Summary
Nous décrivons un protocole pour évaluer la morphologie et la fonction de coeur dans le poisson zèbre adulte utilisant l’échocardiographie à haute fréquence. La méthode permet la visualisation du cœur et la quantification ultérieure des paramètres fonctionnels, tels que la fréquence cardiaque (HR), le débit cardiaque (CO), le changement fractionnel de zone (FAC), la fraction éjection (EF), et les vitesses d’affluence et d’écoulement du sang.
Abstract
Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle très populaire dans la recherche cardiovasculaire, y compris les maladies cardiaques humaines, en grande partie en raison de sa transparence embryonnaire, la tractabilité génétique, et les commodités à des études rapides et à haut débit. Cependant, la perte de transparence limite l’analyse de la fonction cardiaque à l’étape adulte, ce qui complique la modélisation des affections cardiaques liées à l’âge. Pour surmonter ces limitations, l’échocardiographie à haute fréquence par ultrasons chez le poisson zèbre apparaît comme une option viable. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour évaluer la fonction cardiaque dans le poisson zèbre adulte par échocardiographie non-invasive utilisant l’ultrason de haute fréquence. La méthode permet la visualisation et l’analyse de la dimension cardiaque du poisson zèbre et la quantification d’importants paramètres fonctionnels, y compris la fréquence cardiaque, le volume des accidents vasculaires cérébraux, la sortie cardiaque et la fraction d’éjection. Dans cette méthode, les poissons sont anesthésiés et gardés sous l’eau et peuvent être récupérés après la procédure. Bien que l’échographie à haute fréquence soit une technologie coûteuse, la même plate-forme d’imagerie peut être utilisée pour différentes espèces (p. ex., poissons murins et zèbres) en adaptant différents transducteurs. L’échocardiographie des poissons zèbres est une méthode robuste pour le phénotypage cardiaque, utile dans la validation et la caractérisation des modèles de maladies, en particulier les maladies tardives; les écrans de drogue; et des études sur les lésions cardiaques, la récupération et la capacité régénératrice.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle vertébré bien établi pour les études des processus de développement et des maladies humaines1. Les poissons zèbres ont une grande similitude génétique avec les humains (70%), la tractabilité génétique, la fécondité élevée et la transparence optique pendant le développement embryonnaire, ce qui permet une analyse visuelle directe des organes et des tissus, y compris le cœur. Bien qu’il n’ait qu’un atrium et un ventricule, le cœur du poisson zèbre(figure 1) est physiologiquement semblable aux cœurs à quatre chambres des mammifères. Fait important, la fréquence cardiaque des poissons zèbres, la morphologie de l’électrocardiogramme, et la forme potentielle d’action ressemblent à ceux des humains plus que les espèces murines2. Ces caractéristiques ont fait du poisson zèbre un excellent modèle de recherche cardiovasculaire et ont fourni des aperçus majeurs sur le développement cardiaque3,4, la régénération5, et les conditions pathologiques1,3,4, y compris l’artériosclérose, cardiomyopathies, arythmies, maladies cardiaques congénitales, et la cardiotoxicité de la chaîne de lumière amyloïde1,4,6. L’évaluation de la fonction cardiaque a été possible au cours de l’étape embryonnaire (1-jours après la fécondation) grâce à l’analyse vidéo directe à l’aide de la microscopie vidéo haute vitesse7,8. Cependant, les poissons zèbres perdent leur transparence au-delà du stade embryonnaire, limitant les évaluations fonctionnelles des cœurs matures normaux et des affections cardiaques tardives. Pour surmonter cette limitation, l’échocardiographie a été utilisée avec succès comme une alternative d’imagerie à haute résolution, en temps réel, non invasive pour évaluer la fonction cardiaque des poissons zèbres adultes9,10,11,12,13,14,15.
