Summary
We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.
Abstract
Er is gemeld dat de grootte en vorm van dendritische stekels is gerelateerd aan hun structurele plasticiteit. Om de morfologische structuur van piramidale neuronen en dendritische stekels te identificeren, kan een ballistische etiketteringstechniek worden gebruikt. In het huidige protocol worden piramidale neuronen gelabeld met DilC18(3) kleurstof en geanalyseerd met behulp van neuronale reconstructie software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. Om neuronale structuur te onderzoeken, worden dendritische vertakkingsanalyse en Sholl-analyse uitgevoerd, waardoor onderzoekers conclusies kunnen trekken over respectievelijk dendritische vertakkingcomplexiteit en neuronale arbor-complexiteit. De evaluatie van dendritische stekels wordt uitgevoerd met behulp van een automatische ondersteunde classificatie algoritme integraal onderdeel van de reconstructie software, die stekels ingedeeld in vier categorieën (dat wil zeggen, dun, paddestoel, stompe, filopodia). Bovendien worden ook drie extra parameters (d.w.z. lengte, hoofddiameter en volume) gekozen om veranderingen in de dendritische wervelkolommorfologie te beoordelen. Om het potentieel van brede toepassing van de ballistische etiketteringstechniek te valideren, werden piramidale neuronen uit in vitro celkweek met succes gelabeld. Over het algemeen is de ballistische etiketteringsmethode uniek en nuttig voor het visualiseren van neuronen in verschillende hersengebieden bij ratten, die in combinatie met geavanceerde reconstructiesoftware onderzoekers in staat stelt om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen te verduidelijken neurocognitieve disfunctie.
Introduction
In 2000, Gan et al. beschreven een snelle etikettering techniek voor individuele neuronen en glia in het zenuwstelsel dat verschillende lipofiele kleurstoffen gecombineerd, waardoor voor de gelijktijdige etikettering van vele hersencellen met verschillende kleuren1,2. Meer recent, een ballistische etikettering techniek werd beschreven door Seabold et al.3 dat fluorescerende kleurstoffen (Dil) geïntroduceerd in de neuronen van de hersenen plakjes. Een veelzijdige kleuring techniek, ballistische etikettering wordt gewaardeerd om zijn vermogen om te worden gebruikt in meerdere diersoorten en over een breed scala van leeftijden. Bovendien kan het worden gecombineerd met immunokleuring om subpopulaties van hersencellen te identificeren3. In vergelijking met traditionele technieken (bijvoorbeeld Golgi-Cox zilverimpregnatie, micro-injectie)4biedt ballistische etikettering een mogelijkheid om morfologische kenmerken duidelijker te onderscheiden, waaronder dendritische stekels, een functie die van cruciaal belang is voor het tekenen van conclusies over neuronale complexiteit en synaptische connectiviteit5.
Excitatory piramidale neuronen worden gekenmerkt door een enkele, grote apicale dendriet, meerdere kortere basale dendrieten, en duizenden dendritische stekels6. Piramidale neuronen worden gevonden in meerdere hersengebieden in verband met hogere orde cognitieve verwerking, met inbegrip van de prefrontale cortex (PFC) en hippocampus. In de PFC worden piramidale neuronen waargenomen in lagen II/III en laag V, waarbij elk unieke morfologie vertoont. In het bijzonder, piramidale neuronen in laag II/III van de PFC hebben een kortere apicale dendriet en minder vertakking dan piramidale neuronen in laag V6. Binnen de hippocampus bevinden zich piramidale neuronen in zowel de CA1- als de CA3-regio's, waarbij elk verschillende morfologieën wordt weergegeven. In het bijzonder vertonen piramidale neuronen in de CA1-regio een meer onderscheidend apicale dendriet, waarbij vertakkingen verder van het soma plaatsvinden, ten opzichte van de CA3-regio6.
