Summary
現在のプロトコルは変形性関節症に伴う形態学的関節変化の定量化のための厳密で再現可能な方法を確立する。このプロトコルの適用は、疾患の進行を監視し、変形性関節症における治療介入を評価する上で価値がある。
Abstract
米国で最も流行している関節疾患の1つである変形性関節症(OA)は、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす。現在までに、軟骨変性を遅くまたは阻害することができるOAのための既存の治癒療法はありません。現在、OA病理を理解し、OAを効率的に減速、停止、または逆転させることができる新しい治療アプローチまたは薬剤を発見するための広範な研究機関があります。したがって、関節軟骨、滑膜、軟骨下骨のOA関連の病理学的変化を正確に評価するために、定量的かつ再現可能なアプローチを持つことは非常に重要です。現在、OAの重症度と進行は、主に変形性関節症研究協会インターナショナル(OARSI)またはマンキンスコアリングシステムを使用して評価されています。これらのスコアリングシステムの重要性にもかかわらず、半定量的であり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、初期の疾患状態または早期治療段階における軟骨の微妙な、まだ重要な変化を正確に評価できないことである。ここで説明するプロトコルは、コンピュータ化された半自動化された組織形態測定ソフトウェアシステムを使用して、OAにおける関節変化の評価のための標準化された厳格で再現可能な定量的方法論を確立します。このプロトコルは既存のシステムに強力な付加を提示し、継手の病理学的変化のより効率的な検出を可能にする。
Introduction
米国で最も流行している関節障害の1つであるOAは、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす1,1、2、3。32関節軟骨は、摩擦を最小限に抑え、動きを容易にし、関節圧迫4に耐えるように設計された、ジ関節関節の特殊な結合組織である。関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックスの2つの主要成分で構成されています。軟骨細胞は、細胞外マトリックス4の開発、維持、修復において主要な役割を果たす特殊な代謝活性細胞である。軟骨肥大(CH)は、OAの開発の主要な病理学的徴候の一つである。細胞サイズの増加、プロテオグリカン産生の減少、および最終的に軟骨変性55、6、76,7につながる軟骨マトリックス分解酵素の産生増加を特徴とする。また、関節の軟骨下骨および滑膜の病的変化は、OAの発達および進行898、9、10、11、1210,11において重要な役割を12果たす。,現在までに,、軟骨変性1、2、3、13、142,3,13を阻害する既存の治癒療法はありません。114したがって、OA病理を理解し、OAを遅くしたり停止したりすることができる新しい治療アプローチを発見することを目的とした広範な進行中の研究があります。したがって、関節の軟骨、滑膜、および軟骨下骨におけるOA関連の病理学的変化を正確に評価できる定量的かつ再現性のあるアプローチの必要性が高まっています。
現在、OAの重症度と進行は、主にOARSIまたはマンキンスコアリングシステム15を使用して評価される。しかし、これらのスコアリングシステムは半定量的なものであり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、疾患の間、または遺伝子操作または治療介入に応答して関節に起こる微妙な変化を正確に評価できないことである。軟骨、滑膜、または軟骨下骨,,16、17、18、19、20、2117の組織形態測定分析を記述する16文献には散発的な報告がある。19,20,2118しかし、これらの関節成分の厳密かつ再現性のある組織形態分析のための詳細なプロトコルはまだ欠けており、現場で満たされていないニーズを生み出しています。
組織形態測定解析を用いたOAの病理学的変化を研究するために、手術用OAマウスモデルを用いて、内側半月板(DMM)の不安定化を介してOAを誘導した。マウスOAの確立されたモデルの中で、 DMM は傷害の外傷性メカニズムを含むため、我々の研究のために選択されました22,,23,,24,,25, 26.,26半月靭帯損傷(MLI)または前十字靭帯損傷(ACLI)手術と比較して、DMMは、ヒト,22、24、25、26,24,におけるOAの発達と同様に、OAのより緩やかな進行を促進する。25マウスは、関節軟骨、軟骨下骨、および滑膜の変化を評価するためにDMM手術後12週間で安楽死させた。
このプロトコルの目的は、OA に伴う共同変更を評価するための、標準化された厳格で定量的なアプローチを確立することです。
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Protocol
12週齢の雄C57BL/6マウスはJax Labsから購入した。すべてのマウスは、12時間の明暗スケジュールの部屋で、マイクロアイソレーターケージあたり3〜5匹のマウスのグループに収容された。すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、ペンシルベニア州立大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 心的外傷後変形性関節症(PTOA)外科モデル
- 腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)/キシラジン(10mg/kg)の組み合わせを使用してマウスを麻酔し、痛みの軽減のために腹腔内注射を介してブプレノルフィン(1mg/kg)を投与し、膝の上に髪を剃る。手術を開始する前に、ペダル反射の欠如を確認してください。
- 前に説明したとおりに、内側半月板(DMM)手術の不安定化を行う22,,23.