Chez les poissons zèbres, le cœur est situé ventrally dans la cavité thoracique immédiatement postérieure aux branchies avec l’atrium situé dorsale au ventricule. L’atrium recueille le sang veineux du sinus venosus et le transfère au ventricule où il est ensuite pompé au bulbus artériiosus(figure 1). Ici, nous décrivons un protocole physiologique, sous-marin, pour évaluer la fonction cardiaque chez le poisson zèbre adulte par échocardiographie non invasive à l’aide d’une sonde à ultrasons de tableau linéaire avec une fréquence centrale de 50 MHz pour l’imagerie en mode B à une résolution de 30 m. Étant donné que les ondes ultrasons peuvent facilement se déplacer dans l’eau, le maintien de la proximité entre le poisson et la sonde de balayage sous-marine fournit suffisamment de surface de contact pour la détection cardiaque sans besoin de gel ultrason et est globalement moins stressant pour le poisson. Bien que les systèmes alternatifs d’échocardiographie de poisson zèbre aient été rapportés par plusieurs auteurs9,12,13, ici nous présentons la configuration générale et la plus couramment utilisée qui s’applique à l’ultrason de haute fréquence chez les animaux.
La méthode permet l’imagerie à haute résolution du cœur adulte du poisson zèbre, le traçage des structures cardiaques, et la quantification des vitesses de pointe des mesures de flux sanguin Doppler. Nous montrons la quantification in vivo fiable des paramètres systoliques et diastoliques importants, tels que la fraction d’éjection (EF), le changement fractionnel de secteur (FAC), l’afflux de sang ventriculaire et les vitesses d’écoulement, la fréquence cardiaque (HR), et la sortie cardiaque (CO). Nous contribuons à établir une gamme fiable de paramètres fonctionnels et dimensionnels adultes en bonne santé du poisson zèbre pour permettre une évaluation plus précise des états pathologiques. Dans l’ensemble, nous fournissons une méthode robuste pour évaluer la fonction cardiaque chez le poisson zèbre, qui s’est avéré extrêmement utile dans l’établissement et la validation des modèles de maladies cardiaques du poisson zèbre6,16, les dommages cardiaques et la récupération10,13, et la régénération11,12, et peut être davantage utilisé pour évaluer les médicaments potentiels.
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Protocol
Toutes les procédures concernant le poisson zèbre ont été approuvées par notre Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux et sont conformes à la Loi sur le bien-être des animaux de l’USDA.
1. Mise en place expérimentale
-
Mise en place de la plate-forme d’acquisition d’images
- À l’aide de petits ciseaux ou d’un scalpel, faites une incision sur une éponge à la position de 12 heures pour tenir le poisson pendant la numérisation. Placer l’éponge dans un récipient en verre(figure 2A).
REMARQUE : La position de l’incision devrait permettre suffisamment d’espace pour déplacer le transducteur et aussi pour garder le poisson souffler la ligne d’eau lorsque la plate-forme est inclinée pour le balayage(figure 2). L’incision peut varier en fonction de la taille du poisson; cependant, pour une taille et un poids standard, l’incision doit être d’environ 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (longueur, largeur et profondeur, respectivement). Le récipient en verre doit être d’au moins 6 cm de profondeur pour éviter les fuites d’eau pendant l’imagerie du poisson. - Apposer la boîte en verre contenant l’éponge sur la plate-forme d’ultrason, par exemple à l’aide de ruban adhésif recto-verso. Assurez-vous que la boîte en verre est au centre de la plate-forme et fermement attachée (figure 2B).
- Inclinez la plate-forme vers l’avant vers l’avant à environ 30 degrés à l’aide du bouton sur le côté gauche du support de la plate-forme(figure 2B). Remplissez le carré de verre de 200 à 250 ml d’eau du système de poisson contenant 0,2 mg/mL tricaine méthanesulfonate (MS222).
REMARQUE : Tricaine peut être préparée comme solution de stock de 4 mg/mL dans Tris 40 mM pH 7 et diluée à la concentration désirée dans l’eau du système de poisson ; 0,2 mg/mL s’est avéré être la meilleure concentration16. La solution de stock tricaine de 4 mg/mL peut être stockée pendant une longue période à -20 oC ou à 4 oC pendant un mois. - Insérez le transducteur dans le support de micromanipulateur sur la gare en marche, en tournant l’encoche du transducteur vers l’opérateur. Gardez le tableau parallèle au sol avec le côté de travail longitudinal en ce qui concerne la scène (voir figure 2B). Laissez suffisamment d’espace (10 cm des deux côtés) pour que le système transducer-rail maintenant connecté se déplace le long des x- et y-axes.