Dendritische stekels op piramidale neuronen in zowel de PFC en hippocampus zijn de primaire plaats van excitatory synapsen7. Morfologische kenmerken van dendritische stekels, die klassiek zijn gekarakteriseerd in drie primaire categorieën (d.w.z. dun, stomp, of paddestoel8),zijn gerelateerd aan de grootte van de excitatory synaps9. Dunne stekels, gekenmerkt door een lange, dunne nek, kleine bolvormige hoofd, en kleinere postsynaptische dichtheden, zijn meer onstabiel en ontwikkelen zwakkere verbindingen. Echter, paddestoel stekels, die een grotere dendritische wervelkolom hoofd hebben, worden erkend voor het vormen van sterkere synaptische verbindingen, een effect als gevolg van hun grotere omvang. In scherp contrast, stompe stekels zijn verstoken van een wervelkolom nek, vertonen een ongeveer gelijke hoofd en nek volume verhouding8. Binnen de hippocampus kunnen ook vertakte stekels worden waargenomen, waarbij de wervelkolom meerdere hoofden heeft die uit dezelfde dendritische wervelkolom nek10komen. Daarom kunnen de morfologische veranderingen van dendritische stekels de functionaliteit en de structurele capaciteit weerspiegelen. Bovendien hebben studies aangetoond dat de grootte en vorm van dendritische stekels betrekking heeft op hun structurele plasticiteit, wat leidt tot het idee dat kleine stekels betrokken zijn bij leren en aandacht, terwijl grotere, stabielere stekels, betrokken zijn bij langetermijnprocessen, waaronder geheugen11. Bovendien kan de verdeling van dendritische stekels langs het dendriet worden geassocieerd met synaptische connectiviteit5,12.
Zo heeft het huidige methodologische document drie doelen: 1) Presenteer ons protocol voor ballistische etikettering, dat is gebruikt met een slagingspercentage (d.w.z. neuronen die voldoen aan selectiecriteria en geschikt zijn voor analyse) van 83,3%5,12,13 en over meerdere hersengebieden (d.w.z. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) De generaliseerbaarheid van de techniek en de toepassing ervan op in vitro gekweekte neuronen aantonen; 3) Detail de methodologie gebruikt in neuronale reconstructie software en de conclusies die kunnen worden getrokken uit dergelijke gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina (federaal betrouwbaarheidsnummer: D16-00028).
1. Bereiding van DiI/Tungsten kraalbuizen
- Los 100 mg polyvinylpyrrolidone (PVP) op met 10 mL ddH2O. Vortex de PVP-oplossing licht.
- Vul de slang met de PVP-oplossing (zie Materiaaltafel)en laat deze 20 min staan. Vervolgens, verdrijven de PVP-oplossing door de andere kant van de slang met behulp van een 10 mL spuit.
- Combineer 170 mg wolfraammicrodragerkralen met 250 μL methyleenchloride. Vortex de wolfraam kraal schorsing grondig.
- Combineer 6 mg lipofiele DilC18(3) kleurstof met 300 μL methyleenchloride. Draai de DilC18(3) kleurstofoplossing grondig.
LET OP: Voer stappen 1.3–1.4 uit in een rookkap. - Pipetteer 250 μL van de wolfraamkraalsvering op een glazen schuif. Wacht tot de vering aan de lucht droog (~ 3 min).
- Voeg 300 μL DilC18(3) kleurstofoplossing toe aan de bovenkant van de wolfraamkraalophangingslaag. Meng de DiIC18(3) kleurstof oplossing en wolfraam kraal vering grondig met een pipet tip en laat het mengsel aan de lucht drogen (~ 3 min).
- Eenmaal gedroogd, gebruik dan een scheermesje om het mengsel te splitsen in twee 1,5 mL centrifuge buizen. Vul de buizen met water.
- Sonicate in een waterbad (Amp I, 100%) tot homogeen (~ 5 min). Zorg ervoor dat de punt van de sonicator direct op de buizen ligt met de kraalvering.
- Combineer de twee 1,5 mL gehomogeniseerd mengsel in een conische buis van 15 mL. Sonicate het mengsel voor nog eens 3 min.
