Summary
이 문서는 최소 침습 적 접근을 사용하여 쥐에 있는 심근 허혈 및 후속 만성 재관전을 능력을 발휘하는 능률적인 방법을 제시합니다. 또한, 쥐의 좌심실 혈역학 적 기능은 에코카예그래피와 고립 된 작업 심장 방법에 의해 평가됩니다.
Abstract
심근 경색 (MI)은 전 세계적으로 이환율과 사망률에 주요 기여자로 남아 있습니다. 따라서 이 주제에 대한 연구는 필수입니다. 더 많은 통찰력과 근본적인 병리학적 변화에 대한 더 나은 이해를 얻기 위해서는 쉽고 재현 가능한 MI 유도 절차가 필요합니다. 이 절차는 또한 급성 MI, 후속 리모델링 및 심부전 (HF)에서 새롭고 유망한 치료 (약물 또는 내정간섭으로)의 효과 또는 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 동물의 삽관 및 수술 전 준비 후, 이소플루란을 가진 마취 프로토콜이 수행되었고, 외과 적 시술을 신속하게 수행했다. 최소 침습적 접근법을 사용하여 왼쪽 전방 내림차순 동맥(LAD)은 합자에 의해 위치되고 가려졌다. 폐색은 후속 재퍼퓨전 (허혈/재퍼퓨전 상해)에 대해 급성으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 혈관은 만성 MI, 리모델링 또는 HF의 개발을 조사하기 위해 영구적으로 결찰될 수 있다. 일반적인 함정에도 불구하고 드롭 아웃 비율은 최소화됩니다. 원격 허혈성 컨디셔닝과 같은 다양한 치료법은 수술 전, 페리 및 수술 후 심장 보호 잠재력을 검사 할 수 있습니다. 마취가 정밀하게 통제되고 작동 기간이 짧기 때문에 수술 후 회복은 빨랐습니다. 수술 후 진통은 3 일 동안 투여되었다. 최소 침습 절차는 감염과 염증의 위험을 감소시킵니다. 또한 신속한 회복을 용이하게 합니다. "작업 심장" 측정은 ex vivo를 수행하고 프리로드, 애프터로드 및 흐름을 정밀하게 제어할 수 있었습니다. 이 절차에는 적절한 성능을 위해 특정 장비와 교육이 필요합니다. 이 원고는 이러한 측정을 수행하기 위한 자세한 단계별 소개를 제공합니다.
Introduction
발병률이 지속적으로 감소하고 있지만 급성 심근 경색(MI)은 여전히 전 세계적으로 사망률및 사망률에 큰 기여를 하고있다. 급성 MI를 예방하고 치료하는 약물 또는 외과 적 절차로 잠재적 인 치료의 효능을 평가하는 데 제한이 있습니다. 그들의 효력이 인간에서 검토될 수 있기 전에, 이 처리는 동물에 있는 생체 내 검사를 포함하여 사전에 리스크를 위해 시험되어야 합니다. 생체 조건에서 보다 병 리를 공부 하는 더 좋은 기회가 있다. 따라서, 쥐 또는 마우스, 심지어 큰 동물 모델(돼지 또는 양)의 MI 유도는 관상 동맥 및 주변 심근의 허혈으로 인한 단기(급성) 및 장기(만성) 변화에 대한 조사뿐만 아니라 심장 기능 장애로 인한 전신 변화에 대한 조사를 허용한다. 경색 크기는 이전에 주요 목표였지만, 최근에는 급성 MI 또는 허혈/재관류 손상뿐만 아니라 연속적인 심부전(HF)에서 심장 리모델링 과정이 큰 관심을 받고 있습니다. 따라서 일관된 결과에 도달하기 위해서는 비교가능하고 쉽게 재현할 수 있는 방법이 필요합니다.