- Connectez-vous au logiciel de contrôle et choisissez Mouse (Small) Vascular. Créez une nouvelle étude ainsi qu’une nouvelle série pour chaque animal inclus dans l’étude. Trouvez le nouveau bouton d’étude situé en bas à gauche de l’écran sur la page du navigateur (la vue commence en mode B).
- À l’aide de petits ciseaux ou d’un scalpel, faites une incision sur une éponge à la position de 12 heures pour tenir le poisson pendant la numérisation. Placer l’éponge dans un récipient en verre(figure 2A).
2. Manipulation du poisson
REMARQUE : Le poisson zèbre utilisé dans cette étude était un mâle adulte de 11 mois de la souche de type sauvage AB/Tuebingen (AB/TU). Les poissons zèbres ont été maintenus dans un système d’aquarium autonome à 28 oC dans un cycle de lumière constant réglé comme 14 h de lumière/10 h sombre. Les poissons zèbres étaient nourris deux fois par jour avec des crevettes saumâtres(Artemia nauplii) et des flocons d’aliments secs.
- À l’aide d’un filet à poissons, transférer le poisson dans un petit réservoir contenant de l’eau du système avec 0,2 mg/mL tricaine. Attendez que le poisson soit entièrement anesthésié (pas de mouvement et pas de réponse au toucher).
- À l’aide d’une cuillère à café en plastique, transférer délicatement et rapidement le poisson dans la boîte en verre contenant l’éponge dans l’incision précédemment faite avec le côté ventral du poisson face vers le haut.
REMARQUE : Assurez-vous que la tête du poisson est positionnée vers l’opérateur (même direction que l’encoche du transducteur) et à un niveau légèrement plus élevé que le reste du corps pour obtenir une meilleure visualisation cardiaque. - Abaissez doucement le transducteur (en gardant sa position d’origine) à l’aide de la poignée du système ferroviaire, en le plaçant longitudienment et près du côté ventral du poisson avec l’encoche du transducteur face à l’opérateur. Laisser le dégagement de 2 à 3 mm (pas plus de 1 cm) du poisson. Ajuster la plate-forme en ce qui concerne le transducteur à l’aide du micromanipulateur dans les 3 axes jusqu’à ce que le cœur du poisson soit visualisé, puis commencer l’acquisition d’image. L’angle du transducteur ne doit pas être modifié pendant toute l’acquisition d’image(figure 2C).
REMARQUE : Tant qu’il y a suffisamment de proximité (jusqu’à 1 cm), l’eau au-dessus du poisson fournira une surface de contact par tension de surface liquide qui permet la transmission des ondes échographiques entre la sonde et le poisson. Par conséquent, il n’est pas nécessaire de pousser le transducteur contre le poisson. Essayez de terminer cette étape et terminer l’analyse en moins de 3 minutes pour prévenir la mort des poissons ou une diminution de la fréquence cardiaque lors de l’acquisition d’une image. Si nécessaire, utilisez une minuterie. Le cœur peut être trouvé sur le côté supérieur de l’écran vers le côté gauche de l’œil, qui peut être facilement visualisé si vous déplacez l’axe x tout le chemin vers la droite. S’il y a difficulté à trouver le cœur en mode B, passez au mode Doppler de couleur, ce qui permettra de suivre le flux sanguin (rouge indique que le sang coule vers l’opérateur) et de localiser le cœur.
3. Acquisition d’images
REMARQUE : Voir tableau des matériaux pour le système d’imagerie et le logiciel d’analyse d’images.
- Vue longitudinale B-Mode
- Après avoir localisé le cœur, sélectionnez ou restez en mode B (trouvé en bas à gauche de l’écran tactile après avoir lancé une nouvelle série) et réduisez le champ afin de zoomer et d’examiner de plus près le cœur pour faciliter le traçage pendant l’analyse.