注: より詳細な外科プロトコル情報,22,23についてはGlassonらおよびSinghらの参考文献を参照してください。- 右膝関節の近位脛骨高原に遠位膝蓋骨から3mm縦切開を行います。縫合糸を使用して膝蓋腱を置き換える。
- 関節カプセルを腱に開き、裂歯脂肪パッドを動かして、間隔部領域、半月板間隔管、および半月靭帯23を可視化する。
- 内側半月靭帯を経裂してDMMを完了し、関節22,23,23を不安定にする。ステープルまたは縫合糸で切開部位を閉じます。
- 同様の手順に従って偽の手術を行うが、内側の月隔靭帯の横断を行わない。
注:マウスは、DMMまたは偽の手術のいずれかを受けるために無作為化されました。先に発表された文献によれば、マウスはDMM手術22、23、24の12,23週間後に有意なPTOAを24発症する。
2. マウス安楽死とサンプルコレクション
- マウス安楽死
- DMMの12週間後、腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)/キシラジン(10mg/kg)の組み合わせを使用してマウスを麻酔する。
- 胸郭に沿って皮膚を通して中線切開を行い、肋骨ケージを引き込んで、心臓を灌流固定27に露出させる。
注:適切なげっ歯類の固定のためのプロトコルの追加情報、および適切な機器アセンブリと手順27のビデオ描写については、Gageらのリファレンスを参照してください。 - メーカーのプロトコルに従って、灌流装置をセットアップします。
- 血液が取り除かれ、肝臓が青白くなるまで、左心室を通してヘパリン化された生理的な生理を浸透させることによってマウスを安楽死させる。完全なマウス固定が達成されるまで、10%中性緩衝ホルマリンでマウスを浸透させます。
注:正常に浸透したマウスは硬くなります。自動ポンプシステムを使用した平均灌流時間は5~7分です。
- サンプルの収集と準備
- 大腿骨中および脛骨中で骨を切断して膝を分離し、周囲の筋肉組織を解剖する。
- 膝関節を室温で10%中性緩衝ホルマリンに24時間保存し、その後4°Cで6日間保存して固定を続けます。
- 穏やかな揺れ28で室温で1週間のEDTA脱灰バッファーに試料を貯蔵することによって骨を脱灰する。デケイシングバッファー溶液を 3 日ごとに変更します。
注:脱灰バッファーは、850 mLの蒸留水と15 mLの氷酢酸の溶液に140 gの超純EDTAテトラナトリウムを溶解して調製しました。この緩衝液を、溶液に氷酢酸を滴下添加して7.6に平衡化した。pH=7.6に達すると、バッファーは蒸留水で1Lの総体積に持ち込まれた。脱灰バッファーは、新鮮な調製し、調製の1週間以内に使用した。 - 50%エタノールで膝を洗浄し、その後、70%エタノールをそれぞれ15分間洗浄し、次いで埋め込み処理を行います。
注:流体移送処理は、ペンステートミルトンS.ハーシー医療センターの分子および組織病理学コアによって行われました。最適なサンプル処理に関する推奨事項については、機関の組織学のコアを参照してください。 - パラフィンブロックの底面に面した関節の内側の側面を用いて、マウスの膝をパラフィンに埋め込みます。埋め込み時に関節の脛骨側にわずかな圧力を加えて、脛骨および大腿骨の表面ができるだけ同じ平面に近づくようにします。
3. ミクロトーム断面とスライド選択
- ミクロトーム断面
- サンプルブロックの正しい向きを確認するために、マイクロトームのブロックホルダーの平面調整ノブを使用してください。
- 大腿骨の遠位面、脛骨の近位領域、および内側半月板の前角と後角がセクションコレクションのために同じ平面に現れるようにパラフィンブロックに直面する(補足図1A)。内側半月板の前角と後部角が互いに分離し始めると、スライド上のセクションの収集を開始します。
- 構造物のサイズを比較することにより、脛骨、大腿骨、およびメニシが同じ平面に表示されることを確認します。脛骨と大腿骨は、両方のメニスカル角の大きさと形状が似ている、同等の大きさでなければなりません(補助図1A)。構造体が対応する構造体と比べて大きすぎる場合は、追加の面が必要であることを示します。重要なのは、関節スペースがそのまま残っていることを確認することです。
