Vi presenterar ett protokoll för att märka och analysera pyramidala nervceller, som är avgörande för att utvärdera potentiella morfologiska förändringar i nervceller och dendritiska ryggar som kan ligga till grund för neurokemiska och beteendemässiga avvikelser.
Det har rapporterats att storleken och formen på dendritiska taggar är relaterad till deras strukturella plasticitet. För att identifiera den morfologiska strukturen av pyramidala nervceller och dendritiska taggar, en ballistisk märkning teknik kan utnyttjas. I det nuvarande protokollet, pyramidala nervceller är märkta med DilC18(3) färgämne och analyseras med neuronal återuppbyggnad programvara för att bedöma neuronal morfologi och dendritiska taggar. För att undersöka neuronal struktur, dendritiska förgrening analys och Sholl analys utförs, så att forskare att dra slutsatser om dendritiska förgrening komplexitet och neuronal arbor komplexitet, respektive. Utvärderingen av dendritiska taggar utförs med hjälp av en automatisk assisterad klassificering algoritm integrerad i återuppbyggnaden programvara, som klassificerar ryggar i fyra kategorier (dvs tunn, svamp, stubby, filopodia). Dessutom väljs ytterligare tre parametrar (dvs. längd, huvuddiameter och volym) också för att bedöma förändringar i dendritisk ryggrad morfologi. För att validera potentialen för bred tillämpning av ballistiska märkning teknik, pyramidala nervceller från in vitro cell kultur var framgångsrikt märkt. Sammantaget är ballistisk märkningsmetoden unik och användbar för att visualisera nervceller i olika hjärnregioner hos råttor, vilket i kombination med sofistikerad rekonstruktionsprogramvara gör det möjligt för forskare att belysa de möjliga mekanismerna bakom neurokognitiv dysfunktion.
År 2000 beskrev Gan et al. en snabb märkningsteknik för enskilda nervceller och glia i nervsystemet som kombinerade olika lipofila färgämnen, vilket möjliggör samtidig märkning av många hjärnceller med olika färger1,2. På senare tid, en ballistisk märkning teknik beskrevs av Seabold et al.3 som introducerade fluorescerande färgämnen (Dil) i nervceller i hjärnan skivor. En mångsidig färgning teknik, ballistiska märkning uppskattas för sin förmåga att utnyttjas i flera djurarter och över ett brett spektrum av åldrar. Dessutom kan det kombineras med immunstainning för att identifiera subpopulationer av hjärnceller3. Jämfört med traditionella tekniker (t.ex. Golgi-Cox silver impregnering, microinjection)4, ballistiska märkning ger en möjlighet att tydligare skilja morfologiska egenskaper, inklusive dendritiska taggar, en funktion som är avgörande för att dra slutsatser om neuronal komplexitet och synaptisk anslutning5.
Excitatoriska pyramidala nervceller kännetecknas av en enda, stor apical dendrit, flera kortare basala dendriter, och tusentals dendritiska taggar6. Pyramidala nervceller finns i flera hjärnan regioner relaterade till högre ordning kognitiv bearbetning, inklusive prefrontala cortex (PFC) och hippocampus. I PFC, pyramidala nervceller observeras i lager II/III och lager V, med varje uppvisar unika morfologi. Specifikt, pyramidala nervceller i lager II / III av PFC har en kortare apikal dendrit och mindre förgrening än pyramidala nervceller i lager V6. Inom hippocampus, pyramidala nervceller finns i både CA1 och CA3 regioner, med varje visar distinkta morfologier. Specifikt, pyramidala nervceller i CA1 regionen uppvisar en mer distinkt apikal dendrit, med förgrening inträffar längre från soma, i förhållande till CA3 regionen6.
Dendritiska taggar på pyramidala nervceller i både PFC och hippocampus är den primära platsen för excitatoriska synapser7. Morfologiska egenskaper hos dendritiska taggar, som klassiskt kännetecknas i tre primära kategorier (dvs. tunn, stubbig eller svamp8), har varit relaterade till storleken på excitatoriska synaps9. Tunna taggar, som kännetecknas av en lång, tunn hals, små bulbous huvud, och mindre postsynaptiska densiteter, är mer instabila och utveckla svagare anslutningar. Svampryggar, som har ett större dendritiskt ryggradshuvud, är dock erkända för att bilda starkare synaptiska anslutningar, en effekt som härrör från deras större storlek. I skarp kontrast, stubby taggar saknar en ryggrad hals, uppvisar en ungefär lika huvud och hals volymförhållande8. Inom hippocampus, grenade taggar kan också observeras, där ryggraden har flera huvuden som kommer ut från samma dendritiska ryggraden hals10. Därför kan morfologiska förändringar av dendritiska taggar återspegla funktionalitet och strukturell kapacitet. Dessutom har studier visat att storleken och formen på dendritiska taggar relaterar till deras strukturella plasticitet, vilket leder till tanken att små taggar är involverade i lärande och uppmärksamhet, medan större, mer stabila taggar, är involverade i långsiktiga processer, inklusive minne11. Dessutom kan fördelningen av dendritiska taggar längs dendriten associeras med synaptisk anslutning5,12.
Således har den nuvarande metodologiska papper tre mål: 1) Presentera vårt protokoll för ballistiska märkning, som har utnyttjats med en framgång (dvs. nervceller som uppfyller urvalskriterier och lämpliga för analys) av 83,3%5,12,13 och över flera regioner i hjärnan (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Visa generaliserbarhet av tekniken och dess tillämpning på nervceller odlas in vitro; 3) Detalj den metod som används i neuronal återuppbyggnad programvara och slutsatser som kan dras från sådana data.
I detta protokoll beskriver vi en mångsidig märkningsteknik för nervceller från både råttahjärna och de som odlas in vitro. Dessutom rapporterar vi metoden för att utnyttja neuronal återuppbyggnad programvara och neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara för att bedöma neuronal morfologi och dendritiska taggar. Bedömning av neuronal morfologi och dendritiska ryggar ger en möjlighet att bestämma förändringar i dendritiska förgrening komplexitet, neuronal arbor komplexitet, dendritiska ryggra…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av NIH bidrag HD043680, MH106392, DA013137 och NS100624.
20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
Borax | Sigma | B9876 | |
Boric acid | Sigma | B0252 | |
Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
Cover glass | VWR | 637-137 | |
DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
Glucose | VWR | 101174Y | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |