Summary
Мы описываем протокол для оценки морфологии сердца и функции у взрослых зебры с помощью высокочастотной эхокардиографии. Метод позволяет визуализировать сердце и последующую количественную оценку функциональных параметров, таких как частота сердечных приступов (HR), выход сердца (CO), изменение дробной области (FAC), фракция выброса (EF), а также скорость притока крови и оттока.
Abstract
Зебрафиш(Danio rerio) стал очень популярным модельным организмом в сердечно-сосудистых исследованиях, включая сердечные заболевания человека, во многом благодаря своей эмбриональной прозрачности, генетической уступчивости и удобствам для быстрых, высокопроизводительных исследований. Однако потеря прозрачности ограничивает анализ функций сердца на взрослой стадии, что усложняет моделирование возрастных заболеваний сердца. Для преодоления таких ограничений, высокочастотная ультразвуковая эхокардиография у зебры становится жизнеспособным вариантом. Здесь мы представляем подробный протокол для оценки сердечной функции у взрослых зебры с помощью неинвазивной эхокардиографии с помощью высокочастотного ультразвука. Метод позволяет визуализировать и анализировать измерение сердца зебры и количественно ежемерскую оценку важных функциональных параметров, включая частоту сердечных приступов, объем инсульта, выход сердца и выброс фракции. В этом методе, рыбы под обезглавлены и хранятся под водой и могут быть восстановлены после процедуры. Хотя высокочастотный ультразвук является дорогостоящей технологией, одиниковую платформу визуализации можно использовать для различных видов (например, мурина и зебры) путем адаптации различных преобразователей. Эхокардиография зебры является надежным методом сердечного фенотипирования, полезным для проверки и характеристики моделей заболеваний, особенно позднего начала заболеваний; экраны наркотиков; и исследования сердечно-сотруднических травм, восстановления и регенеративной способности.
Introduction
Зебрафиш(Danio rerio) является устоявшейся позвоночной моделью для изучения процессов развития и заболеваний человека1. Зебрафиш обладают высоким генетическим сходством с человеком (70%), генетической усваиваемостью, высокой плодовитостью и оптической прозрачностью во время эмбрионального развития, что позволяет прямо проводить визуальный анализ органов и тканей, в том числе сердца. Несмотря на наличие только одного предсердия и одного желудочка, сердце зебры(рисунок 1) физиологически похоже на четырехкамерные сердца млекопитающих. Важно отметить, что частота сердечных приступов зебры, морфология электрокардиограммы и потенциальная форма действия напоминают формы людей больше, чем виды мурин2. Эти особенности сделали зебрафиш отличной моделью для сердечно-сосудистых исследований и обеспечили основные идеи в сердечное развитие3,4, регенерация5, и патологические условия1,,3,4, в том числе атеросклероз, кардиомиопатии, аритмии, врожденные пороки сердца, и амилоидный свет сердечной токсичности1,43,6. Оценка сердечной функции стала возможной на эмбриональной стадии (1-дневное послеоплодное) путем прямого видеоанализа с использованием высокоскоростной видеомикроскопии7,,8. Тем не менее, зебрафиш теряют прозрачность за эмбриональной стадии, ограничивая функциональные оценки нормальных зрелых сердец и поздних сердечных заболеваний. Чтобы преодолеть это ограничение, эхокардиография была успешно использована в качестве высокого разрешения, в режиме реального времени, неинвазивные альтернативы изображений для оценки функции сердца зебры взрослых9,10,11,12,13,14,15.
У зебры сердце расположено венцомально в грудной полости сразу же застежки с предсердием, расположенным в дорсе к желудочку. Атриум собирает венозную кровь из синусовой веносики и передает ее в желудочек, где он далее перекачивается в артериоз пулезного(рисунок 1). Здесь мы описываем физиологический, подводный протокол для оценки сердечной функции у взрослых зебры с помощью неинвазивной эхокардиографии с помощью линейного ультразвукового зонда с центральной частотой 50 МГц для Визуализации B-режима с разрешением 30 мкм. Так как ультразвуковые волны могут легко путешествовать через воду, сохраняя близость между рыбой и сканирующий зонд под водой обеспечивает достаточную контактную поверхность для обнаружения сердца без необходимости для ультразвукового геля и в целом менее напряженным для рыбы. Хотя альтернативные системы эхокардиографии зебры были зарегистрированы несколькими авторами9,12,13, здесь мы представляем общие и наиболее часто используемые установки, которая применяется к высокочастотной ультразвука у животных.