- 5 μmセクションの内側関節コンパートメントを通してパラフィン埋め込みマウス膝の矢状切片を取り、スライド上のセクションを収集します。パラフィンブロックあたり約30個のセクションを収集します。
- スライドの選択
- 5 番目のセクションから始まるサンプルごとに、50 μm 離れた 3 つの代表的セクションを選択します (スライド 5、15、および 25)。選択したスライドは、その後の染色、OARSIスコアリング、およびヒストモルフォメトリクス分析に使用されます。
注: 合計 30 個のセクションがあるブロックから、サンプル全体を明確に表すために、セットの最初のスライド (スライド 5 ~ 10)、中央 (スライド 15 ~ 20)、および終了 (スライド 25 ~ 30) を選択します。サンプル間の深さの類似レベルからスライドを選択します。
- 5 番目のセクションから始まるサンプルごとに、50 μm 離れた 3 つの代表的セクションを選択します (スライド 5、15、および 25)。選択したスライドは、その後の染色、OARSIスコアリング、およびヒストモルフォメトリクス分析に使用されます。
4. ヘマトキシリン、サフラニンオレンジ、高速グリーン染色
- 選択したスライドを3種類のキシレンでデパラフィン化します。100%エタノールの2つの変化、95%エタノールの2つの変化、および70%エタノールの1つの変化でスライドを水和する。
- 7分間ヘマトキシリンでスライドを汚し、10分間流水で洗い、1.0%氷酢酸で10分間1.0%の氷河酢酸を洗い流し、サフラニンOで5分間、0.5%の氷河酢酸に浸してすぐに洗い流します。
- 蒸留水の2つの変化でスライドし、空気を乾燥させます。
- 3つの変更の3つの変更のスライドをそれぞれ5分間クリアし、キシレンベースの取り付けメディアとカバースリップで取り付けます。
注:ヘマトキシリンは、骨髄の領域を識別するための核染色剤として機能します。サフラニンOは、軟骨、プロテオグリカン、ムチン、およびマスト細胞顆粒を染色するために使用されます。速い緑は骨のためのカウンターステインとして使用される。
5. スライドイメージング
- 顕微鏡とコンピュータベースのイメージングソフトウェアに取り付けられた利用可能なカメラを使用して、Safranin-OとFast Green染色スライドを画像化します。
- イメージングソフトウェアを開き(材料表を参照)、膝関節の関心領域(ROI)をイメージングウィンドウの中央に配置します。回転顕微鏡スライドステージを使用する場合は、脛面が撮像領域の横軸の幅に及ぶようにスライドを位置合わせします。
- サンプルのセットをイメージする前にカメラのホワイトバランスを設定します (補足図 2)。4倍および10倍倍率の関節コンパートメントを画像化し、脛骨および大腿骨下骨の両方が各画像ROI内に含まれていることを確認する(補助図1A、B)。 BOARSI スコアリングに使用する 3 つの選択した各レベルのイメージを保存します。
注意:カメラのホワイトバランスを設定する方法は、使用するソフトウェアとカメラシステムによって異なります。通常、カメラタブまたはメインイメージングメニューに移動し、下にスクロールして[ホワイトバランスを設定]を選択します。[ホワイトバランスの設定]を選択すると、小さなカーソルまたはアイコンが表示されます (補助図 2A)。カーソルを使用して、画像/サンプル内の、ジョイントスペースなどの汚れのない領域を選択して、ホワイトバランスを設定します。
6. 変形性関節症研究会国際(OARSI)スコア15
- 選択した3つのサフラニンOとファストグリーンの染色スライドを、すべてのサンプルからランダムにします。
- 3人の観察者と盲目の方法でOARSIスコアリングを実行します。簡単に説明すると、ランダム化された順序で一度に 1 つの画像を表示し、各サンプルに選択した 3 つのレベルのいずれかに関連付けて、3 つの観測者が各画像をスコア付けできるようにします。
注: グレーディング・スケール15の詳細な説明については、OARSI スコアリング表を参照してください。 - 各観測点の各スコアを使用して、各セクションの平均スコアを計算します。3つの代表的なセクションの平均スコアを取ることによって、サンプルあたりの平均スコアを決定します。