- Afin d’avoir une vue plus étroite et plus claire du cœur dans l’acquisition d’images B-Mode, réduisez le champ en zoomant. Utilisez l’écran tactile pour rétrécir manuellement le champ sur les x- et y-axes.
- Si nécessaire, améliorez la qualité/contraste de l’image en définissant la plage dynamique à 45-50 dB. Rendez-vous aux commandes en mode B dans l’option Plus de contrôles et enregistrez par la suite la modification de Mode Presets. Appuyez sur Mode Presets pour sélectionner le paramètre d’acquisition d’image optimisé à chaque fois avant de commencer à imaginer une nouvelle série.
- Prenez autant d’images que vous le souhaitez dans le plan à long axe en sélectionnant Save Image.
REMARQUE : Des informations et des ressources de formation plus détaillées sur l’acquisition d’images peuvent être trouvées à https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab et https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Vague longitudinale de pulse de vue
- Passez à Color Doppler pour la détection du flux sanguin (sélect bouton couleur) et l’acquisition (trouvé en bas à gauche de l’écran tactile après avoir lancé une nouvelle série).
- À l’aide de l’écran tactile positionner le quadrant au-dessus de la valve atrioventriculaire et de localisé l’afflux, qui se distinguera par le signal de couleur rouge(figure 3A). Réduisez la zone de quadrant autant que possible pour augmenter le taux d’image.
REMARQUE : Abaissez la fréquence de répétition d’impulsions de couleur (color PRF) (plage de vitesse) pour s’assurer que la couleur jaune peut être vue dans le profil de vitesse de l’image de Color Doppler. Cela augmentera la gamme de vitesses qui peuvent être vus et aidera à créer une mosaïque de couleur qui permettra de visualiser plus clairement les vitesses maximales. - Activer l’onde d’impulsion (sélectionner PW) Mode Doppler pour échantillonner la vitesse d’afflux de sang ventriculaire. Placez la porte de volume de l’échantillon au centre de la valve atrioventriculaire (où le signal de couleur rouge devient plus jaunâtre) pour détecter la vitesse maximale d’écoulement. Ajustez l’angle PW sur l’écran à l’aide de vos doigts afin qu’il s’aligne avec la direction de l’afflux de sang. Appuyez sur le démarrage ou la mise à jour pour commencer à échantillonner la vitesse du sang qui coule dans le ventricule.
REMARQUE : Assurez-vous que la ligne correcte de l’angle est parallèle au flux sanguin afin de fournir des résultats cohérents et reproductibles. Placer la ligne correcte de l’angle de sorte qu’il correspond à la direction du flux sanguin s’assurera que les vitesses sont saisies avec précision. - Répétez l’étape 3.2.3 pour déterminer la vitesse de sortie en plaçant le quadrant Color Doppler à la jonction entre le ventricule et le bulbus (valve bulbuventriculaire) et localiser le débit, qui se distinguera par un signal de couleur bleue(figure 3B). Placez la porte de volume de l’échantillon juste avant la jonction ventricule-bulbus et ajustez la ligne de correction d’angle pour correspondre à la direction du flux sanguin.
REMARQUE : Comme mentionné précédemment, pour obtenir des valeurs de vitesse précises, assurez-vous que l’angle DE est aligné avec le flux sanguin. - Ajuster la ligne de base (barre), l’abaisser ou l’élever dans le panneau de vitesse de débit, afin de détecter et de tracer complètement les pics de signal(figure 3C,D). Identifier les pics d’afflux dans le quadrant supérieur/positif (signal allant vers la sonde) et les pics d’écoulement dans le quadrant inférieur/négatif (signal s’éloignant de la sonde).
4. Récupération du poisson
- Dès que l’acquisition d’image est terminée, à l’aide d’une cuillère à café, transférer le poisson dans l’eau aérée système régulière exempt de tricaine et laisser le poisson récupérer (prend généralement 30 s à 2 min pour reprendre le mouvement branchial et la natation).
- Pour aider à la récupération, gicler de l’eau à plusieurs reprises sur les branchies à l’aide d’une pipette de transfert pour favoriser l’aération de l’eau et le transfert d’oxygène.