Метод позволяет с высоким разрешением изображения сердца взрослого зебры, отслеживание сердечных структур, а также количественное измерение пиковых скоростей от измерений кровотока доплеров. Мы показываем надежную виво-количественную оценку важных систолических и диастолических параметров, таких как фракция выброса (EF), изменение дробной области (FAC), скорость притока и оттока желудочков, частота сердечных приступов (HR) и сердечный выброс (CO). Мы вносим свой вклад в создание надежного диапазона нормальных здоровых взрослых зебры сердечных функциональных и размерных параметров, чтобы позволить более точное обследование патологических состояний. В целом, мы предоставляем надежный метод для оценки сердечной функции у зебры, которая оказалась чрезвычайно полезной в создании и проверке моделей болезни сердца зебры6,16, травмы сердца и восстановления10,13, и регенерации11,12, и может быть дополнительно использован для оценки потенциальных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с зебрафишами, были одобрены нашим Институциональным Комитетом по уходу за животными и эксплуатации и соответствуют Закону о защите животных Министерства сельского хозяйства США.
1. Экспериментальная настройка
-
Настройка платформы для приобретения изображений
- Используя небольшие ножницы или скальпель сделать разрез на губку в положении 12 часов, чтобы держать рыбу во время сканирования. Поместите губку в стеклянный контейнер(рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Положение разреза должно позволить достаточно места для перемещения преобразователя, а также держать рыбу ниже линии воды, когда платформа наклонена для сканирования (Рисунок 2). Разрез может варьироваться в зависимости от размера рыбы; однако для стандартного размера и веса разрез должен составить примерно 2,5 см х 0,7 см х 0,5 см (длина, ширина и глубина соответственно). Стеклянный контейнер должен быть не менее 6 см глубиной, чтобы избежать утечки воды во время визуализации рыбы. - Прикрепите стеклянную коробку, содержащую губку на ультразвуковой платформе, например, с помощью двусторонней ленты. Убедитесь, что стеклянная коробка находится в центре платформы и прочно прикрепляется(рисунок 2B).
- Наклоните платформу вперед около 30 ", используя ручку на левой стороне держателя платформы (Рисунок 2B). Заполните стеклянный квадрат 200-250 мл воды рыбной системы, содержащей 0,2 мг/мл трикатульфона (MS222).
ПРИМЕЧАНИЕ: Трикаин может быть подготовлен в виде 4 мг/мл бульонного раствора в Tris 40 mM pH 7 и далее разбавлен до нужной концентрации в воде рыбной системы; 0,2 мг/мл было установлено, что лучшая концентрация16. Раствор из 4 мг/мл трикаина может храниться в течение длительного периода времени при -20 градусах Цельсия или при 4 градусах По области в течение одного месяца. - Вставьте преобразователь в держатель микроманипулятора на работающую железнодорожную станцию, поворачивая выемку преобразователя к оператору. Держите массив параллельно земле с рабочей стороны продольной по отношению к сцене (см. Рисунок 2B). Оставьте достаточно места (10 см с обеих сторон) для теперь подключенной трансдуктер-железнодорожной системы для перемещения по x- и y-axes.
- Войти в программное обеспечение управления и выбрать мышь (малый) сосудистые. Создайте новое исследование, а также новую серию для каждого животного, включенного в исследование. Найдите новую кнопку исследования, расположенную в нижней левой части экрана, на странице браузера (представление начинается в B-режиме).
- Используя небольшие ножницы или скальпель сделать разрез на губку в положении 12 часов, чтобы держать рыбу во время сканирования. Поместите губку в стеклянный контейнер(рисунок 2A).