7. ヒストモルフォメトリック解析
メモ:膝関節のライブ画像は、顕微鏡カメラを使用してタッチスクリーンモニターで見られ、スタイラスを使用してROIを手動でトレースします。ヒストモルファトリーソフトウェアの組み込みアルゴリズムは、定義されたROIで指定されたパラメータ(下記のプロトコルを参照)を定量化します。重要なことに、OARSIスコアリングで使用される同じサフラニンOとファストグリーン染色されたセクションは、ヒストモルフォメトリック分析に使用されます。
- ソフトウェアのセットアップと測定の準備
- 顕微鏡、カメラ、コンピュータ、およびタッチスクリーンモニタをオンにします。ソフトウェアアイコンをクリックして、ソフトウェアプログラムを起動します。顕微鏡のステージにスライドを置き、観察します。
- 測定ウィンドウ内でサンプルを中央に配置します。測定グリッドが、顕微鏡で使用されている目的に合わせて適切な倍率に設定されていることを確認します(補足図3)。
- 画面上部の[ファイル] タブに移動し、[設定の読み取り]まで下にスクロールします。[設定]ウィンドウを開き、測定するパラメータに適した設定ファイルを選択します。
- 画面右側のリストから測定するパラメータを選択します (補足図 3)。特定の組織のROIを測定するために、以下に説明する手順に従って画像をトレースするためにスタイラスまたはマウスカーソルを使用してください。各測定が完了したら、右クリックして測定を終了し、次のパラメータに進みます。
注: 測定するパラメータのリストは、説明された ROI を測定するためにソフトウェア会社と協議して設定された、個別の優先ファイルを使用して作成されます。完全なセットアップに関する詳細については、ディスカッションを参照してください。 - すべての測定を完了し、ソフトウェア画面の下部にある[概要データ]タブに移動します (補足図 3)。画面ウィンドウをクリックするか、キーボードのInsertキーを押すか、データをコピーして別のスプレッドシートに貼り付けます。
注: ランダム化および盲目の方法でヒストモルフォメトリック解析を実行します。すべてのサンプルのパラメータ測定をすべて完了したら、データを整理し、各サンプルの3つのスライドからの測定値を平均化します。
- 合計、石灰化、および計算不能軟骨領域の測定
注: これらの手順を実行するには、市販のソフトウェア(「資料表」を参照)を使用します。このセクションで説明する軟骨領域C、接合部、軟骨下骨領域の明確化については、補足図1B、Cを参照してください。- 軟骨が関節空間と合致する脛骨軟骨表面の上端を横切って線を引きます。軟骨軟骨が軟骨下骨と合致する軟骨-骨接合部に2本目の線を引く(図1B)。ソフトウェアのArea関数を使用して、軟骨面積の合計測定を自動的に取得します。
- 潮汐マークに沿って線を引きます, 軟骨の石灰化と非石灰化領域を分離する自然発生線.軟骨軟骨が軟骨下骨と合致する軟骨-骨接合部に2本目の線を引く(図1B)。ソフトウェアのArea関数を使用して、石灰化軟骨面積の測定を自動的に取得します。
- 合計軟骨領域から石灰化軟骨領域を差し引くことによって、未計算の軟骨領域を計算する(図1B)。
- 軟骨細胞数と表現型の決定
- ヒストモルファトリーソフトウェアの設定内に別々のカウント関数を作成して、マトリックス産生とマトリックス非産生軟骨細胞を区別する(図1B)。
- スタイラスを使用して、指定された表現型を発現する軟骨細胞の上に小さなドットを作ることによって、軟骨細胞を産生または生産しない行列の数を決定する(図1B)。
注:それらの表現型に従って細胞を、生成するマトリックス(すなわち、強力なサフラニン-O染色)または非産生マトリックス(すなわち、非常にかすかなまたはサフラニンO染色なし)として数えます。
- 脛骨関節表面周長の測定
- 脛骨軟骨の表面を横切る線をトレースし、個々の細動を慎重に定義することによって、絶対的な脛骨関節表面の周長を測定する(図1C)。
- タイドマークに沿って 2 本目の線を引き、各セクションの平面の内部制御として機能します (図 1C)。
