Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי לתייג ולנתח נוירונים באמצע, אשר קריטי להערכת שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובקוצים הדנדריטים שעלולים להיות מומים נוירוכימיקלים והתנהגותיים.
Abstract
דווח כי גודל וצורה של השדרה הדנדריטים קשורה הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם. כדי לזהות את המבנה המיורפולוגי של הנוירונים ושידולי הדנדריטים, ניתן לעשות שימוש בטכניקת תיוג בליסטיים. בפרוטוקול הנוכחי, הנוירונים העצביים מתויגים עם DilC18 (3) לצבוע וניתח באמצעות תוכנת שחזור עצבי להעריך מורפולוגיה עצבית ושפה דנדריטי. כדי לחקור את המבנה העצבי, ניתוח הסתעפות הדנדריטים וניתוח שולבה מבוצעים, ומאפשר לחוקרים לצייר מסקנות על מורכבות הסתעפות הדנדריטים והמורכבות העצבית העצביים, בהתאמה. הערכה של השדרה הדנדריטי מתבצעת באמצעות הסיווג האוטומטי באמצעות אלגוריתם מיון אינטגרלי לתוכנה שחזור, אשר מסווג את הקוצים לתוך ארבע קטגוריות (כלומר, דק, פטריות, שמנה, שמנת, פילפיאה). יתר על כן, שלושה פרמטרים נוספים (כלומר, אורך, ראש קוטר, ונפח) נבחרים גם להעריך שינויים במבנה השדרה הדנדריטי. כדי לאמת את הפוטנציאל של היישום הרחב של טכניקת תיוג בליסטי, הנוירונים בצורה מרחבית מתוך תרבות תא מבחנה בהצלחה מתויג. בסך הכל, שיטת התיוג הבליסטי היא ייחודית ושימושית להמחיש נוירונים באזורי מוח שונים בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת, מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים המשמשים כבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי.
Introduction
בשנת 2000, גן ואח ' תיאר טכניקת תיוג מהירה לנוירונים בודדים ולגליה במערכת העצבים שבשילוב צבעי ליפוליים שונים, ומאפשר תיוג סימולטני של תאי מוח רבים בצבעים שונים1,2. לאחרונה, טכניקת תיוג בליסטי תוארה על ידי סיאולד ואח '3 שהוצגו צבעי פלורסנט (דיל) לתוך הנוירונים של פרוסות המוח. טכניקה מכתימה רב-תכליתי, תיוג בליסטי הוא מוערך על יכולתה להיות מנוצל במינים רבים בעלי חיים ולאורך מגוון רחב של גילאים. יתר על כן, זה יכול להיות משולב עם כתמים חיסוני לזהות אוכלוסיות משנה של תאי המוח3. לעומת טכניקות מסורתיות (למשל, Golgi-קוקס כסף הספגה, microinjection)4, תיוג בליסטי מעניקה הזדמנות להבדיל באופן ברור יותר מאפיינים מורפולוגיים, כולל השדרה הדנדריטי, תכונה קריטית לציור מסקנות על מורכבות עצבית וקישוריות סינפטית5.
מרגש הנוירונים מתאפיין באחד, דנדריטים הרשמי הגדול, מספר דנדטים בסיס קצר, ואלפי שובך הדנדריטים6. הנוירונים האלה מצויים באזורי המוח המרובים הקשורים לעיבוד קוגניטיבי גבוה יותר, כולל קליפת ראש הדור הקדמי (טוראי ראשון) ו ההיפוקמפוס. בטוראי הראשון, הנוירונים באמצע המבנה מתבוננים בשכבות II/III ושכבה V, כאשר כל אחד מהם מציג מורפולוגיה ייחודית. במיוחד, הנוירונים באמצע שכבה II/III של הטוראי הראשון יש הדנדריטים פסגה קצר יותר ופחות הסתעפות מאשר הנוירונים באמצע השכבה V6. בתוך ההיפוקמפוס, הנוירונים באמצע הפירמידה ממוקמים הן באזורים CA1 ו CA3, עם כל הצגת מורפולוגיות נפרדות. באופן ספציפי, הנוירונים באזור CA1 מוצג הדנדריטים הרשמי הייחודי יותר, עם הסתעפות המתרחשים רחוק יותר הסומה, ביחס לאזור CA36.