2. Обработка рыбы
ПРИМЕЧАНИЕ: Зебрафиш, используемых в этом исследовании были взрослые, 11-месячные самцы дикого типа штаммab/Tuebingen (AB/TU). Зебрафиш поддерживался в автономной системы протекать через аквариум на 28 градусов по Цельсию в постоянном световом цикле, установленном как 14 h свет/10 ч темно. Зебрафиш кормили два раза в день с рассолом креветки(Artemia nauplii) и сухих пищевых хлопьев.
- Используя рыбную сеть, перенесите рыбу в небольшой резервуар, содержащий системную воду с 0,2 мг/мл трикаина. Подождите, пока рыба полностью анестезируется (без движения и никакого ответа на ощупь).
- Используя пластиковую чайную ложку, аккуратно и быстро перенесите рыбу в стеклянную коробку, содержащую губку, в ранее сделанный разрез с брюшной стороной рыбы вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова рыбы расположена к оператору (то же направление, как выемка преобразователя) и на несколько более высоком уровне по сравнению с остальной частью тела для достижения лучшей визуализации сердца. - Аккуратно опустите преобразователь (сохраняя исходное положение) с помощью ручки на железнодорожной системе, поместив его продольно и близко к брюшной стороне рыбы с выемкой преобразователя, обращенной к оператору. Оставьте 2-3 мм (не более 1 см) клиренс от рыбы. Отрегулируйте платформу в отношении преобразователя с помощью микроманипулятора во всех 3 осях, пока сердце рыбы не будет визуализировано, а затем начать приобретение изображения. Угол преобразователя не должен изменяться в течение всего приобретения изображения(рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока существует достаточная близость (до 1 см), вода в верхней части рыбы обеспечит контактную поверхность через жидкое поверхностное натяжение, что позволяет передавать ультразвуковые волны между зондом и рыбой. Поэтому нет необходимости толкать преобразователя против рыбы. Попробуйте завершить этот шаг и закончить сканирование менее чем за 3 минуты, чтобы предотвратить гибель рыбы или снижение частоты сердечных сокращений во время приобретения изображения. При необходимости используйте таймер. Сердце может быть найдено на верхней стороне экрана к левой стороне глаза, которая может быть легко визуализирована при перемещении x-оси вплоть до правой. Если есть постоянные трудности в поиске сердца в то время как в B-Mode, переключиться на цвет Доплера режиме, который позволит для отслеживания кровотока (красный указывает крови течет к оператору) и размещения сердца.
3. Приобретение изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу Материалов для системы визуализации и программного обеспечения для анализа изображений.
- Продольное представление B-Mode
- После локализации сердца, выберите или остаться в B-Mode (находится в нижней левой стороне сенсорного экрана после начала новой серии) и уменьшить поле для того, чтобы увеличить и присмотреться к сердцу для облегчения отслеживания во время анализа.
- Для того, чтобы иметь более четкое и четкое представление о сердце в b-Mode приобретение изображения, уменьшить поле путем увеличения дюйма Используйте сенсорный экран, чтобы вручную сузить поле на обоих x- и y-axes.
- При необходимости увеличьте качество/контраст изображения, установив динамический диапазон до 45-50 дБ. Перейдите к элементам управления B-режимом в опции More Controls и затем сохраните изменение в пресетах режима. Нажмите режим пресетов, чтобы выбрать оптимизированную настройку приобретения изображения каждый раз, прежде чем начать изображение новой серии.
- Возьмите столько изображений, сколько пожелает в длинной плоскости оси, выбрав Сохранить изображение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию и учебные ресурсы по приобретению изображений можно найти в https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab и https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Продольное представление Импульсная волна
- Переключитесь на Color Doppler для обнаружения кровотока (выберите кнопку Color) и приобретения (найден в нижней левой части сенсорного экрана после начала новой серии).