- 脛骨関節表面細動指数を、脛骨関節表面周囲を潮汐境界で割って計算する。
注: Tidemark の周囲は一般的にサンプル間で等しいため、sham と DMM の関節面の境界の差は、絶対周長または細動指数を使用した場合に一般的に小さかった。
- 軟骨下骨・骨髄空間面積の測定
- ヘマトキシリンのみで染色された軟骨下Area領域(すなわち、高速緑色の陰性)の領域を概説して、軟骨下腔領域を測定し、軟骨下骨内の全骨髄空間領域を決定する。これらの領域の周囲に線を引いて、脛骨下骨内のすべての骨髄空間の総面積を決定する(図2B)。
- 軟骨-骨接合と成長板の上層境界との間の領域を概説することによって領域機能を使用して、軟骨下領域の総量を測定し、前骨棘と後骨棘の領域に横方向に延びる(図2B)。
- 全軟骨下領域から軟骨下骨髄領域を差し引くことによって軟骨下骨領域を計算する(図2B、C)。C
- 前部および後骨棘領域の測定
- 骨棘領域を測定するには、領域機能を用いて近位脛骨の前骨および後骨棘をトレースする(図2B、E、F)。EF
注:骨棘は、関節軟骨と成長プレート、前または後口下領域の間に形成される骨の突起です。脛骨の前側および後方側の骨棘領域は、前部または後部を軟骨下骨にトレースすることによって決定される。骨棘と軟骨下骨の間の結合は、関節軟骨から成長プレートに及ぶ細胞のラインによって明確に線引される。骨棘と滑膜の間の結合は、骨と線維組織の間の移行によって定義される。
- 骨棘領域を測定するには、領域機能を用いて近位脛骨の前骨および後骨棘をトレースする(図2B、E、F)。EF
- 滑膜厚の測定
- 大腿骨の前部挿入点から半月板上の付着点に向かって大腿骨の内側挿入点から線を引くことによってArea関数を使用して前大腿滑膜の厚さを測定する(図3B)。
- 大腿骨の滑膜の外側の挿入から、半月板への付着に向かって2本目の線を引く(図3B)。
- 滑膜の全領域を滑膜の周長で割って、滑膜厚さを計算します。
8. 統計分析
- 測定されたパラメータを収集し、各サンプルの3つの代表的なセクションから結果を平均します。ペアになっていない Student の t 検定を使用してデータを分析し、2 つのグループまたは一方向の分散分析を比較して、3 つ以上のグループを比較します。
- データを平均値±標準誤差として表示します。
注: 統計的有意性は p ≤ 0.05 で達成されました。
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Representative Results
DMM誘導OAは関節軟骨変性と軟骨細胞損失をもたらす
DMM誘導OAは、偽マウスと比較してOARSIスコアが増加し、表面浸食および軟骨損失によって明らかに特徴づけられた(図1A、D)。Dここで詳述したヒストモルホメトリープロトコルは、総軟骨面積の減少および非定量化軟骨領域(図1A、B、E、G)を含むいくつかのOA関連のB変化をE検出したG。Figure 1A総軟骨細胞数の減少;そして、重要なことに、軟骨細胞を産生するマトリックスの損失(図1H、I)。I関節表面への変化は、浸食の重症度を示し、軟骨細動指数を用いて評価した。全体として、DMMマウスでは細動指数が増加した(図1C、K、L)。KLしかし、プロトコルで議論されているように、細動指数は、軟骨表面の完全な浸食のために、末期OAで減少する可能性があることに注意することも重要です。細動指数の増加は、OAの発達と進行の間に関節軟骨表面の変性を意味する。これらの結果は、OA進行を特徴づける病理学的軟骨変化を検出し、定量化する組織形態測定解析プログラムの能力を強調する。
DMM誘導OAにおけるその他の関節変化の評価
OAは軟骨以外の関節組織に影響を及ぼし、これらの組織の病理学的変化は疾患進行において重要な役割を果たす。ここで説明した組織形態測定法は、DMMマウスにおける骨髄領域の減少と軟骨下骨領域の増加と減少を明らかにした(図2A~D)、軟骨下骨硬化症D29、30,30を示す。前および後骨棘領域もDMMマウスにおいて増加した(図2E、F)、損傷部位F29、30,30における関節負荷の変化を処理する補償機構として作用する軟骨下骨改造が進行中であることを示唆している。