הדנדריטים הדנדריטי על הנוירונים באמצע הפירמידה הן הראשון ההיפוקמפוס הם האתר העיקרי של סינפסות מרגש7. מאפיינים מורפולוגיים של שתדלתיים דנדריטים, אשר מאופיינים באופן קלאסי לתוך שלוש קטגוריות ראשיות (כלומר, דק, קלוש, או פטריות8), היו קשורים בגודל של הרגש סינפסה9. השדרה הדק, המאופיינת בצוואר ארוך, דק, ראש בולבוסי קטן, וצפיפות הפוסט-סינפטית הקטנה יותר, אינם יציבים יותר ומפתחים התקשרויות חלשות יותר. עם זאת, שדרה פטריות, אשר יש ראש השדרה הדנדריטי גדול יותר, מוכרים ליצירת קשרים סינפטית חזקים יותר, אפקט כתוצאה מהגודל הגדול שלהם. בניגוד חד, שדרה שולי הוא נטול צוואר עמוד השדרה, המציגות יחס שווה ערך ראש וצוואר שווים8. בתוך ההיפוקמפוס, שדרה הסתעפות יכול להיות גם נצפתה, לפיה עמוד השדרה יש ראשים מרובים היוצאים מן הצוואר הדנדריטי זהה10. לכן, השינויים הורפולוגיים של הקוצים הדנדריטים יכולים לשקף פונקציונליות וקיבולת מבנית. יתר על כן, מחקרים הוכיחו כי הגודל והצורה של השדרה הדנדריטי מתייחס הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם, המוביל את הרעיון כי הקוצים הקטנים מעורבים בלמידה ובתשומת לב, בעוד שבעמודי השדרה הגדולים והיציבים יותר, מעורבים בתהליכים ארוכי טווח, כולל זיכרון11. בנוסף, הפצת הקוצים הדנדריטים לאורך הדנדריטים עשויה להיות קשורה לקישוריות סינפטית5,12.
לפיכך, הנייר המתודולוגי הנוכחי כולל שלוש מטרות: 1) הצגת הפרוטוקול שלנו עבור תיוג בליסטי, אשר כבר מנוצל עם שיעור הצלחה (כלומר, הנוירונים לפגוש קריטריונים הבחירה מתאים לניתוח) של 83.3%5,12,13 וברחבי מחוזות המוח מרובים (כלומר, טוראי ראשון, 2) להפגין את היכולת הגנריות של הטכניקה ואת יישומו לנוירונים שגדלו בתוך מבחנה; 3) פירוט המתודולוגיה הנמצאת בשימוש בתוכנת שחזור עצבית ומסקנות שניתן לשאוב מנתונים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הביטחון הפדרלי: D16-00028).
1. הכנת אבובים דיאני/טונגסטן חרוז
- לפזר 100 מ"ג של polyvinylפירוסיים (PVP) עם 10 מ ל של ddH2O. מערבולת פתרון PVP בקלילות.
- ממלאים את אבובים עם פתרון PVP (ראה טבלת חומרים) ולהשאיר אותו 20 דקות. לאחר מכן, לגרש את פתרון PVP דרך הקצה השני של אבובים באמצעות מזרק 10 mL.
- שילוב 170 מ"ג של חרוזים מיקרומוביל טונגסטן עם 250 μL של מתילן כלוריד. וורטקס ההשעיה של טונגסטן חרוז ביסודיות.
- לשלב 6 מ ג של ליפופילית DilC18 (3) לצבוע עם 300 μL של מתילן כלוריד. מערבולת the DilC18 (3) הפתרון לצבוע ביסודיות.