5. Analyse d’image
- Ouvrez le logiciel d’analyse d’image.
- Sélectionnez une image et cliquez sur l’icône de traitement d’image(figure 4). À l’aide de l’échelle disponible(figure 4), ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour permettre une visualisation claire des parois ventriculaires ou du modèle de flux sanguin.
- À l’aide de l’image en mode B, ouvrez la liste d’abandon de l’option PSLAX (axe long parasternal) sur le paquet/mesures cardiaques(figure 4). Sélectionnez la trace de LV et tracez le mur intérieur ventriculaire à la systole et au diastole pour obtenir la zone ventriculaire (VA) en systole (VA) et en diastole (VAd), fin du volume diastolique (EDV) et volume systolique fin (ESV)(figure 5A,B).
REMARQUE : Les valeurs de volume sont extrapolées à partir de tracés d’images 2D et peuvent s’écarter de l’entité 3D. Pour toutes les mesures, en moyenne au moins 3 cycles cardiaques représentatifs par animal. - Notez le volume de course et la fraction d’éjection qui seront automatiquement calculés et affichés par le logiciel.
REMARQUE : Le volume de l’AVC et la fraction d’éjection peuvent également être calculés manuellement à l’aide des formules
SV ET EDV-ESV
EF (EDV-ESV)/EDV
où le SV est le volume de course, EDV est le volume diastolique fin, ESV est le volume systolique fin, et EF est fraction d’éjection - Calculer le changement de zone fractionnaire à l’aide de la formule
AEC (VAd - VAs)/ VAd
là où l’AEC est un changement de zone fractionnaire, le VAd est une zone ventriculaire dans la diastole, et les VA sont la zone ventriculaire dans la systole. - Calculer la sortie cardiaque à l’aide de la formule
CO et HR x SV
où le CO est la sortie cardiaque, les RH sont la fréquence cardiaque, et SV est volume d’AVC - À l’aide de l’image Pulsed Wave Doppler Mode, mesurez la vitesse du sang d’entrée en sélectionnant l’option MV Flow dans le cadre du paquet cardiaque(figure 4). Sélectionnez E ou A pour la diastole précoce et la diastole tardive, respectivement, et déterminez les vitesses maximales du graphique(figure 3C).
- Mesurer la vitesse du sang sortant en sélectionnant le flux AoV et déterminer les pics sur le tracé(figure 3D).
- Mesurer la fréquence cardiaque à l’aide de 2 méthodologies différentes pour une évaluation plus fiable :
- Lorsque le cœur est visualisé à l’écran lors de l’acquisition d’une image, comptez les battements dans les 10 s et multipliez-le par 6.
- À l’aide de l’image Pulse Wave Doppler sur le logiciel Vevo LAB, choisissez le bouton de fréquence cardiaque et tracez les intervalles entre 3 pics de débit aortique consécutifs(figure 4 et figure 6).
- Pour exporter des données vers une feuille de calcul après avoir tracé le LV et les pics de la circulation sanguine, cliquez sur le rapport 'exportation 'save as 'excel.
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Representative Results
Le protocole décrit permet de mesurer les paramètres cardiaques dimensionnels et fonctionnels importants, analogues à la technique utilisée dans l’échocardiographie humaine et animale. Les images en mode B permettent de retracer la paroi interne ventriculaire dans la systole et la diastole(figure 5) et d’obtenir des données dimensionnelles, telles que les dimensions de la chambre et des murs, et des données fonctionnelles, telles que la fréquence cardiaque, le volume des accidents vasculaires cérébraux et la sortie cardiaque ainsi que les paramètres de la fonction systolique ventriculaire, telles que le changement de zone fractionnaire et la fractionnement de la fractionnement(tableau 1). Les mesures au niveau de la valve atrioventriculaire à l’aide d’images couleur du mode Doppler fournissent également des vitesses d’entrée ventriculaire et de sortie de sang (vitesse à laquelle le sang remplit et sort du ventricule, respectivement) (figure 3 et tableau 1).