,12,31滑膜のヒストモルフォメトリクス分析は、関節腔内におけるOA関連滑膜炎症の典型的な結果であるDMMマウス(32,33,図3A–C)の滑膜厚の増加を示した。C
OARSIスコアリングとヒストモルファトリー間のユーザ間変動性の解析
図4Aは、非計算軟骨領域(図4A)およびOARSIスコアのヒストモルフォメトリクス解析の有意なユーザ間変動性を示さない(図4B)。しかし、ヒストモルフォメトリック解析では、-0.0001179~0.00120の観測者間の平均差が極めて低く、3人の観測者が得た結果のほぼ完全な重複を招き、OARSIスコアの平均差はOARSIスコアの方がO2とO2値とO23値の明確な偏差を伴う。
図1:恥骨手術およびDMMマウスからの脛骨関節軟骨および関節軟骨細胞の形成型のヒストモルホメトリー。(A)サフラニンO/ファストグリーンで染色された脛骨関節面。(B) ヒストモルフォメトリック解析を用いて、総軟骨面積と石灰化軟骨面積(オレンジ)を追跡した。タイドマーク領域より優れた軟骨を、非定量軟骨(緑色)として算出した。軟骨細胞(白)および非産生軟骨細胞(マゼンタ)を産生するマトリックスを、非軟骨領域内で計数した。(C)脛骨関節面周囲を、関節面(青線)をトレースし、続いてタイドマーク(紫色の線)をトレースして細動指数を決定した。(D) DMMマウスではOARSIスコアが増加した。(E–L)定量化軟骨領域と軟骨細胞の図表は、シャムマウスおよびDMMマウスから数える。シャムマウスと比較して、DMMマウスは全脛骨軟骨領域(E)、脛骨石灰化軟骨領域(F)、脛骨非カルシウム軟骨(G)、脛骨全軟骨細胞数(H)、脛骨マトリックス産生軟骨細胞、(I)および脛骨マトリックス非産生軟骨I細胞(J)を減少させた。シャムマウスと比較して、DMMマウスは脛骨関節表面周囲(K)を増加させ、脛骨関節表面細動指数(L)を増加させた。画像は10倍の倍率で撮影されました。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, およびウェルチの補正を使用した非対t検定を使用した****P < 0.0001, 値は平均 ± SEM として表されます;n = 5/グループ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:恥骨手術及びDMMマウスによる軟骨下骨髄領域及び軟骨下骨領域のヒストモルホメトリー(A)脛骨関節軟骨と軟骨下骨をサフラニンO/ファストグリーンで染色した。(B)軟骨下骨髄領域(緑色)、軟骨下骨領域(マゼンタ)、前骨棘領域(黄色)、および後骨棘領域(灰色)を、計算された血圧測定ソフトウェアで追跡した。(C–F)シャムマウスとDMMマウスの間の組織形態測定領域をグラフ化した。シャムマウスと比較して、DMMマウスは、脛骨下骨領域(C)および脛骨前骨および後骨棘領域(E-F)の増加と、恥マウスと比較してF脛骨下骨下骨髄領域の減少を有していた(D)。画像は4倍の倍率で撮影されました。*P < 0.05, **P < 0.01 ウェルチの修正でペアになっていないt検定を使用しています。値は平均値 ± SEM として表されます。n = 5/グループ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:恥の手術およびDMMマウスからの滑膜のヒストモルホトリー。(A) サフラニンO/ファストグリーンで染色されたシノビウム。(B)滑膜厚は脛骨関節(緑色)の前部側面を横切って前月隔膜をトレースすることによって測定した。(C) 計算された構造上のソフトウェアを用いた滑膜厚さの測定をグラフィカルに表現する。DMMマウスは、シャムマウスと比較して滑膜厚が増加した。画像は20倍の倍率で撮影されました。P < 0.001 ウェルチの補正でペアになっていないt検定を使用して、値は平均±SEMとして表されます。n = 5/グループ;S = 滑膜;F = 大腿骨;そしてM =半月板。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: OARSI スコアリングとヒストモルフォメトリック分析におけるユーザー間変動(A) 3人の盲目の観察者(O1、O2、O3)によるヒストモルファトリーを用いて得られた非定量化軟骨領域測定。