MI를 얻기 위해 극저온 절제의 사용이 보고되었지만2,우리의 방법은 조사관이 단일 스티치 결찰에 의해 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)을 가리켜다른 연구를 기반으로합니다. (hemi-) sternotomy 절차에 비해, 이 문서에 제시될 최소 침습적 접근은 수술 후 더 빠른 복구를 허용하고 현저하게 작동 시간을 감소시킵니다. 다른 외과 적 절차의 일반적인 단계는 심장 스티치3을수행하기 위해 흉부에서 심장의 리프트 아웃입니다. 이 메서드의 접근 방식은 이 단계를 불필요하게 만듭니다. 프로토콜에 따라, 두 가지 다른 절차를 수행 할 수 있습니다: 정의 된 시간에 걸쳐 허혈 / 재퍼퓨전을 유도하는 지혈대를 사용하여 임시 폐색; 또는 합자를 고정하여 동맥의 영구 폐색. 폐색의 성공은 심전도(ECG) 및 좌심실(LV)의 거시적 변화뿐만 아니라 그 팔로잉으로 평가될 수 있다.
수술 전에 또 다른 중요한 단계는 삽관입니다. 대부분의 경우, 관관은 기관 절제술을 통해 또는 목구멍의 피부 절개에 의해 시야 하에서 튜브의 구강 삽입을 통해 수행되지만, 이 프로토콜은 수술 후 호흡 곤란 이나 감염을 감소시키는 마취 동물의 내결핵 삽관을 설명합니다4,,5. 수술 후 합병증을 피하기 위해 흉부에서 주사기를 통해 공기가 제거되어 가슴을 닫습니다.
이 문서의 두 번째 과제는 고립 된 작업 심장 실험 모델을 통해 혈역학 적 기능의 평가, 우리 연구소 내의 다른 프로젝트에서 어떻게 사용되는지6,,7. 에코카디노피, 심장 자기 공명 영상(MRI) 및 압력 볼륨 루프의 침습적 정량화는 생체 내에서 심장 기능을 평가하는 잘 알려져 있고 널리 사용되는 방법이지만, 몇 가지 한계가 있는 것으로 알려져 있습니다. 심장의 글로벌 기능 또는 특정 매개 변수를 검사하기 위해 카테터를 사용하는 것과 같은 침습적 접근법은 일반적으로 사용되며 심장 측정의 금 본위제입니다. 대조적으로, 전 생체 내 작업 심장 장치는 복잡성과 비용 때문에 거의 사용되지 않습니다. 성공적인 평가에 중요한 심장의 적당한 수양에 퍼서막이의 혼합물에서 많은 중요한 측면이 있습니다. 고립 된 작업 심장 장치는 먼저 18978 년 오스카 랑겐도르프에 의해 설명되었으며 최근 수십 년 동안 수정되었습니다9. 랭엔도르프(LD) 모드와 작업 심혼(WH) 모드의 두 가지 모델이 사용됩니다. 우리의 연구에서, LD 모드는 새로운 환경에 마음을 적응하는 데 사용됩니다 (약 15 분). 이 모드에서는 심장이 대동맥을 통해 캔누징되고 관상 동맥은 심근을 적절히 공급하여 전방으로 침투합니다. LD 모드에서는 심장이 압력 볼륨 작업을 수행하지 않습니다. 대조적으로, WH 모드에서, 왼쪽 심방은 폐 정맥을 통해 수거되며, 이를 통해 난투가 왼쪽 아트리움으로 들어갑니다. 그런 다음 심장은 미리 정의된 후부하에 대해 생리적으로 이 난투를 펌핑합니다. 시간이 지남에 따라 후부하를 증가시킴으로써 심장 기능을 지속적으로 측정할 수 있습니다. 관상 동맥 흐름, 심장 출력 (CO), 뇌졸중 부피 (SV) 및 작업, 심방 흐름 및 LV 수축기 및 확장기 압력과 같은 매개 변수를 측정 할 수 있습니다. 다양한 치료법이 직접적으로 그리고 전적으로 심장에 미치는 영향은6,,10을조사할 수 있다. 랴오와 포데서9에 의한 검토는 MI, HF, 비만 및 당뇨병과 같은 다양한 질병의 탐구뿐만 아니라 심장 기능 및 신진 대사에 대한 약리학적 효과의 평가에서이 방법의 광범위한 사용을 제시했다.
요약하자면, 이 프로토콜은 생체내에서 MI 또는 심근 허혈/재퍼퓨전(MIR) 부상을 수행하는 재현 가능한 방법을 제시한다. 또한 MI 후 격리된 쥐 심장에 LV(dys-) 기능의 특성화를 허용한다. 이 프로토콜은 치료와 분석의 독특한 조합을 제공합니다.