- Используя положение сенсорного экрана, квадрант поверх атриовентрикулярного клапана и локализуйте приток, который будет отличаться красным цветовым сигналом(рисунок 3А). Сократите площадь квадранта как можно больше, чтобы увеличить частоту кадров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя цвет импульсно-повторение-частота (Цвет PRF) (диапазон скорости), чтобы обеспечить желтый цвет можно увидеть в профиле скорости изображения Цвет доплера. Это увеличит диапазон скоростей, которые можно увидеть, и поможет создать мозаику цвета, которая позволит более четко визуализировать пиковые скорости. - Активировать импульсную волну (выберите PW) Доплеровский режим для образца скорости притока желудочковой крови. Расположите ворота объема образца в центре атриовентрикулярного клапана (где красный цветной сигнал становится более желтоватым), чтобы определить максимальную скорость потока. Отрегулируйте угол PW на экране с помощью пальцев, чтобы он выравнивался в направлении притока крови. Нажмите начать или обновить, чтобы начать выборку скорости крови, поступающей в желудочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что угол правильной линии параллельно кровоток для того, чтобы обеспечить последовательные и воспроизводимые результаты. Размещение правильной линии угла, чтобы она соответствовала направлению кровотока, гарантирует точное захват скорости. - Повторите шаг 3.2.3 для определения скорости оттока, разместив квадрант Color Doppler на стыке желудочка и луковицы (буллювентрикулярный клапан) и локализуйте поток, который будет отличаться сигналом синего цвета(рисунок 3B). Расположите ворота объема образца прямо перед соединением желудочка-бульбуса и отрегулируйте линию коррекции угла в соответствии с направлением кровотока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось ранее, для достижения точных значений скорости, убедитесь, что угол PW выравнивается с кровотоком. - Отрегулируйте исходную линию (бар), опустив или подняв ее в панели скорости потока, чтобы полностью обнаружить и отследить пики сигнала(рисунок 3C,D). Определите пики притока в верхнем/положительном квадранте (сигнал, идущий к зонду) и пики оттока в нижнем/отрицательном квадранте (сигнал, уходящий от зонда).
4. Восстановление рыбы
- Как только приобретение изображения завершено, используя чайную ложку, передать рыбу в регулярную систему атерированную воду без трикаина и пусть рыба восстановить (обычно занимает от 30 с до 2 минут, чтобы возобновить движение жаберных и плавание).
- Чтобы помочь восстановлению, шприц воды неоднократно над жабры с помощью передачи пипетки для содействия аэрации воды и кислорода передачи.
5. Анализ изображений
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
- Выберите изображение и нажмите на значок обработки изображений(рисунок 4). Используя имеющуюся шкалу(рисунок 4),отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы обеспечить четкую визуализацию стенок желудочков или шаблонкровного потока.
- Используя изображение B-режима, откройте выпадающий список из PSLAX (парастернальной длинной оси) вариант на сердечный пакет / измерения (Рисунок 4). Выберите LV след и проследить желудочковой внутренней стенки в систолы и диастолии для получения желудочковой области (VA) в систоле (VAs) и диастоле (VAd), конец диастолического объема (EDV), и конец систолического объема (ESV) (Рисунок 5A, B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения объема экстраполируются из отслеживания 2D-изображений и могут отклоняться от 3D-сущности. Для всех измерений, в среднем по крайней мере 3 репрезентативных сердечных циклов на одно животное. - Обратите внимание на объем хода и фракцию выброса, которые будут автоматически вычисляться и отображаться программным обеспечением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем хода и фракция выброса также могут быть вычисляться вручную с помощью формул
СВ и EDV-ESV
ЭФ -З. (EDV-ESV)/EDV
где SV является объем инсульта, EDV является конец диастолический объем, ESV конец систолического объема, и EF является выброс фракции - Рассчитайте изменения дробной области с помощью формулы
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
где FAC является дробное изменение области, VAd является желудочковой области в диастоле, и VAs является желудочковой области в систоле. - Рассчитайте сердечный выход с помощью формулы
CO и HR x SV
где CO является сердечный выход, HR частота сердечных приступов, и SV является объем инсульта - Используя изображение Pulsed Wave Doppler Mode, измерьте скорость притока крови, выбрав опцию MV Flow под сердечным пакетом (рисунок 4). Выберите E или A для ранней диастолы и поздней диастолы, соответственно, и определите пиковые скорости на графике(рисунок 3C).
- Измерьте скорость оттока крови, выбрав AoV Flow и определите пики на трассировке(рисунок 3D).