Les paramètres obtenus dans cette étude étaient comparables à ceux rapportés dans des études antérieures utilisant des conditions expérimentales similaires6,16,17 ( tableau1), démontrant encore la reproductibilité de la méthode. Dans l’ensemble, nous montrons que l’utilisation de ce protocole détaillé on peut évaluer efficacement et uniformément la fonction cardiaque du poisson zèbre, ce qui est essentiel lors de la comparaison de différents phénotypes cardiaques au cours d’une étude.
Figure 1 : Illustration du coeur adulte de poisson zèbre. La circulation du flux sanguin est représentée par des flèches : le sang s’écoule du sinus venosus vers l’atrium et est transféré au ventricule, où il est pompé au bulbus artériosus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Chambre d’imagerie du poisson. (A) Pour préparer une « chambre » d’imagerie du poisson, une éponge avec une incision vers une extrémité dans une orientation verticale est placée dans un récipient en verre. (B) Le récipient en verre est alors solidement scotché sur la plate-forme d’imagerie inclinée. (C) Le transducteur est monté sur le manipulateur et placé parallèlement à l’incision pour un positionnement d’imagerie correct (l’encoche transducteur pointe vers l’opérateur). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Afflux atrioventriculaire (A) et sortie (B) en mode Color Doppler et Doppler d’onde pulsée correspondant pour évaluer les vitesses des pics diastoliques ventriculaires respectifs (C) et de l’écoulement ventriculaire (D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse d’image. Après le traitement d’image (pour atteindre le contraste désiré et la luminosité de l’image), les mesures peuvent être effectuées dans les images en mode PW Doppler (à gauche) et en mode B (à droite). Pour tracer le mur LV dans l’image en mode B, sélectionnez Le paquet cardiaque dans le menu de décrochage, rendez-vous sur PSLAXet sélectionnez LV Trace. Pour mesurer les vitesses de pointe dans l’image du mode PW Doppler, sélectionnez Paquet cardiaque dans le menu de décrochage. Pour mesurer la vitesse d’afflux de sang ventriculaire, sélectionnez l’option MV Flow et sélectionnez E ou A pour la diastole précoce et la diastole tardive, respectivement. Pour déterminer la vitesse de l’écoulement sanguin, sélectionnez AoV Flow et AV vitesse de pointe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Images en mode B. (A) Image B-Mode du ventricule (V) en diastole, remplie de sang provenant de l’atrium (A). (B) B-Mode image du ventricule dans la systole, éjectant le sang à travers le bulbus artériiosus (B, traçage vert). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Image de Doppler Pulse Wave. Une valeur de fréquence cardiaque peut être générée en traçant 3 pics de débit aortique consécutifs. Les pics de débit aortique peuvent être affichés en sélectionnant le bouton de fréquence cardiaque dans l’onglet mesures dans le logiciel d’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Paramètres, unités et sd | Cette étude | Wang, L. et coll., 2017; Lee, L. et coll., 2016 et Mishra, S. et al, 2019 | Commentaires/Description |
| Fréquence cardiaque (HR), bpm | 133 à 7 | 118 à 14 - 162 à 32 | Animaux et femelles AB/ABTU de type sauvage entre 3 et 12 mois anesthésiés en tricaine 0,2 mg/mL |
| Changement de zone fractionnaire (FAC) | 0,38 à 0,03 | 0,29 à 0,07 - 0,39 à 0,05 | |
| Fraction d’éjection (EF), [%] | 42 à 7 ans | 34 à 0,04 - 48 à 0,03 | |
| Volume d’accidents vasculaires cérébraux (SV), L | 0,21 à 0,01 | 0,18 à 0,06 - 0,28 à 0,08 | |
| Sortie cardiaque (CO), 'L min-1 | 27,3 à 1,69 | 19 9,5 à 36,1 à 7,8 | |
| Vitesse de pointe E (afflux ventriculaire précoce), mm/s | 30 à 6,8 | 25 à 7 - 51 à 16 | |
| Une vitesse maximale (entrée ventriculaire tardive), mm/s | 152 à 32 | 144 à 36 - 288 à 54 | |
| Sortie ventriculaire, mm/s | 86,6 à 19 | n/a |
Tableau 1 : Paramètres échocardiographiques chez les poissons zèbres adultes. Valeurs obtenues pour les paramètres de fonction cardiaque évalués dans l’étude actuelle pour le poisson zèbre mâle ou femelle adulte entre 3 et 12 mois anesthésiés dans une solution de 0,2 mg/mL tricaine. Une gamme des valeurs obtenues pour les mêmes paramètres dans les études précédentes6,16,17 effectuées dans des conditions similaires est présentée pour validation et pour aider à normaliser la méthode.