הערה: בצע את שלבים 1.3 – 1.4 בתוך מכסה. - פיפטה 250 μL של ההשעיה של טונגסטן חרוז על שקופית זכוכית. לחכות ההשעיה לאוויר יבש (~ 3 דקות).
- הוסף 300 μL של DilC18 (3) לצבוע פתרון על גבי שכבת ההשעיה של חרוז טונגסטן. מערבבים את DiIC18 (3) לצבוע את הפתרון ואת חרוז טונגסטן ההשעיה ביסודיות עם טיפ פיפטה ולאפשר את התערובת לאוויר יבש (~ 3 דקות).
- לאחר ייבוש, להשתמש להב גילוח כדי לפצל את התערובת לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 mL. ממלאים את הצינורות במים.
- Sonicate באמבט מים (Amp I, 100%) עד הומוגנית (~ 5 דקות). ודא כי קצה הsonicator שוכנת ישירות על הצינורות עם ההשעיה חרוז.
- לשלב את שני 1.5 mL של תערובת הומוגניים לתוך צינור 15 מ"ל. Sonicate התערובת לעוד 3 דקות.
- לצייר את חרוזי טונגסטן-DilC18 (3) לצבוע את התערובת לתוך הצינורות PVP מצופה באמצעות מזרק 10 mL. האכילו את האבובים בתחנת ההכנה (ראו טבלת חומרים).
- סובב למשך 1 דקות בתחנת ההכנה. הסר בזהירות את כל המים מן האבובים באמצעות מזרק 10 מ"ל.
- הפעל את הגז חנקן ולהתאים את זרימת החנקן ל כ 0.5 ליטר לדקה (LPM), לסובב את אבובים בתחנת ההכנה, ויבש עם חנקן עבור 30 דקות.
- הסר את אבובים מתחנת ההכנה וחותכים לאורך 13 מ"מ (התאמת גודל הטעינה של המחסנית) באמצעות חותך אבובים. שמרו על אורך 13 מ"מ בתוך החושך בבקבוקונים.
2. הכנת חתכי מוח
הערה: למבוגרים גברים F344/N חולדות היו זוג שוכנו בסביבה מבוקרת תחת האור 12/12: מחזור כהה עם גישה מודעת המודעה למזון ומים. כל בעלי החיים טיפלו בהנחיות שנקבעו על ידי המכון הלאומי לבריאות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
- עכברים מאוד מורדם. משתמשים ב -5% בלבד
- המשך לשלב הבא כאשר החולדות לא מגיבים רעילים גירויים ורפלקסים נעדרים.
- אבטחו את החולדה בתנוחה. בתוך מכסה המנוע הכימי
- לעשות חתך דרך העור לאורך קו האמצע של החזה. הפרידו את הסרעפת ופתחו את החזה במספריים. הכנס מחט של 20 גרם 25 מ"מ לחדר השמאלי.
- חותכים מיד את האטריום הימני עם מספריים. מבשם 50 mL של 100 mM PBS עם 5 מ ל/מינימום של קצב זרימה. מבשם 100 mL של 4% פאראפורמלדהיד באגירה ב 100 mM PBS.
- להסיר את כל מוח החולדה מיד לאחר הפרזיה.
- Postfix את כל המוח במשך 10 דקות עם 4% פאראמפורמלדהיד.
הערה: אל postfix 4% פאראפורמלדהיד עבור יותר מ 30 דקות, כי זה ישפיע על תיוג. - גזור 500 יקרומטר סעיפים ילתית עבה באמצעות מטריצה המוח חולדה (ראה טבלת חומרים). תעשה את החיתוך הראשון. ותשאיר את הלהב במקומו לעשות לחתוך השני באמצעות להב השני ולהסיר אנכית את הלהב הראשון, שמירה על הרקמה על פני הלהב.
- מניחים את פרוסות המוח בצלחת 24 שעות עם 1 מ מ של 100 mM PBS בכל טוב. חזור על תהליך זה עד לגזירה של כל הפרוסות.