- Измерьте частоту сердечных приступов с помощью 2 различных методологий для более надежной оценки:
- Когда сердце визуализировано на экране во время приобретения изображения, подсчитайте удары в пределах 10 с и умножьте их на 6.
- Используя изображение Pulse Wave Doppler на программном обеспечении Vevo LAB, выберите кнопку частоты сердечных приступов и интервалы трассировки между 3 последовательными пиками аортального потока(рисунок 4 и рисунок 6).
- Для экспорта данных в электронную таблицу после того, как прослеживается LV и пики кровотока, нажмите на отчет и экспорт и сохранить, как excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный протокол позволяет измерять важные сердечные мерные и функциональные параметры, аналогичные технике, используемой в эхокардиографии человека и животных. B-Mode изображения позволяют отслеживания желудочковой внутренней стенки в систолы и диастолы(Рисунок 5) и получения размерных данных, таких как камеры и стены размеры, и функциональные данные, такие как частота сердечных ударов, объем инсульта, и сердечный выход, а также параметры желудочковой систолической функции, такие как изменения дробальной области и выброса фракции (Таблица 1). Измерения на уровне атриовентрикулярного клапана с использованием цветных изображений Doppler Mode также обеспечивают желудочковый приток и скорость оттока крови (скорость, при которой кровь заполняет и выходит из желудочка, соответственно) (Рисунок 3 и Таблица 1).
Параметры, полученные в данном исследовании, были сопоставимы с параметрами, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях с использованием аналогичных экспериментальных условий66,16,,17 (таблица 1),что еще больше демонстрирует воспроизводимость метода. В целом, мы показываем, что с помощью этого подробного протокола можно эффективно и последовательно оценивать сердечную функцию зебры, что имеет решающее значение при сравнении различных сердечных фенотипов во время исследования.
Рисунок 1: Иллюстрация сердца взрослого зебры. Кровотока представляет собой стрелки: кровь течет из синусового вена в предсердие и далее передается в желудочек, где ее перекачивают в артериальный артериальный желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рыбно-образная камера. (A) Для подготовки рыбообразной "камеры", губка с разрезом на один конец в вертикальной ориентации помещается в стеклянный контейнер. (B) Стеклянный контейнер затем прочно лентой на наклонной платформы изображений. (C) Преобразователь устанавливается на манипулятор и помещается параллельно разрезу для правильного позиционирования изображения (выемка преобразователя указывает на оператора). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Атриовентрикулярный приток (A) и отток (B) в режиме Color Doppler и соответствующий Импульсный доплеровская волна для оценки скоростей соответствующих желудочковых диастолических волновых пиков (C) и желудочкового оттока (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ изображений. После обработки изображений (для достижения желаемого контраста и яркости изображения) измерения могут быть выполнены в режиме PW Doppler (слева) и B-режиме (справа). Чтобы проследить стену LV в B-режиме изображения, выберите сердечный пакет из выпадающих меню, перейдите на PSLAX, и выберите LV Trace. Для измерения пиковых скоростей в режиме PW Doppler, выберите сердечный пакет из выпадающего меню. Для измерения скорости притока желудочков, выберите вариант MV Flow и выберите E или A для ранней диастолы и поздней диастоли, соответственно. Для определения скорости оттока крови выберите AoV Flow и ПИКовую скорость AV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: B-режим изображения. (A) B-Mode изображение желудочка (V) в диастоле, наполненном кровью, поступающей из предсердия (A). (B) B-Mode изображение желудочка в систоле, выбрасывая кровь через артериоз bulbus (B, зеленый трассировка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Импульсная волна Доплера изображение. Значение частоты сердечных приступов может быть получено путем отслеживания 3 последовательных пиков аорты потока. Пики аортального потока могут отображаться, выбирая кнопку частоты сердечных колеи во вкладке измерений в программном обеспечении для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Параметры, единицы и sd | Это исследование | Ван, Л. и др., 2017; Ли, Л. и др., 2016 и Мишра, S. et al, 2019 | Комментарии/Описание |