(B) 3つの盲目の観察者から得られたシャムおよびDMMマウスのOARSIスコア。点線は、各グループの平均値を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:サフラニンOと高速緑色染色マウス脛骨関節部の組織学的分析(A)脛骨関節の4倍の拡大画像。フォーカスのある領域にはラベルが付けられます。(B)脛骨関節ROIの10倍の拡大画像。脛骨および大腿骨の表面、前および後のメニスカル角が視覚化される。メニシはほぼ同じサイズで、画像化ROIは関節コンパートメントを中心にしています。(C)近位脛体表面の40倍の拡大画像。タイドマークラインは、計算されていない軟骨帯と石灰化した軟骨帯の間の線としてラベル付けされます。骨軟骨接合は、石灰化軟骨の終わりと軟骨下骨の始まりとの間に標識される。こちらをダウンロードしてください。
補足図2:ヒストモルホトリーシステムのセットアップとカメラホワイトバランスキャリブレーション(A)マウス脛骨関節は、ホワイトバランスが設定されていないソフトウェアウィンドウで4倍の倍率で視覚化。画面の上部にあるカメラ設定タブと、ホワイトバランスを設定するためのドロップダウンメニューの選択に注意してください。(B)マウス脛骨関節を4倍に拡大し、ホワイトバランスをセットした。なお、試料の着色と染色の変化により、測定を行う際に脛骨関節の特定の領域を区別するユーザの能力が高まる。こちらをダウンロードしてください。
補足図3:組織形態測定解析測定前の組織形態測定ソフトウェアの設定ヒストモルフォメトリクスソフトウェアウィンドウの代表的なスクリーンショット。なお、染色されたマウス膝の部分は測定領域(黄色のグリッド)に中央に配置され、領域の正しい拡大スケールが、顕微鏡で使用されている目的(画面の右上隅に赤で丸で囲まれた)に合わせて選択されます。パラメータのリストは、撮像と測定領域の右側の列に表示されます。パラメータを選択するとパラメータがハイライトされるため、現在、測定対象として脛骨細動が選択されています。ウィンドウの下部にある[サマリーデータ]タブでは、各サンプルの各パラメータの測定値が整理され、各セクションの各パラメータ測定が完了した後にエクスポートされるように保存されます。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
最近の変形性関節症研究は、関節内の異なる組織と、各組織が疾患開始または進行において果たす役割の間のクロストークの理解を高めている898、9、10、35、36。10,35,36,したがって、OAの評価は軟骨の分析に限定されるべきではなく、軟骨下骨および滑膜の分析も含めるべきであることが明らかになっている。それにもかかわらず、関節軟骨はOA15、37、38の半定量的スコアリングの主15,37,38な焦点となっている。計算された組織病学は、すでに筋骨格系研究39、40、41、42、43、4440,41,42,43,44の様々な領域に適用されていますが、OAの間に膝関節コンパートメント内の多数の組織への変化を正確かつ再現的に分析するプロトコルを記述する際には、満たされていないギャップがあります。39軟骨、軟骨下骨、および滑膜の変化を定量化するための組織形態測定の測定の適用は、OA関節の一次および二次的変化のより全体的な評価を提供する。
ここでは、コンピュータ化された半自動化された組織形態測定ソフトウェアを利用して、異なる関節コンパートメントの病理学的変化を定量化し、OAの発達、進行、または回帰を評価する詳細なプロトコルについて初めて説明する。サンプル調製時に注意が必要です, 明確で一貫性のあるSafranin-Oと高速グリーン染色は、トレースし、組織形態測定ソフトウェアで測定を取る際のあいまいさを制限するために不可欠です.スライドの各バッチに新鮮な染色ソリューションを使用することをお勧めします。さらに、染色のためのスライド選択は、ブロック間で一貫したレベルで行う必要があります。最初のスライドは、サンプル間の同様のレベルで撮影する必要があります, 理想的には、前と後のメニスカルホーンが分離し始めるとすぐに.