3. תיוג והדמיה בליסטיים של סעיפים במוח
- הסר את הערוץ הPBS מכל. מטרה ממוקדת
- לטעון את מחסנית עם פיסת DiI/בחרוזים טונגסטן חרוז ולמקם אותו לתוך המוליך.
- שימו פיסת נייר סינון בין שני מסכי רשת שינוי. . חברו את המוליך לצינור ההליום להתאים את הלחץ הפלט של הליום כדי 90 לירות לאינץ ' מרובע (psi).
- מניחים את המוליך אנכית ביד על מרכז הבאר המיועד במרחק של 1.5 ס מ בין המדגם לבין מסך רשת השינוי. אש צינורות DiI/טונגסטן.
הערה: הקפידו להסיר את כל ה-PBS מבארות היעד לפני הירי. - טען את מחסנית עם אבובים DiI/טונגסטן הבא. ברציפות לירות את החרוזים DiI/טונגסטן מן אבובים על הפרוסות הנותרות.
- למלא את הצלחת 24 עם 100 מ"מ של PBS. לשטוף עם 500 μL של טריים 100 mM של PBS 3x. אל תתנו הפרוסות להתהפך בזמן הכביסה עם PBS.
- הוסף 500 μL של טרי 100 mM PBS ולשמור את הפרוסות ב 4 ° c בחושך במשך 3 h.
- העבר את פרוסות המוח לתוך שקופיות זכוכית באמצעות מברשת עדינה.
הערה: ניתן להעביר שלושה מקטעי מוח על כל מגלשת זכוכית. - הוסף מיד 1 מ ל של מדיום הרכבה אנטי לדעוך על כל מקטע. מניחים החלקה 22 מ"מ x 50 מ"מ שמיכות על מקטעי המוח. מייבשים את מגלשות הזכוכית בחשכה במשך יומיים.
- הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונקטיבית ועבור למטרה 60 ×.
- הגדר את מערכת המיקרוסקופ קונפוקלית וקד כדי להיות הגדלה של 60 × (a/1.4, שמן) ו-Z מטוס מרווח של 0.15 יקרומטר (גודל חריר 30 יקרומטר, חזרה מוקרן ברדיוס חריר 167 nm). השתמש באורך הגל 543 ננומטר כדי להשיג תמונות של נוירונים בעלי עניין.
- להשיג Z-מחסנית תמונות עבור הסוג המיועד תא העצב מבוסס על גבולות אזור המוח מאפיינים מורפולוגיים של נוירונים.
הערה: לרכוש לפחות שלוש תמונות המבצע כל חיה.
4. שימוש במתודולוגיה עם תרבית תאים
- לבודד נוירונים בקליפת הבית העיקרי מ F344/N חולדות ביום לפני הלידה אחד באמצעות מתודולוגיה שדווחה בעבר14.
- תרבות בקליפת העצב הראשי בצלחת 35 מ"מ זכוכית בתחתית לשבוע אחד. לשנות את מחצית מדיום התרבות עם מדיום צמיחה תא העצב החדש ביום שלישי לאחר בידוד. לשטוף את הזכוכית התחתונה צלחת 2x עם 1 מ מ של 100 mM PBS.
- תקן עם 4% פאראפורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 3.2 – 3.6 כדי לתייג את התאים באופן הוליסטי.
- לשטוף עם 1 מ ל של 100 mM PBS 3x. הוסף 500 μL של טרי 100 mM של PBS ולשמור אותו ב 4 ° c בחושך במשך 3 h.
- הוסף 200 μL של מדיום הרכבה antifade.
- להשיג תמונות Z-מחסנית עבור כל תא מטרה ממוקד באמצעות הפרמטרים בשלב 3.10.
5. ניתוח עצבי וכימות עמוד השדרה הדנדריטי
- נוירונים עיוורים באמצעות מספרי קוד כדי למנוע הטיית ניסויים.