- Trek de wolfraam kralen-DilC18(3) kleurstof mengsel in de PVP-gecoate slang met behulp van een 10 mL spuit. Voer de slang in het bereidingsstation (zie Materiaaltafel).
- Draai 1 min op het voorbereidingsstation. Verwijder voorzichtig al het water uit de slang met behulp van een 10 mL spuit.
- Zet het stikstofgas aan en pas de stikstofstroom aan op ongeveer 0,5 liter per minuut (LPM), draai de slang in het voorbereidingsstation en droog met stikstof gedurende 30 minuten.
- Haal de slang uit het bereidingsstation en snijd in 13 mm lengtes (overeenkomend met de laadgrootte van de cartridge) met behulp van een buizensnijder. Houd de lengtes van 13 mm in sprankelende flacons in het donker.
2. Voorbereiding van hersensecties
OPMERKING: Volwassen mannelijke F344/N ratten werden paar gehuisvest in een gecontroleerde omgeving onder een 12/12 licht: donkere cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle dieren werden verzorgd met behulp van richtlijnen die door de National Institutes of Health in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
- Diep verdoven ratten met behulp van 5% sevoflurane.
- Ga naar de volgende stap wanneer de ratten niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.
- Zet de rat in een supine positie in een chemische rookkap.
- Maak een incisie door de huid langs de thoracale middellijn. Scheid het middenrif en open de kist met een schaar. Steek een naald van 20 G × 25 mm in de linker hartkamer.
- Snijd onmiddellijk het rechter atrium met een schaar. Perfuse 50 mL van 100 mM PBS met 5 mL/min van debiet. Perfuse 100 mL van 4% paraformaldehyde gebufferd in 100 mM PBS.
- Verwijder de hele rat hersenen direct na perfusie.
- Postfix het hele brein gedurende 10 min met 4% paraformaldehyde.
LET OP: Niet postfix in 4% paraformaldehyde voor meer dan 30 min, omdat het van invloed op de etikettering. - Snijd 500 μm dikke coronale secties met behulp van een rat hersenen matrix (zie Tabel van materialen). Maak de eerste snede en houd het mes op zijn plaats. Maak een tweede snede met behulp van een tweede mes en verticaal verwijderen van het eerste mes, het houden van het weefsel op het bladoppervlak.
- Plaats de hersenschijfjes in een 24 putplaat met 1 mL van 100 mM PBS in elke put. Herhaal dit proces totdat alle plakjes zijn doorgesneden.
3. Ballistische etikettering en visualisatie van hersensecties
- Verwijder de PBS van elke gerichte goed.
- Laad de cartridge met een stuk DiI/Tungsten kraalslang en plaats deze in de applicator.
- Plaats een stuk filterpapier tussen twee mesh-schermen. Sluit de applicator aan op de heliumslang. Pas de uitvoerdruk van helium aan op 90 pond per vierkante inch (psi).
- Plaats de applicator verticaal met de hand op het midden van de beoogde put op een afstand van 1,5 cm tussen het monster en het mesh-scherm. Vuur de DiI / Tungsten kralen slang.
LET OP: Zorg ervoor dat u alle PBS uit de beoogde putten verwijdert voordat u gaat fotograferen. - Laad de cartridge met de volgende DiI/Tungsten kraalslang. Ontsla continu de DiI/Tungsten kralen van de slang op de resterende plakjes.
- Vul de 24 putplaat met 100 mM PBS. Was met 500 μL verse 100 mM PBS 3x. Laat de plakjes niet omdraaien tijdens het wassen met PBS.
- Voeg 500 μL verse 100 mM PBS toe en houd de plakjes 3 uur in het donker op 4 °C.
- Breng de hersenen plakjes op glazen dia's met behulp van een fijne borstel.
OPMERKING: Drie hersensecties kunnen op elke glazen plaat worden overgebracht. - Voeg onmiddellijk 1 mL antifade montagemedium toe aan elke sectie. Plaats een coverslip van 22 mm x 50 mm over de hersendelen. Droog de glazen glijbanen in het donker gedurende 2 dagen.