| Частота сердечных приступов (HR), bpm | 133 х 7 | 118 и 14 - 162 и 32 | Дикие типы AB/ABTU самцов и самок в возрасте от 3 до 12 месяцев обезболиливаются в трикаине 0,2 мг/мл |
| Изменение фракционной области (FAC) | 0,38 и 0,03 | 0,29 и 0,07 - 0,39 и 0,05 | |
| Фракция выброса (EF), | 42 х 7 | от 34 до 0,04 - 48 и 0,03 | |
| Объем хода (SV), ЗЛ | 0,21 евро 0,01 | 0,18 и 0,06 - 0,28 и 0,08 | |
| Сердечный выход (CO), м/л мин-1 | 27,3 и 1,69 | 19 - 9,5 - 36,1 и 7,8 | |
| E пиковая скорость (ранний желудочковый приток), мм/с | 30 и 6,8 | 25 х 7 - 51 и 16 | |
| Пиковая скорость (поздний желудочковый приток), мм/с | 152 х 32 | 144 х 36 - 288 и 54 | |
| Венцулярный отток, мм/с | 86,6 и 19 | n/a |
Таблица 1: Эхокардиографические параметры у взрослых зебры. Значения, полученные для параметров сердечной функции, оцененных в текущем исследовании для взрослых мужчин или женщин зебры между 3 и 12 месяцами под нейтерянный в 0,2 мг/мл трикаина раствора. Диапазон значений, полученных по тем же параметрам в предыдущих исследованиях66,16,,17 выполненных в аналогичных условиях, представлен для проверки и для стандартизации метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем систематический метод эхокардиографической визуализации и оценки сердечной функции у взрослых зебры. Эхокардиография является единственным доступным неинвазивным и наиболее надежным методом для живой взрослой рыбы сердечной визуализации и функционального анализа, и она становится все более популярным в зебрафиш сердечно-сосудистых исследований. Время, необходимое, является коротким и позволяет высокой пропускной и продольной исследований. Вместе с тем существуют значительные различия в используемой методологии и анализе данных. Стандартизация эхокардиографии зебры очень сложна, когда так много переменных могут влиять на исходящие параметры. При проведении экспериментальных исследований следует учитывать условия, которые могут привести к изменчивости, включая анестезию, массу тела, возраст, пол и фоновое напряжение. Wang, L et al.16 оценили изменчивость, введенную этими факторами, и собрали имеющиеся данные о сердечной функции зебры, чтобы помочь стандартизировать метод. Их исследование является очень полезным ресурсом для разработки экспериментальных исследований с участием зебры эхокардиографической оценки. Основываясь на информации, предоставленной Wang, L et al.16 и ссылками внутри и нашими собственными наблюдениями6, мы предоставляем наброски критических шагов и условий, которые мы считали важными для оптимизации протокола и воспроизводимости:
Выбор образца: Предыдущие исследования показывают, что в то время как систолические параметры функции (EF, FAC) не сильно зависят от половых различий, диастолическая функция (а именно пиковая волна E/A отношение) может быть значительно ниже у женщин старше 6 месяцев. Было также отмечено, что желудочковые области и объемы значительно увеличиваются с возрастом рыбы (3 месяца и старше) и значительно выше у женщин из-за их более высокой массы тела и размера. Индексация диастолических объемов к индексу массы тела (ИМТ) и площади поверхности тела (BSA) может помочь отменить различия между возрастными самками и мужчинами, а индексация до BSA и веса может помочь преодолеть возрастные диастолические разницы объема16. Были также сообщения о различных диастолических функций между рыбами с различными штаммами фона16. В целом, при выборе экспериментального дизайна, желательно использовать возрастные и напряженные элементы управления и избегать смешивания различных полов. Использование мужчин рекомендуется, так как качество изображения было ниже у gravid женщин.
Сканирование позиции: В этой установке возможны две сканирующие позиции: продольная ось и короткая ось. Мы обнаружили, что в режиме короткой оси было очень трудно определить сердечные камеры. Поэтому мы использовали только продольную ось и рекомендуем последнюю для разграничения сердечных камер в В-режиме и произвождения размеров и функций желудочков.