- הקמת קריטריוני בחירה לנוירונים בהתבסס על אזור המוח של עניין.
הערה: קריטריוני הבחירה של הנוירונים כוללים כתמים דנדריטי רציף, רקע נמוך, אין אשכולות צבע בתוך התאים, דיפוזיה מינימלית של הצבע DiI לתוך החלל החילוץ, המבנה הנכון של הנוירונים באמצע (איור 1). - פתח תוכנת שחזור עצבית (ראה את הסרטוןהמצורף 1).
- טען קובץ תמונה על-ידי לחיצה על התמונה "תיקיית קבצים" בפינה השמאלית העליונה.
- לחץ "סומה" ולסמן את הסומה של הנוירונים על התמונה.
- לחץ על "עץ" ובחר "מונחה משתמש".
- עקוב אחר כל הענפים הדנדריטים של עניין.
הערה: בשביל הנוירונים האלה, אשר מאופיינים על ידי אחד הדנדריטים הרשמי ומספר הדנדריטים בזיאר, רק הדנדריטים הרשמי מאותר. ודא שכל הענפים המחוברים מחוברים זה לזה. - לחץ על "עמודהשדרה".
- הגדרת פרמטרי זיהוי ולחץ על "זיהוי הכל".
הערה: עבור פרוסות מוח, הפרמטרים העקביים מנוצלים לרוחב אזורי המוח הם: 2.0 (טווח חיצוני), 0.3 (גובה מינימלי), 100% (רגישות לגלאי) ו-10 (מינימום הספירה). עבור תרבות התא, יש צורך להגדיל את רגישות הגלאי ולהקטין את הספירה המינימלית. - סווג את הקוצים על ידי בחירת "סיווג הכל".
הערה: השדרה הדנדריטית מסווגת באמצעות אלגוריתם אינטגרלי לתוכנת השחזור העצבית15. - שמור מעקב על-ידי בחירת תמונת הדיסק בפינה השמאלית העליונה.
- לבצע ניתוחים עצביים והדנדריטים שדרה מורפולוגית.
- פתח תוכנה לניתוח כמותי שחזור עצבי (ראה וידאומצורף 2).
- טען תמונה על ידי לחיצה על "קובץ" ו-"פתיחת קובץ נתונים".
- לחץ על "ניתוח" ו-"ניתוח מבנה מסועף" כדי לנתח מורפולוגיה עצבית ומורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי.
- עבור מורפולוגיה עצבית, לחץ על "סכומי עץ" ובחר את התיבה עבור "כוללות דנדט".
- למבנה השדרה הדנדריטי, לחץעל "שדרה"ולאחר מכן בחר את התיבה עבור "פרטי עמוד השדרה".
- שמור פלט כקובץ טקסט (. txt) על-ידי לחיצה ימנית על טבלת הפלט ובחירה באפשרות "שמור לקובץ".
- לחץ על "לנתח" ו-"ניתוח שולבה".
- הגדר את הרדיוס ההתחלתי ל-10 יקרומטר ואת התוספת הקבועה ל-10 יקרומטר.
- לחץ על התיבה "דנדריטים" ולחץ על "הצג".
- שמור פלט כקובץ טקסט (. txt) על-ידי לחיצה ימנית על טבלת הפלט ובחירה באפשרות "שמור לקובץ".
6. ניתוח נתונים
- לנתח את המבנה העצבי (כלומר, מורכבות הסתעפות הדנדריטים) נתונים.
- הוסף את מספר הדנדריטים בכל הזמנה בסניף וחלק במספר הכולל של הדנדריטים. הכפל ב-100 כדי לחשב את התדרים היחסיים עבור מספר הדנדריטים בכל הזמנה בענף.
- ניתוח נתוני האנליזה של השולל כדי לבחון את המורכבות העצבית והקישוריות לעמוד השדרה הדנדריטי.
- חישוב ממוצע השגיאה והתקן של הממוצע עבור מספר הצמתים בכל רדיוס.