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Discussion
Nous décrivons une méthode systématique pour l’imagerie échocardiographique et l’évaluation de la fonction cardiaque dans le poisson zèbre adulte. L’échocardiographie est la seule méthode non invasive et la plus robuste disponible pour l’imagerie cardiaque et l’analyse fonctionnelle des poissons adultes vivants, et elle est de plus en plus populaire dans la recherche cardiovasculaire des poissons zèbres. Le temps nécessaire est court et permet des études longitudinales et à haut débit. Cependant, il y a des variations considérables dans la méthodologie utilisée et l’analyse des données. La normalisation de l’échocardiographie des poissons zèbres est très difficile lorsque tant de variables peuvent influencer les paramètres sortants. Lors de la réalisation d’études expérimentales, on devrait tenir compte des conditions qui peuvent produire la variabilité, y compris l’anesthésie, le poids corporel, l’âge, le sexe et la souche de fond. Wang, L et coll.16 ont évalué la variabilité introduite par ces facteurs et compilé les données disponibles sur la fonction cardiaque du poisson zèbre afin d’aider à normaliser la méthode. Leur étude est une ressource très utile pour concevoir des études expérimentales impliquant l’évaluation échocardiographique du poisson zèbre. Sur la base des informations fournies par Wang, L et coll.16 et des références à l’intérieur et nos propres observations6, nous fournissons un aperçu des étapes critiques et des conditions que nous avons jugés importantes pour l’optimisation et la reproductibilité du protocole :
Choix du spécimen: Des études antérieures suggèrent que si les paramètres de fonction systolique (EF, AEC) ne sont pas significativement affectés par les différences entre les sexes, la fonction diastolique (à savoir le rapport onde de pointe E/A) peut être considérablement plus faible chez les femelles âgées de plus de 6 mois. On a également observé que les zones ventriculaires et les volumes augmentent considérablement avec l’âge du poisson (3 mois et plus) et sont considérablement plus élevés chez les femelles en raison de leur poids corporel et de leur taille plus élevés. Indexer les volumes diastoliques à l’indice de masse corporelle (IMC) et à la surface du corps (BSA) peut aider à abolir les différences entre les femelles et les mâles appariés par âge, et l’indexation de l’ASS et du poids peut aider à surmonter les différences de volume diastolique liées à l’âge16. Il y avait également des rapports de différentes fonctions diastoliques entre les poissons avec différentes souches de fond16. Dans l’ensemble, lors du choix de la conception expérimentale, il est conseillé d’utiliser des contrôles adaptés à l’âge et aux souches et d’éviter de mélanger différents sexes. L’utilisation des mâles est recommandée, car la qualité d’image était plus faible chez les femelles gravides.
Position de numérisation: Dans cette configuration, deux positions de numérisation sont possibles : axe longitudinal et axe court. Nous avons constaté qu’en mode axe court, il était très difficile d’identifier les chambres cardiaques. Par conséquent, nous n’avons utilisé que l’axe longitudinal et recommandons ce dernier pour la délimitation des chambres cardiaques en mode B et la dérivation de la taille et de la fonction ventriculaires.
Anesthésie: Une sédation adéquate est essentielle pour éviter une bradycardie importante pendant la mesure. La fréquence cardiaque affectera la mesure fonctionnelle cardiaque, compromettant l’exactitude de l’étude. Tricaine est l’agent anesthésique le plus commun et une dose de 0,2 mg/mL s’est avérée pour fournir la sédation adéquate. Cependant, le temps de mesure est critique puisque la fréquence cardiaque commence à diminuer après 3-4 min sous sédation16. Pour éviter d’introduire la variabilité, il est essentiel de maintenir les mesures sous 3 min.