- Schakel het confocale microscoopsysteem in en schakel over naar een 60× doelstelling.
- Stel het confocale microscoopsysteem in op een vergroting van 60× (A/1.4, olie) en een Z-vlak interval van 0,15 μm (pinhole maat 30 μm, back-projected pinhole radius 167 nm). Gebruik een golflengte van 543 nm om beelden van de neuronen van belang te verwerven.
- Verkrijg Z-stack beelden voor het beoogde neuron type op basis van hersengebied grenzen en morfologische kenmerken van neuronen.
LET OP: Verwerf ten minste drie beelden van elk dier.
4. Gebruik van de methode met celcultuur
- Isoleer primaire corticale neuronen van F344/N ratten op postnatale dag één met behulp van eerder gerapporteerde methodologie14.
- Cultuur primaire corticale neuronen in een 35 mm glazen bodem schotel voor een week. Verander de helft van het kweekmedium met vers neuron groeimedium op de derde dag na isolatie. Was de glazen bodemschaal 2x met 1 mL van 100 mM PBS.
- Fix with 4% paraformaldehyde for 15 min at temperature. Herhaal stap 3.2–3.6 om de cellen ballistisch te labelen.
- Was met 1 mL van 100 mM PBS 3x. Voeg 500 μL verse PBS van 100 mM toe en houd deze 3 uur lang op 4 °C in het donker.
- Voeg 200 μL antifade montagemedium toe.
- Verkrijg Z-stack afbeeldingen voor elk gericht neuron met behulp van de parameters in stap 3.10.
5. Neuronale analyse en dendritische wervelkolom kwantificering
- Blinde neuronen met codenummers om vooringenomenheid van de experimentator te voorkomen.
- Stel selectiecriteria vast voor neuronen op basis van het hersengebied van belang.
OPMERKING: Selectiecriteria voor neuronen omvatten continue dendritische kleuring, lage achtergrond, geen kleurstof clusters binnenkant van de cellen, minimale verspreiding van de DiI kleurstof in de extracellulaire ruimte, correcte morfologie van piramidale neuronen (Figuur 1). - Open neuronale reconstructie software (Zie de bijgevoegde Video 1).
- Laad een afbeeldingsbestand door te klikken op de afbeelding "Bestandsmap" in de linkerbovenhoek.
- Klik op "Soma" en markeer de soma van de neuronen op de afbeelding.
- Klik op" Tree" en selecteer "User-Guided".
- Traceer alle dendritische takken van belang.
OPMERKING: Voor piramidale neuronen, die worden gekenmerkt door een apicale dendriet en meerdere basilaire dendrieten, wordt alleen het apicale dendrietje getraceerd. Zorg ervoor dat alle verbindingstakken aan elkaar zijn bevestigd. - Klik op "Spine".
- Definieer detectieparameters en klik op "Alles detecteren".
OPMERKING: Voor hersensegmenten zijn de consistente parameters die worden gebruikt in hersengebieden: 2.0 (Outer Range), 0.3 (Minimum Height), 100% (Detector Sensitivity) en 10 (Minimum Count). Voor celkweek is het noodzakelijk om de detectorgevoeligheid te verhogen en het minimumaantal te verlagen. - Classificeren stekels door "Classificeren Alle" te selecteren.
OPMERKING: Dendritische stekels worden geclassificeerd met behulp van een algoritme dat integraal deel uitmaakt van de neuronale reconstructiesoftware15. - Sla tracering op door de schijfafbeelding in de linkerbovenhoek te selecteren.
- Uitvoeren van neuronale en dendritische wervelkolom morfologische analyses.
- Open neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software (Zie bijgevoegde Video 2).
- Laad de afbeelding door te klikken opBestanden "Gegevensbestand openen".
- Klik op "Analysis" en "Branched Structure Analysis" om neuronale morfologie en dendritische wervelkolommorfologie te analyseren.
- Voor neuronale morfologie klikt u op" Boomtotalen" en selecteert u het vak voor "Dendrite Totalen".