Protocol
이 문서에 설명된 결과를 전달한 실험 프로토콜은 비엔나 의과 대학과 오스트리아 연방 교육과학부(BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016)의 실험실 동물 실험 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 미국 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 된 1996)에 의해 간행된 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다.
참고 : 10-12 주 된 남성 스프라그 Dawley 쥐 250-300 g 체중 (BW)이 사용됩니다. 수술실(OR)의 멸균 환경에서 다음과 같은 절차와 트리트먼트를 수행하므로 동물을 다룰 때 스크럽, 장갑, 페이스 마스크 및 후드를 착용하십시오. OR에 들어가기 전에 손을 씻고 소독해야 합니다. 외과 세션에서 여러 동물에서 작동하거나 세척 및 소독하거나 수술 사이에 악기를 자동 복제하려는 의도가 있는 경우. 이러한 위생 지침은 프로토콜 섹션에 제시된 모든 절차에 대해 유효합니다.
1. 수술 전 준비 및 마취
- 자일라진 (4 mg/kg BW) 및 케타민 (100 mg/kg BW)의 혼합물을 주입하 여 수술 전 마취를 시작 합니다.
- O2,공기 및 이소플루란 (1-2.5%)의 혼합물로 14 G 튜브 및 부피 제어 환기로 쥐를 삽관하십시오. 에서 75-85 스트로크 /분, 100 mL / 스트로크 / BW(그림 1A). 필요한 경우, 삽관하는 동안 더 나은 보기: 현지 휴식을 위해 낮은 인두에 면모 팁을 통해 실로카인을 적용하십시오.
- 가열된 수술대에 쥐를 놓고 테이프로 앞다리를 고정시다(도1B).
- 프로브를 통해 직장 온도를 측정합니다.
참고: 37.5-38.5°C 사이에서 유지관리해야 합니다. - 흉부를 면도하고 방부제 포비도요오드 용액으로 작동 영역을 청소하십시오. 눈의 건조를 방지하기 위해 쥐에 눈 연고를 적용합니다.
- 피리트라미드(0.1 mL/kg BW)를 인과간으로 주입하여 수술 중 항간증을 투여합니다.
- 심전도 프로브를 동물의 사지에 피하로 배치합니다.
- 수술 절차를 개시하기 전에 꼬리와 발가락 반사 신경을 확인하십시오.
2. 외과 적 절차 - 심근 허혈유도
- 메스를 사용하여 피부 절개를 수행합니다. 제3간 늑간 공간의 수준에서 왼쪽 흉부에서 2mm 파라스테랄을 시작하고 5차 늑간공간(그림 1C)의수준에서 전방 축실선을 계속 유지한다.
- 피상적 근육을 부드럽게 교체하여 갈비뼈를 보이게하십시오(그림 1D).
- 경미한 출혈의 경우 소터를 사용하여 소터를 사용하여 말살하거나 주변 조직을 분리하십시오.
- 4차 늑간 공간 수준에서 흉부 절제술을 수행하고 심혼과 폐의 가시성을 얻기 위해 리트랙터를 삽입한다(도1E). 출혈을 피하기 위해 흉막을 조심스럽게 엽니다.
- 일시적으로 정해진 시간에 걸쳐 허혈/재퍼퓨전(MIR)을 유도하기 위해 지혈대를 사용하여 LAD를 폐색; 또는 영구적으로(MI)는 6-0 봉합사를 사용하여 6-7 노트를 만들어 결찰을 닫는다(도1F, G)를이용하여 이를 가리키게 한다.
참고 : LAD의 폐색에 대한 오른쪽 자리는 심장의 복부 / 왼쪽 측면 마진에 왼쪽 오리클 아래 약 2-3 mm에 위치하고 있습니다. 성공적인 폐색은 심전도 변화(ST 세그먼트 고도) 및 LV의 거시적 변화와 관련이 있습니다. - 허혈/재퍼퓨전 모델의 경우, 폐색 30분 후 지혈대를 제거하여 LAD를 다시 엽니다.
- 4-0 싱글 모노필라멘트 봉합사(그림1H)를사용하여 3개의 단일 버튼 봉합사로 흉부를 닫습니다. 마지막 봉합사를 조이기 전에, 폐렴을 방지하기 위해 10mL 주사기로 흉부에서 잔류 공기를 제거합니다(도1I).