Анестезия: Адекватная седация имеет решающее значение, чтобы избежать значительного брадикардии во время измерения. Частота сердечных приступов будет влиять на сердечное функциональное измерение, ставя под угрозу точность исследования. Трикаин является наиболее распространенным анестетик и доза 0,2 мг/мл было установлено, чтобы обеспечить адекватное седацию. Тем не менее, время измерения имеет решающее значение, так как частота сердечных сокращений начинает снижаться после 3-4 мин под седацией16. Чтобы избежать введения изменчивости, важно держать измерения под 3 мин.
Критические параметры: Частота сердечных приступов может рассматриваться как критический параметр, когда стремятся к согласованности и точности. Частота сердечных приступов должна быть сопоставима между проверенными экспериментальными группами и в пределах значений, о которых сообщается в используемых условиях. Мы обнаружили, что диапазон от 118 до 162 и 32 bpm может представлять нормальные значения для диких типа зебры 3-12 месяцев взрослых анестезируется с 0,2 мг/мл трикаина менее чем за 3 мин.
Точность результата: Для обеспечения точности, измерения должны быть приняты в течение как минимум 3 сердечных циклов. Чтобы получить более точные ручные отслеживания изображений, анализ должен быть сделан в ослепленной манере.
Помимо выбора наиболее подходящих условий, некоторые аспекты имеют решающее значение для обеспечения точного измерения. В идеале условия должны быть максимально приближены к нормальному рыбьему физиологическому состоянию. Проведение сканирования под водой имеет то преимущество, что рыба находится в естественной среде обитания и близко к нормальным условиям для газообмена, состава воды, гидростатического давления и температуры. Это явные преимущества по сравнению с предыдущими исследованиями, где во время сканирования рыбы помещаются во влажную губку, подвергаемую воздействию комнатного воздуха, а проводимость позволяется ультразвуковым гелем вместо воды9,10. Подводное сканирование также позволяет восстановить рыбу после процедуры, при условии, что время между анестезией и восстановлением хранится под 3 мин и рыба возвращается в восстановительную воду сразу после измерения. Для обеспечения того, чтобы процедура была выполнена как можно быстрее и эффективнее, перед проведением экспериментов рекомендуется провести значительное количество времени, затрачиваемого на обучение.
Эхокардиография является очень хорошо установленным методом оценки сердечной функции в клинической практике, а также в моделях животных, используемых морскими или другими млекопитающими. Однако, в отличие от мурин или эхокардиографии человека, выполнение узи рыбы под водой не позволяет подсоединяться образец к электродам. Поэтому прямое измерение сердечно-соразмерейных и дыхательных путей невозможно. В этом случае частота сердечных приступов может быть измерена путем подсчета ударов на минуту в интервале 10 или 15 минут или вручную отслеживания 3 последовательных пиков аортального потока(рисунок 6). Частота сердечных приступов также влияет на определение других параметров, таких как выход сердца, которые должны быть рассчитаны вручную, как только параметры, такие как объем инсульта были получены через желудочковой внутренней стены трассировки. Другой аспект, чтобы рассмотреть, что морфология сердца рыбы сильно отличается от млекопитающих. В двухкамерном сердце зебры, желудочковая начинка в основном определяется сокращением предсердий, и рыбы, как правило, представляют гораздо более низкий ранний и поздний желудочковой заполнения соотношение по сравнению с млекопитающими18. Это объясняет различный профиль, полученный импульсной волной Доплера в пиках A и E между зебрафишами и здоровыми сердцами млекопитающих.
Эхокардиография позволяет тщательно охарактеризовать сердечный профиль рыбы и количественно определить несколько функциональных параметров. Значения, полученные для фракции выброса, изменения дробной области, скорость притока крови и оттока, частота сердечных приступов и выход сердца находятся в диапазоне, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях(таблица 1),подчеркивая воспроизводимость метода. Взятые вместе, наши данные показывают, что высокочастотная ультразвуковая эхокардиография является надежным и воспроизводимым методом измерения морфологии сердца зебры и функции при оценке моделей заболеваний или тестирования на наркотики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Фреда Робертса за техническую поддержку и пересмотр рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