- Voor dendritische wervelkolommorfologie klikt u op "Spines" en selecteert u het vakje voor "Spine Details".
- Sla uitvoer op als een tekstbestand (.txt) door met de rechtermuisknop op de uitvoertabel te klikken en"Opslaan in bestand" teselecteren.
- Klikop" Analyseren " en "Sholl Analyse".
- Stel de startstraal in op 10 μm en de straaltoename op 10 μm.
- Klik op het vak "Dendrieten" en klik op "Weergeven".
- Sla uitvoer op als een tekstbestand (.txt) door met de rechtermuisknop op de uitvoertabel te klikken en"Opslaan in bestand" teselecteren.
6. Gegevensanalyse
- Analyseer de gegevens van de neuronale morfologie (d.w.z. dendritische vertakkings)
- Voeg het aantal dendrieten bij elke branchorder toe en deel door het totale aantal dendrieten. Vermenigvuldig met 100 om de relatieve frequenties te berekenen voor het aantal dendrieten bij elke branchorder.
- Analyseer de Sholl-analysegegevens om de complexiteit van neuronale arbor en dendritische wervelkolomconnectiviteit te onderzoeken.
- Bereken de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor het aantal kruispunten in elke straal.
- Som het aantal stekels dat afhankelijk is van het type wervelkolom (d.w.z. dun, stompe, paddestoel) bij elke straal en deel door het totale aantal stekels voor dat wervelkolomtype. Vermenigvuldig met 100 om de relatieve frequenties te berekenen voor het aantal stekels bij elke straal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In figuur 2Awerden de typische piramidale neuronen in het hippocampal gebied in de rattenhersendelen geïdentificeerd door ballistische etiketteringstechnologie, gekenmerkt door één grote apicale dendrieten en een aantal kleinere basale dendrieten rond het soma. Figuur 2B toont het neuron in de neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software na de soma werd gedetecteerd, dendritische takken werden getraceerd, en stekels werden gedetecteerd. Vervolgens werden de gegevens geanalyseerd met behulp van neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software, die een kans om de dendritische vertakking complexiteit (Figuur 2C) en neuronale arbor complexiteit (Figuur 2D) te beoordelen.
In figuur 2Cgebruikten we de centrifugale branch bestelmethode, verzameld uit de "Tree Totalals" output, om het aantal segmenten te tellen dat langs elke dendriet en toegewezen branch order wordt doorkruist. De relatieve frequentie van segmenten bij elke brancheorder werd onderzocht voor brancheorders 1–15. Wanneer verschuivingen in de verdeling van dendritische takken tussen groepen werden waargenomen, konden veranderingen in de dendritische vertakkingscomplexiteit worden afgeleid. Bovendien werd een Sholl-analyse uitgevoerd als een aanvullende maatstaf voor de complexiteit van neuronale arbor, waarbij het aantal dendritische kruispunten die elke 10 μm uit het soma voorkomen, in elke steekproefsectie werd gekwantificeerd (figuur 2D). Wanneer verschuivingen in het aantal dendritische kruispunten tussen groepen werden waargenomen, konden veranderingen in de complexiteit van neuronale arbor worden afgeleid.
Morfologische veranderingen in dendritische stekels kunnen worden beoordeeld aan de hand van lengte (μm), hoofddiameter (μm) en volume (μm3),zoals te zien in figuur 3A–B. Bovendien werden stekels ingedeeld met behulp van het automatische ondersteunde classificatiesysteem in de neuronale reconstructiesoftware. De relatieve frequentie van het aantal stekels tussen elke straal werd onderzocht op dunne, paddestoel, en stompe stekels. Gezien ons begrip van welke wervelkolom types vormen sterkere synaptische verbindingen (dat wil zeggen, paddestoel ten opzichte van stompe) en neurotransmitter afferents, verschuivingen in de distributie van stekels langs het neuron kan synaptische connectiviteit wijzen.