- 근육을 재배치하고 휘발성 마취를 끕니다.
- 4-0 봉합사를 사용하여 연속 봉합사로 피부를 봉합합니다(도 1J).
- 쥐에 의한 봉합사의 감염과 물기로부터 보호하기 위해 방부제 스프레이를 투여하십시오.
3. 수술 후 치료 및 배제 기준
- 쥐가 깨어날 때까지 가열 테이블에 쥐를 유지합니다. 쥐가 자발적으로 호흡을 시작하자마자 쥐를 추방한다.
- 식히기 위해 가열 램프 아래에 있는 케이지에 욕조를 넣습니다.
- 그들은 다시 정상적으로 행동을 시작할 때 표준화 된 조건에서 동물 집에 쥐를 반환합니다.
- 피리트라마이드 2암페어와 수술 후 진통을 위해 250mL의 5% 포도당을 3일 간 추가합니다.
- 체크리스트 및 제외기준(표 1)을통해 쥐의 체력과 행동을 확인합니다. 다음 주에 하루에 두 번, 일주일에 두 번 동물을 관찰하십시오.
참고: 국제 표준에 따라, 치료 관련 결정을 내리기 위해 수의사에게 체크리스트와 평가에서 최대 6점을 얻는 고통받는 동물 또는 동물을 제시합니다. 7점 이상을 획득한 동물은 케타민과 자일라진을 과다 복용하여 즉시 희생해야 합니다.
| 시험 | 관찰 | 평점 |
| 체중 | 안정적인 | 0 |
| 10% 손실 | 4 | |
| 48h에 대한 15 % 손실 | 7 | |
| 18% 손실 | 7 | |
| 보통(코트 플랫과 반짝) | 0 | |
| 외형 | 필로직기 | 1 |
| 혈종종 | 2 | |
| 피부 상처/상처/물린 자국 | 2 | |
| 심하게 감소 된 그루밍 | 4 | |
| (오리프스 부정/응고 또는 촉촉함) | 7 | |
| 심한 피부 자극 또는 상처 | 7 | |
| 구부러진 자세 >2 h | 7 | |
| 상당한 복부 팽팽 (선동) | 7 | |
| 동작 | 정상(수면, 호기심, 사회적 접촉, 접촉 시 반응) | 0 |
| 비정상적인 행동(예: 장애인 활동) | 2 | |
| 자기 격리, 발음 과잉 행동 또는 스테레오티피니아 | 4 | |
| 혼수부아용 &6 h | 4 | |
| 6 시간 ~ 8 h용 무기력증 | 7 | |
| 무관심 >8 h | 7 | |
| 스테레오티피니아 에 대한 중단없이 >10 분 과 여전히 2 시간 후 지속 | 7 | |
| 만졌을 때 통증의 징후 | 7 | |
| 자동 절단 | 7 | |
| 소화 | 정상적인 | 0 |
| 설사 (부드러운 대변) | 3 | |
| 설사 용 72 h 또는 물 | 7 | |
| 피 묻은 대변 | 7 |
표 1: 체크리스트 및 제외 기준. 이 표에는 관찰해야 하는 시험과 해당 점수가 포함되어 있습니다. 따라서 동물의 수술 후 치료는 적응해야 하며 수의사를 상담해야 합니다.
4. 에코카디그래피 측정
참고: 에코카르디그래피는 일반적으로 MI의 유도 전과 장기가 수확되기 전에 두 번 수행됩니다.
- 자일라진 (4 mg/kg BW) 및 케타민 (100 mg/kg BW)의 혼합물로 쥐를 주입하소서.
- 쥐를 가열 트레이에 수핀 위치에 놓습니다. 초음파가 더 잘 이동하고 신호 간섭을 줄이는 데 도움이되는 가슴에 에코 젤을 적용하십시오.
- 유두 근육의 수준에서 LV 캐비티의 파라서탈 짧은 축 보기를 가져옵니다.
- 왼쪽 심실 방출 분획 및 형태학을 측정하기 위해 M 모드 에코카르디오그래피를 수행합니다.
5. 장기 수확 (작업 심장없이)
- 간 수확 전에 자일라진 (4 mg /kg BW) 및 케타민 (100 mg /kg BW)을 관리하십시오. 반사 신경이 음수인지 확인합니다.