Paramètres critiques: La fréquence cardiaque peut être considérée comme un paramètre critique lorsqu’elle vise la cohérence et la précision. La fréquence cardiaque devrait être comparable entre les groupes expérimentaux testés et dans la gamme de valeurs indiquées pour les conditions utilisées. Nous avons constaté qu’une gamme de 118 à 14 à 162 - 32 bpm peut représenter les valeurs normales pour le poisson zèbre de type sauvage 3-12 mois vieux adultes anesthésiés avec 0.2mg/mL de tricaine pendant moins de 3 min.
Précision du résultat: Pour assurer la précision, les mesures doivent être prises sur un minimum de 3 cycles cardiaques. Pour obtenir des traces d’images manuelles plus précises, l’analyse doit être effectuée de manière aveuglée.
En plus de choisir les conditions les plus appropriées, plusieurs aspects sont essentiels pour assurer une mesure précise. Idéalement, les conditions devraient être maintenues aussi près que possible de l’état physiologique normal du poisson. L’exécution de l’analyse sous l’eau a l’avantage de maintenir le poisson dans leur environnement naturel et près de la normale pour l’échange de gaz, la composition de l’eau, la pression hydrostatique, et la température. Ce sont des avantages évidents par rapport aux études précédentes, où pendant le poisson de balayage sont placés dans une éponge humide exposée à l’air de pièce et la conductivité est activée par gel ultrason au lieu de l’eau9,10. Le balayage sous-marin permet également la récupération du poisson après la procédure, à condition que le temps entre l’anesthésie et la récupération soit maintenu en dessous de 3 min et que le poisson soit retourné à l’eau de récupération immédiatement après la mesure. Pour s’assurer que la procédure est effectuée aussi rapidement et efficacement que possible, une quantité considérable de temps consacré à la formation est conseillée avant d’effectuer des expériences.
L’échocardiographie est une méthode très bien établie pour évaluer la fonction cardiaque dans la pratique clinique ainsi que dans les modèles animaux murins (ou d’autres mammifères). Cependant, contrairement à l’échocardiographie murine ou humaine, l’exécution d’ultrasons de poisson sous l’eau ne permet pas la connexion du spécimen aux électrodes. Par conséquent, la mesure directe des fréquences cardiaques et respiratoires n’est pas possible. Dans ce cas, la fréquence cardiaque peut être mesurée en comptant les battements par minute dans un intervalle de 10 ou 15 minutes ou en traçant manuellement 3 pics de débit aortique consécutifs(figure 6). La fréquence cardiaque affecte également la détermination d’autres paramètres, tels que la sortie cardiaque, qui doivent être calculés manuellement une fois que des paramètres tels que le volume d’AVC ont été obtenus grâce à la traçage ventriculaire des paroi interne. Un autre aspect à considérer est que la morphologie du cœur de poisson est très différente des mammifères. Dans le cœur de poisson zèbre à deux chambres, le remplissage ventriculaire est principalement déterminé par la contraction auriculaire, et les poissons présentent généralement un rapport de remplissage ventriculaire beaucoup plus bas tôt à tardif par rapport aux mammifères18. Cela explique le profil différent obtenu par l’onde de légumineuses Doppler dans les pics A et E entre le poisson zèbre et les cœurs mammifères sains.
L’échocardiographie permet une caractérisation complète du profil cardiaque du poisson et la quantification de plusieurs paramètres fonctionnels. Les valeurs obtenues pour la fraction éjectable, le changement fractionnel de zone, les vitesses d’afflux de sang et d’écoulement, la fréquence cardiaque, et la sortie cardiaque sont dans la gamme rapportée par des études précédentes (tableau 1), soulignant la reproductibilité de la méthode. Prises ensemble, nos données montrent que l’échocardiographie à haute fréquence par ultrasons est une méthode robuste et reproductible pour mesurer la morphologie et la fonction cardiaques des poissons zèbres lors de l’évaluation des modèles de maladies ou des tests de dépistage de drogues.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le soutien technique et la révision du manuscrit par Fred Roberts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
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