OAの間、総軟骨および非カルシウム化軟骨区域は軟骨細動および変性のために減少する。重度のOAでは、石灰化軟骨の完全変性も起こり得る。プロトコルは、軟骨における同化対同化シグナル伝達の評価のためのOA進行の評価として軟骨細胞表現型を決定する意義を強調する。軟骨細胞の総数および軟骨細胞を産生するマトリックスの数(同化)は、通常軟骨で高く、OA軟骨では低く、OAの既存の軟骨細胞の大部分が非産生マトリックスである(同化)。重要なことに、OA治療の発見の分野におけるこの必須パラメータは、OARSIまたはマンキンのスコアリングシステムによって評価されない。軟骨領域と軟骨細胞の数を維持するだけでなく、軟骨細胞同化表現型を促進する特定の介入は、より効果的な治療アプローチである可能性があります。
ここで詳述するプロトコルはまた、軽度から中等度のOAに存在する軟骨表面細動の微妙な変化を定量的に測定する方法を提供する。細動の数が多いほど、関節面にインデントが存在するため、周囲の測定が増加することを意味します。したがって、脛骨関節表面周囲および細動指数は、正常軟骨において低く、いくつかの細動による軽度のOA中級、より細動性のために中程度のOAでは高いが、完全な軟骨変性および喪失のために重症OAでは再び低い。
軟骨下骨リモデリングおよび硬化症は、OAの特徴的な病理学的徴候であり、その結果、軟骨下骨髄領域が減少し、軟骨下骨領域が8、9、10、29、309,10,29,30に増加する。プロトコルに記載されている軟骨下骨領域および軟骨下腔領域の変化の定量化は、OA疾患の複雑な性質の発達および進行の駆動成分として多組織変化を理解することの重要性を示している。前骨および後骨棘領域の測定は、関節内で起こる骨のリモデリングの規模に関する重要な洞察を提供する。骨棘領域は、シャム作動の膝において極めて小さく、OAにおける骨棘形成のために増加する。前骨棘領域の測定は、膝の内側領域、DMM損傷部位付近で起こる骨改修の重篤な性質による後骨棘領域の測定とは若干異なっていた。
最後に、このプロトコルは、滑膜の変化の定量的な評価を概説する。滑膜の厚さは、シャムジョイントでは低く、OAでは増加します。OAにおける,炎症は、関節空間10、11、12101231、32への炎症性サイトカインおよび他の因子の送達を増加させる滑膜の肥厚をもたらす。,11,32したがって、関節炎をOA疾患進行の調節因子として評価することが不可欠である。
ヒストモルホトリーソフトウェアの使用は、ハードウェアの可用性によって制限されています:タッチスクリーンモニターやスタイラス付きタブレットは、正確な測定を行うために必要な手動トレースの量を考えると絶対に必要です。法外科ソフトウェアで小さな領域を測定しようとすると、ペンのサイズが1つの直径に制限される可能性があります。小さな面積を測定できないのは不便かもしれませんが、測定された関節領域は面積ツールで簡単に定義でき、ソフトウェアの低い差別は最終測定で無視できる違いになります。
また、ユーザ間変動は、常に信頼性が高く、再現可能な定量的プロトコルの実装に関する懸念事項である点に留意すべきである。効果的で再現性のある厳格な組織法プロトコルを確立するには、実験分析内で潜在的な複合変数を制限する必要があります( ユーザー間変動の低減を含む)。しかし、ソフトウェアとの短いトレーニングセッション(約30分)の後、ラボメンバーは非常に一貫性があり再現性の高い測定値を生成することができ、ユーザー間の測定値の分布は、ほとんどユーザ間変動を表さない直接オーバーレイをより多く反映しています。重要なことに、このヒストモルファトリープロトコルは、非常に再現可能な方法で、偽のサンプル間の離散的な違いを定量化する効率的な方法を示しています。
OARSIスコアリングシステムは、OA患者および実験用マウスモデル15における軟骨損傷の評価に一般的に使用される尺度である。スコアリングシステムは、主に裂け目/浸食または関節面の程度に焦点を当てた整数スケールに基づいています。実験ではOARSIスコアに有意なユーザー間変動は見つからなかったが、観測者間の平均差は依然として高く、記載されたヒストモルファトリープロトコルではほとんどなかった。したがって、定義されたパラメータのヒストモルフォメトリクス分析のためにこの再現性のプロトコルを確立することで、複数のユーザー間でも各サンプルの非常に一貫した測定が可能になり、サンプル分析の主観的性質の一部が除去されます。
OARSI標準化されたスコアリングシステムはOA研究のためのベンチマークである。しかし、システムの限られたスコアベースの性質は、関節内で発生する微妙な変化の定量化を可能にしません。この原稿でヒストモルホトリーソフトウェアを用いた拡張的な共同評価は、OAの重症度の強化された、より少ない主観的特徴を提供する。このプロトコルはOAの外科的誘導を受けたマウスのために最大限に活用される。ただし、この手順と手法は、他のモデルや仮説内での OA の評価に適用できます。
要約すると、ここで詳述するプロトコルは、OA病理を調査したり、治療介入を評価するための厳格で再現可能な半自動化された定量的アプローチのための明確なガイドを提供する。
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Disclosures
なし
Acknowledgments
私たちは、ペンステートミルトンS.ハーシー医療センターの比較医学部門のスタッフと分子および組織病理学コアの支援を認めたいと思います。資金源:NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1(F.K.)、ANRF関節炎研究助成金(F.K.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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