참고: 절차가 1분 이상 지속되지 않으므로 삽관이 필요하지 않습니다. - 메스를 사용하여 xiphoid 아래에 피부 절개를 하고 가위를 사용하여 양쪽의 갈비뼈와 평행하게 확장하십시오.
- 전두엽 축선에서 갈비뼈를 자르고 가슴을 들어 올리기 위해 xiphoid를 잡습니다(그림 2A).
- 조심스럽게 집게의 두 쌍으로 조직을 파열하여 해부학적 또는 섬유 조직 접착을 제거합니다.
- 5mL 주사기를 가진 베나 카바 열등에서 혈액 샘플 (혈액 가스 평가 또는 분자 분석을 위해)를 취하십시오.
- 입구 및 출구수준(도 2B)에서전체 심장의 절개를 수행합니다. 필요한 경우 섹션 6에 설명된 대로 심장 평가를 진행하십시오.
- 수확 기관, 충격 서리 액체 질소에 그들을 저장 하 고 추가 분자 분석을 위해 -80°C에 저장, 또는 조직학적 목적을 위해 포름알데히드에.
6. 작업 심장 시스템을 통한 Ex vivo 혈역학 측정
참고: 장치의 일반적인 설정 및 구성 요소는 이전에11에설명되어 있다. 다음 프로토콜은 동물의 심장 처리와 LV 기능을 평가하는 데 필요한 단계를 설명합니다.
- 단계 5.1에 기술된 바와 같이 쥐를 마취하고 정맥내 (대퇴 정맥)의 200 IU를 주입합니다.
- 메스가 있는 코스트 아치 아래 절개를 통해 흉부를 열고 가위를 가진 전방 축축선으로 확장하고 흉골을 상승시킵니다.
- 콘센트 나 입구 근처의 큰 혈관을 심장에 잘라 내어 소비합니다(그림 2B).
- 얼음차가운 크렙스-헨셀레이트 버퍼에 심장을 침전하고 대동맥(그림3A)을통해 적혈구가 퍼진 분리된 심장 시스템에 장착한다.
- 60mmHg(안정화 기간)의 일정한 후부하로 LD 모드로 시작합니다.
- LD 모드15분 후 WH 모드로 전환합니다. 따라서, 폐정맥(도 3B)을통해 좌심통을 칸테레이한다. 그런 다음 심방 캐뉼라를 가리는 클립을 열어 시스템의 흐름 방향을 변경합니다. 이것은 왼쪽 심방의 관류 및 왼쪽 심장에 있는 생리적인 혈류 를초래한다 (11).
- WH 모드에서 20분 동안 혈역학 측정값을 기록합니다.
- 관상 동맥 흐름을 측정하기 위해 2 mL 주사기로 관상 동맥의 혈액 방울을 수집합니다 (CF, mL / 분) 매 5 분마다.
참고: CF는 왼쪽 심방 흐름(LAF)과 대동맥 흐름(AF)의 차이로 측정됩니다. - 유량 프로브를 사용하여 LAF(심장 출력에 해당) 및 AF의 연속 측정을 수행합니다.
참고: 프로브는 WH 장치를 통해 LV로 삽입됩니다. 모든 데이터는 지속적으로 등록됩니다. - 진행 중인 프로토콜이 요청하는 경우 대동맥 밸브를 통해 역행하여 고충실도 카테터를 LV에 삽입하고 좌심실 수축기 압력(LVSP)을 측정합니다.
- 분당 수행되는 압력-볼륨 작업을 평가하려면 심장 출력을 심박수로 나눈 결과 뇌졸중 볼륨을 계산합니다.
- 다음 공식에 따라 외부 심장 작업(EHW)을 계산합니다: CO x LVSP(g x m/min)는 심장 무게로 정규화됩니다.g
Representative Results
필즈 외6에의해 다음과 같은 결과가 발표되었습니다. 이 정확한 외과 적 수술로 원격 허혈성 perconditioning (RIPerc)의 심장 보호 효과를 조사 할 수 있습니다. 이것은 급성 MI 또는 MIR 및 후속 심실 리모델링으로 고통받는 환자를 위한 잠재적인 새로운 치료법으로, 많은 경우 연속 HF로 이어집니다. 이 프로토콜에서, 동물은 REperfusion (즉, MIR)에 선행된 LAD 폐색의 30 분을 복종하였다.
