transducerhakket peger mod operatøren). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Atrioventrikulær indstrømning (A) og udstrømning (B) i farvedopplertilstand og tilsvarende pulserende wave doppler for at vurdere hastigheden af de respektive ventrikulære diastoliske bølgetoppe (C) og ventrikulær udstrømning (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billedanalyse. Efter billedbehandling (for at opnå den ønskede kontrast og lysstyrke i billedet) kan målinger udføres i PW Doppler-tilstand (venstre) og B-tilstand (højre) billeder. Hvis du vil spore LV-væggen i B-tilstandsbilledet, skal du vælge Hjertepakke i rullemenuen, gå til PSLAXog vælge LV Trace. Hvis du vil måle spidshastigheder i PW Doppler-tilstandsbilledet, skal du vælge Hjertepakke i rullemenuen. For at måle ventrikelblodets blodindløbshastighed skal du vælge indstillingen MV Flow og vælge E eller A for henholdsvis tidlig diastol og sen diastol. For bestemmelse af udstrømningblodhastighed, skal du vælge AoV Flow og AV peak hastighed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billeder i B-tilstand. (A) B-Mode billede af hjertekammer (V) i diastole, fyldt med blod, der kommer fra atrium (A). (B) B-Mode billede af hjertekammer i systole, skubbe blod gennem bulbus arteriosus (B, grøn sporing). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Pulse Wave Doppler billede. En pulsværdi kan genereres ved at spore 3 på hinanden følgende aorta flowtoppe. Aortaflowspidserne kan vises ved at vælge pulsknappen under fanen Målinger i analysesoftwaren. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Parametre, enheder ± sd | Denne undersøgelse | Wang, L. et al,2017; Lee, L. et al, 2016 & Mishra, S. et al,2019 | Kommentarer/beskrivelse |
| Puls (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | Vilde typer AB/ABTU hanner og hunner mellem 3-12 måneder bestøvet i tricain0 0,2 mg/ml |
| Ændring af brøkområde (FAC) | 0,38 ± 0,03 | 0,29 ± 0,07 - 0,39 ± 0,05 | |
| Udslyngningsfraktion (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0,04 - 48 ± 0,03 | |
| Slagvolumen (SV), μL | 0,21 ± 0,01 | 0,18 ± 0,06 - 0,28 ± 0,08 | |
| Hjerteoutput (CO), μL min-1 | 27,3 ± 1,69 | 19 ± 9,5 - 36,1 ± 7,8 | |
| E tophastighed (tidlig ventrikulær tilstrømning), mm/s | 30 ± 6,8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| En tophastighed (sen ventrikulær tilstrømning), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| Ventrikulær udstrømning, mm/s | 86,6 ± 19 | Nielsen |
Tabel 1: Ekkokardiografiske parametre hos voksne zebrafisk. Værdier opnået for de hjertefunktionsparametre, der er evalueret i den nuværende undersøgelse for voksne hun- eller hunzebrafisk mellem 3 og 12 måneder bedøvet i en 0,2 mg/ml tricainopløsning. En række af de værdier, der er opnået for de samme parametre i tidligere undersøgelser6,16,17 udført under lignende betingelser præsenteres for validering og for at hjælpe med at standardisere metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en systematisk metode til ekkokardiografisk billeddannelse og vurdering af hjertefunktion hos voksne zebrafisk. Ekkokardiografi er den eneste tilgængelige ikke-invasive og mest robuste metode til levende voksne fisk hjertebilleddannelse og funktionel analyse, og det bliver stadig mere populær i zebrafisk hjerte-kar-forskning. Den tid, der er behov for, er kort og giver mulighed for høj-throughput og langsgående undersøgelser. Der er imidlertid betydelige forskelle i den anvendte metode og dataanalysen. Standardisering af zebrafisk ekkokardiografi er meget vanskeligt, når så mange variabler kan påvirke de kommende parametre. Når du udfører eksperimentelle undersøgelser, bør man overveje betingelser, der kan producere variation, herunder anæstesi, kropsvægt, alder, køn, og baggrund stamme. Wang, L et al.16 vurderede variabiliteten indført ved disse faktorer og indsamlede de tilgængelige data om zebrafiskhjertefunktion for at hjælpe med at standardisere metoden. Deres undersøgelse er en meget nyttig ressource til at designe eksperimentelle undersøgelser, der involverer zebrafisk ekkokardiografisk vurdering. Baseret på de oplysninger, som Wang, L et al.16 og referencer inden for og vores egne observationer6,giver vi en oversigt over kritiske trin og betingelser, vi fandt vigtige for protokol optimering og reproducerbarhed:
Valg af prøve: Tidligere undersøgelser tyder på, at mens systoliske funktionsparametre (EF, FAC) ikke påvirkes væsentligt af kønsforskelle, kan diastolisk funktion (dvs. peak wave E/A-forholdet) være betydeligt lavere hos kvinder over 6 måneder. Det blev også bemærket, at ventrikelområder og mængder stige betydeligt med fisk alder (3 måneder og ældre) og er betydeligt højere hos kvinder på grund af deres højere kropsvægt og størrelse. Indeksering diastoliske mængder til body-mass index (BMI) og krop overfladeareal (BSA) kan bidrage til at afskaffe forskelle mellem alderssvarende kvinder og mænd, og indeksering til BSA og vægt kan hjælpe med at overvinde aldersrelaterede diastoliske volumen forskelle16. Der var også rapporter om forskellige diastoliske funktioner mellem fisk med forskellige baggrundsstammer16. Samlet set, når du vælger eksperimentelt design, er det tilrådeligt at bruge alder- og stamme-matchede kontroller og undgå at blande forskellige køn. Brug af hanner anbefales, da billedkvaliteten var lavere hos gravide hunner.
Scanningsposition: I denne opsætning er der mulighed for to scanningspositioner: længdeakse og kort akse. Vi fandt, at i kort akse tilstand var det meget svært at identificere hjertekamrene. Derfor brugte vi kun langsgående akse og anbefaler sidstnævnte til afgrænsning af hjertekamrene i B-tilstand og afledning af ventrikulær størrelse og funktion.
Anæstesi :Tilstrækkelig sedation er afgørende for at undgå betydelige bradycardia under måling. Puls vil påvirke hjertefunktionelle måling, kompromittere nøjagtigheden af undersøgelsen. Tricaine er den mest almindelige anæstesimiddel og en dosis på 0.2 mg/ml blev fundet at give tilstrækkelig sedation. Måletiden er dog kritisk, da pulsen begynder at falde efter 3-4 min under sedation16. For at undgå at indføre variabilitet er det vigtigt at holde målingerne under 3 min.
Kritiske parametre: Puls kan betragtes som en kritisk parameter, når den sigter mod konsistens og nøjagtighed. Pulsen skal være sammenlignelig mellem de testede forsøgsgrupper og inden for det værdiområde, der rapporteres for de anvendte forhold. Vi fandt, at en rækkevidde på 118 ± 14 til 162 ± 32 bpm kan repræsentere de normale værdier for vilde type zebrafisk 3-12 måneder gamle voksne bestøvet med 0,2 mg/ml tricaine i mindre end 3 min.
Resultatnøjagtighed: For at sikre nøjagtighed skal målingerne foretages over mindst 3 hjertecyklusser. For at opnå mere præcise manuelle billedsporinger bør analysen udføres på en blindet måde.
Ud over at vælge de mest hensigtsmæssige betingelser, er flere aspekter afgørende for at sikre nøjagtig måling. Ideelt set bør forholdene holdes så tæt på den normale fisk fysiologiske tilstand som muligt. Udførelse af scanningen under vand har den fordel, at holde fiskene i deres naturlige miljø og tæt på normale forhold for gas udveksling, vandsammensætning, hydrostatisk tryk, og temperatur. Disse er klare fordele i forhold til tidligere undersøgelser, hvor under scanning fisk er placeret i en våd svamp udsat for rumluft og ledningsevne er aktiveret ved ultralyd gel i stedet for vand9,10. Undervandsscanning giver også mulighed for genopretning af fisken efter proceduren, forudsat at tiden mellem anæstesi og nyttiggørelse holdes under 3 minutter, og fiskene returneres til genvindingsvand umiddelbart efter målingen. For at sikre, at proceduren udføres så hurtigt og effektivt som muligt, er det tilrådeligt at bruge en betydelig mængde tid på uddannelse, før der udføres forsøg.
Ekkokardiografi er en meget veletableret metode til at evaluere hjertefunktion i klinisk praksis samt i murine (eller andre pattedyr) dyremodeller. Men i modsætning til murine eller human ekkokardiografi, udfører fisk ultralyd under vandet tillader ikke tilslutning af prøven til elektroderne. Derfor er direkte måling af hjerte- og åndedrætsrater ikke mulig. I så fald kan pulsmåles ved at tælle slagene pr. min. i et interval på 10 eller 15 minutter eller ved manuelt at spore 3 på hinanden følgende aortaflowtoppe (Figur 6). Puls påvirker også bestemmelse af andre parametre, såsom hjerte-output, der skal beregnes manuelt, når parametre såsom slagtilfælde volumen er opnået gennem ventrikulære indre væg sporing. Et andet aspekt at overveje er, at fisk hjerte morfologi er helt forskellig fra pattedyr. I det tokammerede zebrafiskhjerte bestemmes ventrikelfyldning for det meste af atriesammentrækning, og fisk udgør typisk et meget lavere tidligt til sent ventrikulært fyldningsforhold sammenlignet med pattedyr18. Dette forklarer den forskellige profil opnået ved puls bølge Doppler i A og E toppe mellem zebrafisk og sunde pattedyr hjerter.
Ekkokardiografi muliggør en grundig karakterisering af fiskhjerteprofilen og kvantificering af flere funktionelle parametre. De værdier, der er opnået for udslyngningsfraktion, ændring af fraktioneret område, blodindstrømning og udstrømningshastigheder, puls og hjerteoutput ligger i det interval, der er rapporteret af tidligere undersøgelser (tabel 1), og fremhæver metodens reproducerbarhed. Samlet set viser vores data, at højfrekvent ultralydekkokardiografi er en robust og reproducerbar metode til at måle zebrafisk hjertemorfologi og funktion ved evaluering af sygdomsmodeller eller test af lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Fred Roberts' tekniske støtte og revision af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