- סכם את מספר שדרה התלוי בסוג עמוד השדרה (כלומר, דק, שבור, גדול) בכל רדיוס וחילוק לפי המספר הכולל של שדרה לסוג זה של עמוד השדרה. הכפל ב-100 כדי לחשב את התדרים היחסיים עבור מספר השדרה בכל רדיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באיור 2A, את הנוירונים טיפוסי הפירמידה באזור ההיפוקמאל בסעיפים המוח חולדה זוהו על ידי הטכנולוגיה תיוג בליסטי, המאופיינת על ידי אחד גדול הדנדריטים הדנדריטים ומספר דנדטים בסיס קטן יותר סביב סומה. איור 2B מראה את העצב בתוך התוכנה ניתוח כמותי שחזור נוירואליות לאחר התגלתה הסומה, הענפים הדנדריטים היו מעוקבים, ושלוחות השדרה זוהו. לאחר מכן, הנתונים נותחו באמצעות תוכנה לניתוח כמותי שחזור עצבי, אשר סיפקה הזדמנות להעריך את מורכבות הסתעפות הדנדריטים (איור 2C) ומורכבותהעמדית (איור 2c).
באיור 2C, אנו משתמשים בשיטת הזמנת הענף הצנטריפוגלי, שנאספה מתפוקת "סכומי העצים", כדי לספור את מספר הקטעים שעברו לאורך כל הדנדריטים והוקצו צו הסתעפות. התדירות היחסית של המקטעים בכל אחד מהסניפים נבדקה להזמנות בענף 1 – 15. כאשר משמרות בהפצת ענפים דנדריטים נצפו בין קבוצות, שינויים במורכבות הסתעפות דנדריטים יכול להיות משתמעת. יתר על כן, ניתוח שולבה נערך כמדד משלים של המורכבות העצבית העצביים, לפיו מספר צמתים הדנדריטים המתרחשים כל 10 יקרומטר מן הסומה היה כימות בכל מקטע לדוגמה (איור 2d). כאשר משמרות במספר הצמתים הדנדריטים נצפו בין קבוצות, שינויים במורכבות ארבור העצביים יכול להיות משתמעת.
שינויים מורפולוגיים בשדרה הדנדריטי יכול להיות מוערך באמצעות אורך (μm), קוטר ראש (μm), ונפח (μm3), כפי שניתן לראות באיור 3a–B. יתר על כן, הקוצים סווגו באמצעות מערכת הסיווג האוטומטי בתוכנת השחזור העצבית. התדירות היחסית של מספר הקוצים בין כל רדיוס נבדקה לקוצים דקים, פטריות ושולי מעבות. בהתחשב ההבנה שלנו איזה סוגי עמוד השדרה ליצור קשרים הסינפטית חזקה יותר (כלומר, פטריות ביחס לעבות) ומעצבי הנוירוטרנסמיטור, משמרות בחלוקת שדרה לאורך העצב יכול להצביע על קישוריות סינפטית.
יתרה מזו, אנו מאומתים את השירות של טכניקת התיוג הבליסטי על תא העצב העיקרי בתרבות התא. ראשית, אנו מתורבתים נוירונים היפוקמאל העיקרי בפוסט לידה D1 (יום 1) על צלחת תרבות התא מצופה פולי-L-ליזין עבור 2 שבועות או עד כ 70% השטף. לאחר מכן, הדגימות תוקנו ב-4% בכיוון הערוץ עבור 15 דקות ושטף 2x עם PBS. החל בשלב 3.1 של הפרוטוקול הנוכחי, אנו באמצעות התווית והתמונות הנוירונים העיקרי הפירמידה מן ההיפוקמפוס. הנתונים הראו תיוג מיוצב וזיהה נוירונים בעלי מידות מבוסס על הצורה המשולש של משולש הסומה ואת הדנדט הגדול (איור 4A). הניצול של תוכנת שחזור עצבי לחקור את הקוצים הדנדריטים של הנוירונים הראשי הפירמידה גדל בתרבות התא מציע הזדמנויות דומות לאלה במוח העכברוש. תוצאות דוגמה מומחשות עבור התפלגות של שדרה הדנדריטים דק (איור 4b) ואת אורך השדרה הדנדריטי נמדד יקרומטר (איור 4b). עם זאת, ראוי לציין כי את הנוירונים העיקרי הפירמידה גדל בתרבות התא היה הסתעפות הדנדריטים פחות, מנעה את ההערכה, לפחות בדוגמה זו, של מורכבות הסתעפות הדנדריטים וסיבוכיות המורכבות העצבית.