Bovendien valideerden we het nut van de ballistische etiketteringstechniek op een primair piramidale neuron in celcultuur. Ten eerste kweekten we primaire hippocampalneuronen op postnatale D1 (dag 1) op een celkweekplaat die gedurende 2 weken of tot ongeveer 70% samenvloeiing is bedekt met poly-L-lysine. Vervolgens werden de monsters vastgesteld met 4% PFA gedurende 15 min en 2x gewassen met PBS. Beginnend bij stap 3.1 van het huidige protocol, hebben we ballistisch de primaire piramidale neuronen van de hippocampus gelabeld en afgebeeld. Gegevens toonden gestabiliseerde etikettering en geïdentificeerd piramidale neuronen op basis van de driehoek vorm van het soma en grote apicale dendriet (Figuur 4A). Gebruik van neuronale reconstructie software om dendritische stekels van primaire piramidale neuronen geteeld in celcultuur te onderzoeken biedt mogelijkheden vergelijkbaar met die in de rat hersenen. Voorbeeldresultaten worden geïllustreerd voor de verdeling van dunne dendritische stekels (figuur 4B) en dendritische wervelkolomlengte gemeten in μm (figuur 4C). Het is echter opmerkelijk dat de primaire piramidale neuronen gekweekt in celcultuur minder dendritische vertakking hadden, waardoor de beoordeling, althans in dit voorbeeld, van dendritische vertakking complexiteit en neuronale arbor complexiteit.
Figuur 1: Selectiecriteria die worden gebruikt voor piramidale neuronen in de mediale prefrontale cortex gelabeld met behulp van ballistische etikettering technologie. (A) Een representatief confocale beeld (60x) van een goed gelabeld piramidale neuron uit de mediale prefrontale cortex. Een enkel piramidale neuron met een helder soma en apicale dendriet omvatte ononderbroken, heldere dendritische kleuring met lage achtergrond. (B–C) Een representatief confocale beeld (60x) van een piramidale neuron van de mediale prefrontale cortex met lichte vlekken op de meer distale takken(B) en hoge achtergrond (C). (D) Een representatief confocale beeld (60x) van een gelabeld neuron uit de mediale prefrontale cortex (gebaseerd op Bregma coördinaten) die gebrekkige morfologische kenmerken heeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Het labelen van piramidale neuronen in de hippocampus (HIP) met behulp van ballistische etiketteringstechnologie en neuroanatomaire beoordelingen. (A) Drie representatieve confocale beelden (60x) van piramidale neuronen gelabeld door ballistische wolfraam kralen. (B) De beoordeling van de neuronale morfologie: dendritische branch order analyse en Sholl analyse. Het getraceerde beeld van de dendritische wervelkolom waarin de wervelkolom morfologie werd ook geïdentificeerd met behulp van dendritische wervelkolom analyse software. (C) Bijkantoren orderanalyses gebruikt om de relatieve frequentie van dendritische takken bij verschillende bijkantoren orders te onderzoeken. (D) De aantallen dendritische kruispunten elke 10 μm van het soma werden beoordeeld met behulp van Sholl-analyse als een maat voor de complexiteit van de neuronale arbor. Gegevens worden beschreven als relatieve frequenties van de gehele gegevensset(C) of passen bij 95% betrouwbaarheidsintervallen(D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. De beoordeling van dendritische wervelkolom morfologie. (A–B) De verdeling van dendritische stekels geïllustreerd als een functie van wervelkolom type (dat wil zeggen, dun, stomp, paddestoel). Aanvullende dendritische wervelkolom parameters werden ook geanalyseerd (dat wil zeggen, lengte, volume, hoofddiameter) als een beoordeling van dendritische wervelkolom morfologie. Gegevens worden geïllustreerd als relatieve frequenties van de gehele gegevensset. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Het labelen van primaire corticale neuron in vitro met behulp van ballistische etikettering technologie. (A) Representatieve confocale beelden (60x) van primaire corticale neuronen gelabeld door ballistische wolfraam kralen in vitro. Voorbeeldresultaten die vergelijkbaar zijn met die van ballistische etikettering in hersensegmenten worden getoond voor de verdeling van dunne dendritische stekels(B) en lengte (C). Gegevens worden geïllustreerd als relatieve frequenties van de gehele gegevensset. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: Procedures van neuronale tracering en dendritische wervelkolomdetectie. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: Procedures voor het verzamelen en uitvoeren van gegevens voor kwantitatieve analyse. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een veelzijdige etiketteringstechniek voor neuronen uit zowel rattenhersenen als in vitro gekweekte neuronen. Verder rapporteren we de methodologie voor het gebruik van neuronale reconstructie software en neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. De beoordeling van neuronale morfologie en dendritische stekels biedt een kans om veranderingen in dendritische vertakkingscomplexiteit, neuronale arbor complexiteit, dendritische wervelkolom morfologie, en synaptische connectiviteit te bepalen.