איור 1: קריטריוני בחירה הנמצאים בשימוש עבור נוירונים מיניים בקליפת המוח הקדמית המדינטלית הנקראת באמצעות טכנולוגיית תיוג בליסטיים. (א) דמות מייצגת ייצוגית (60x) של תא עצב בעל תווית היטב, מקליפת המוח הקדם-קדמית המדיקלית. תא העצב בודד הפירמידה עם הסומה ברורה ואת הדנדריטים הרשמי כללה רציפה, כתמים דנדריטי בהיר עם רקע נמוך. (ב–ג) דמות מייצגת ייצוגית (60x) של תא עצב מרובע מקליפת המוח הפרונטלית המדיקלית, בעלת כתמים בהירים בענפים היותר מיניים (B) וברקע גבוה (C). (ד) דמות מרכזת מייצגת (60x) של תא עצב בעלת תווית מקליפת המוח הקדמית המדיקלית (המבוססת על קואורדינטות bregma) בעלת מאפיינים פגומים מורפולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התיוג של הנוירונים במרכז ההיפוקמפוס (היפ) באמצעות טכנולוגיית תיוג בליסטיים והערכות נוירואנטומיים. (א) שלושה מייצגים של דמויות מייצגות (60x) של נוירונים בליסטיים המתויגים על ידי חרוזי טונגסטן בליסטים. (ב) הערכה של מורפולוגיה עצבית: ניתוח הזמנת הסניפים הדנדריטי וניתוח שולבה. התמונה מעקב של עמוד השדרה הדנדריטי שבו מורפולוגיה עמוד השדרה זוהה גם באמצעות תוכנת ניתוח השדרה הדנדריטי. (ג) מנתח הזמנות מנוצל כדי לבחון את התדירות היחסית של ענפים דנדריטים בהזמנות שונות בענף. (ד) המספרים של צמתים דנדריטים כל 10 יקרומטר מתוך הסומה העריכו באמצעות ניתוח שולבה כמדד של המורכבות העצבי ארבור. נתונים מתוארים כתדרים יחסיים של קבוצת הנתונים כולה (C) או התאמה עם 95% מרווחי האמון (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. הערכה של מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי. (א–ב) הפצת שדרה דנדריטי מומחש כפונקציה של סוג עמוד השדרה (כלומר, דק, שחור, פטריה). עוד פרמטרים דנדריטים השדרה נותחו גם (כלומר, אורך, נפח, בקוטר הראש) כהערכה של המבנה השדרה הדנדריטי. נתונים מאוירים כתדרים יחסיים של ערכת הנתונים כולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. . באמצעות טכנולוגיית תיוג בליסטיים (א) דמויות מרכזיות מייצגות (60x) של נוירונים בקליפת המוח הראשי המסומנים על ידי חרוזי טונגסטן בליסטיים בפריפרייה. דוגמאות לדוגמה הדומות לאלה שנרכשו מתיוג בליסטי בפרוסות מוח מוצגות לצורך הפצת שוחות השדרה הדנדריטים הדקים (B) ואורך (C). נתונים מאוירים כתדרים יחסיים של ערכת הנתונים כולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הליכים של מעקב עצבי וזיהוי עמוד השדרה הדנדריטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 2: הליכי איסוף והפקת נתונים לניתוח כמותי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקת תיוג רב-תכליתי עבור נוירונים ממוח החולדה ואלה שגדלו בתוך מבחנה. יתרה מזאת, אנו מדווחים על המתודולוגיה לניצול תוכנת שחזור עצבית ושחזור עצבי כמותי להערכת המבנה העצבי והשדרה הדנדלית. הערכה של מורפולוגיה עצבית ושדרה דנדריטי מספק הזדמנות לקבוע שינויים במורכבות הסתעפות הדנדריטים, המורכבות העצבית, המבנה של השדרה הדנדריטי, וקישוריות סינפטית.
בעת ניהול הפרוטוקול, החוקרים צריכים להקדיש תשומת לב מיוחדת לכמה צעדים. ראשית, לאחר התיקון ב 4% בליגה במשך זמן רב מדי יפגע בשלמות קרום ליפופילית ולגרום לצבוע לדלוף מחוץ לתאים. שנית, לעומת הספציפיות של תיוג בליסטי בפרוסות המוח, אשר מטרות רק נוירונים, התיוג של נוירונים בליסטיים הראשי בתוך מבחנה מציג תיוג לא ספציפי של גליה כי תיוג בליסטי בפרוסות מוח הוא לא ספציפי עבור סוג של תא העצב (כלומר, תא העצב בצורת מסלול, תא מדיום קוצני, התא גרגר עושה). לפיכך, קואורדינטות Bregma, הערכות מורפולוגיות, או סמני תאים ספציפיים צריכים להיות משולבים עם שיטת תיוג בליסטי. שלישית, עובי פרוסות המוח יכול להיות בין 200 – 500 μm; לקבלת התוצאות הטובות ביותר היא צריכה להיות ממוטבת. רביעית, היעילות של תיוג וחדירה לצבוע קשורה לגורמים רבים, כגון לחץ הליום, מספר פעמים לאחר יישום בליסטי, חרוזי DiI/טונגסטן, המרחק בין מסך רשת השינוי והמשטח של פרוסות המוח, וכו '. הפרוטוקול צריך להיות מותאם עבור כל מחקר. החמישית, גושים גדולים או אשכולות לצבוע בליסטי מצופה חרוזים טונגסטן במהלך ההכנה יש להימנע, כי האשכולות לא יאפשרו נוירונים בודדים להיות מכובד. קבענו גם כי DiI מפזרת ברחבי נוירונים בודדים יותר לחלוטין מ-DiO במתודולוגיה זו בליסטית.
אף על פי כן, בהשוואה לשיטות תיוג מסורתיות4, טכניקת תיוג בליסטי עושה הדמיה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית וקד אפשרי, המאפשר הערכה של מורפולוגיה עצביים והשדרה הדנדריטית. יתר על כן, תוכנת שחזור עצבי מנצל אלגוריתם לסיווג אוטומטי בסיוע של שתדלבי הדנדריטים (כלומר, דק, פטריות, שולי), הזמנת מדידות הענף, ניתוח שולבה הקלאסית, ומדידה של תכונות מורפולוגיים של השדרה הדנדריטים, כגון אורך (μm), קוטר ראש (μm), ונפח (μ כדי להבין טוב יותר את המנגנונים. שבבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי
בסך הכל, שיטת תיוג בליסטי מאפשר ויזואליזציה של מבנים עצביים באזורים המוח השונים של החולדה בתרבות התא, אשר חשוב להבהיר את המנגנונים האפשריים בבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי. במחקר הנוכחי, אנו מציגים שיטה לתייג את הנוירונים בצורת מידאל על ידי טכניקת תיוג בליסטי. יתר על כן, בשילוב עם תוכנת שחזור עצבית, הדגמנו את היכולת לבחון את המבנה של עמוד השדרה והדנדריטי הדנדריטים בנוירונים היפוקמאל. הבדלים קבוצתיים במבנה שדרה מעצבי ו/או הדנדריטי מספקים הזדמנות להבין את המנגנונים שבבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהמחברים אין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