Bij het uitvoeren van het protocol moeten onderzoekers speciale aandacht besteden aan een paar stappen. Ten eerste zal post-fixing in 4% PFA te lang de integriteit van het lipofiele membraan beschadigen en ervoor zorgen dat de kleurstof buiten de cellen lekt. Ten tweede, in vergelijking met de specificiteit van ballistische etikettering in hersensegmenten, die zich alleen richt op neuronen, etikettering van primaire corticale neuronen in vitro introduceert niet-specifieke etikettering van de glia, omdat ballistische etikettering in de hersenen plakjes is niet specifiek voor een type neuron (dat wil zeggen, piramidale neuron, medium stekelige neuron, granulaat cel). Zo moeten Bregma-coördinaten, morfologische beoordelingen of specifieke celmarkers worden gecombineerd met de ballistische etiketteringsmethode. Ten derde kan de dikte van de hersenschijfjes tussen 200-500 μm liggen; voor de beste resultaten moet worden geoptimaliseerd. Ten vierde, de efficiëntie van etikettering en kleurstof penetratie is gerelateerd aan vele factoren, zoals helium druk, incubatietijden na ballistische toepassing, de DiI / Tungsten kralen, de afstand tussen het gaas scherm en het oppervlak van de hersenen plakjes, enz. Het protocol moet voor elke studie worden geoptimaliseerd. Ten vijfde moeten grote klonten of clusters van ballistische kleurstof gecoate wolfraamkralen tijdens de voorbereiding worden vermeden, omdat klonten het niet mogelijk zouden maken om individuele neuronen te onderscheiden. We hebben ook vastgesteld dat DiI verspreidt in individuele neuronen meer volledig dan DiO in deze ballistische methodologie.
Niettemin, in vergelijking met traditionele etiketteringsmethoden4,maakt de ballistische etiketteringstechniek confocale beeldvorming met hoge resolutie mogelijk, waardoor de beoordeling van neuronale en dendritische wervelkolommorfologie mogelijk is. Bovendien maakt neuronale reconstructiesoftware gebruik van een algoritme voor automatische geassisteerde classificatie van dendritische stekels (d.w.z. dun, paddestoel, stomp), metingen bij het bestellen van takken, klassieke Sholl-analyse en meting van morfologische kenmerken van dendritische stekels, zoals lengte (μm), hoofddiameter (μm) en volume (μm3). De kwantificering van meerdere neuronale parameters biedt een kans om beter te begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen neurocognitieve disfunctie.
Over het algemeen maakt de ballistische etiketteringsmethode visualisatie van neuronale structuren in verschillende hersengebieden van de rat en in celcultuur mogelijk, wat belangrijk is om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan neurocognitieve disfunctie op te helderen. In deze studie presenteren we een methode om piramidale neuronen te labelen met een ballistische etiketteringstechniek. Bovendien, gecombineerd met neuronale reconstructie software, toonden we de mogelijkheid om neuronale en dendritische wervelkolom morfologie in hippocampal piramidale neuronen te onderzoeken. Groepsverschillen in neuronale en/of dendritische wervelkolommorfologie bieden een kans om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan neurocognitieve disfunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