절차의 재현성을 증명하기 위해 조직학적 상처및 얼룩이 수행되었습니다(그림4A). MIR+RIPerc 치료 동물의 섬유성 흉터가 샴 동물의 흉터 형성과 비교할 수 있는 반면 샴과 미르 그룹 간의 섬유증 비교는 유의한 것이분명했다(도 4B). 추가적으로, MIR+RIPerc 처리한 동물은 MIR 처리한 동물에 비교된 현저하게 감소된 섬유증을 보여주었습니다. 그러나, 대표적인 조직학적 이미지는 MIR군(도 4A)에서경색이 명시적으로 유지되기 때문에 이 외과적 수술의 효능을 명확히 한다. 생체 내 초음파, 배출 분획, LV 종기 확장기 및 종단 수축기 직경(LVEDD 및 LVESD)을 사용하여 혈역학 파라미터가 RIPerc(도4C-F)에의해 보존되는 동안 MIR 치료로 인한 심장 기능을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.Figure 4C EX vivo 혈역학 데이터는 MIR 그룹이 LVSP, 심장 출력(CO), 뇌졸중 부피(SV) 및 외부 심장 작용(EHW)(도5A−G)에서현저한 감소를 보였기 때문에 절차의 효과를 나타냈다.
이 외과 적 절차에 대한 문헌 검색은 적절하게 수행 되었을 때 부정적이거나 만족스럽지 못한 의견과 결과를보고하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 소개와 토론에 언급 된 함정을 방지 할 필요가 있으며, 교육은 안정적인 수준의 성능을 얻고 유사한 결과를 얻기 위해 필수입니다.
도 1: 수술 전 준비 및 외과 수술. (A)14 G 튜브를 사용하여 동물의 삽관. (B)외과 분야의 수핀 위치 및 소독. (C)피부 절개 (제 3 늑간 공간의 수준에서 왼쪽 흉부에 2mm 파라스테랄). 절개는 5차 늑간 공간의 수준에서 전방 축산선에 도달해야 한다. (D)갈비뼈가 보이도록 근육을 대체합니다. (E)흉부의 개통. (F)6-7 노트를 사용하여 LAD의 영구 폐색. (G)지혈대를 사용하여 LAD의 일시적인 폐색. (H)골비 주변에 3개의 단일 매듭 봉합사를 배치하여 심근 허혈 및 재관류 후 가슴의 폐쇄. (I)흉부의 적절한 폐쇄. 마지막 매듭을 단단히 고정하기 전에 흉부에서 잔류 공기를 제거하기 위해 10 mL 주사기를 사용합니다. 이것은 기압을 방지하기 위해 필수적입니다. (J)피부 봉합사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장기 수확. (A)서브 시포달 컷으로 가슴을 열고 중간 축산선으로 확장합니다. 갈비뼈를 통해 추가 컷은 흉골의 리프팅을 용이하게하기 위해 수행됩니다. (B)심장의 절제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 격리된 심장 장치. (A)랑엔도르프 모드. 심장은 대자의 캐니언을 통해 WH 장치에 장착된다. (B)작업 심장 모드. 이 시스템은 왼쪽 아트리움을 캐너레이터하여 심장 기능을 평가하기 위해 WH 모델로 전환할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 흉터 형성, 좌심실 기능 및 리모델링에 대한 원격 허혈 조절의 효과. (A)심근 후 레퍼퓨전 14일째에 수확한 조직학적 LV 슬라이스. (B)바 그래프에서 섬유증의 정량화 된 결과. (C)대표적인 M 모드 심초음파. (D)배출 분획(EF)을 막대 그래프로 정량화합니다. (E)LV 종단 수축기 직경(LVESD)은 바 그래프로 정량화된다. (F)LV 단장 확장기 직경(LVEDD)은 바 그래프에서 정량화됩니다. MIR, 심근 허혈 -재관전; RIPerc, 원격 허혈성 perconditioning. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. * p & 0.05; **p< 0.01; p < 0.001. 엘스비어의 허락을 받아 필즈 외6에서 전재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: RIPerc가 LV 혈역학 기능에 미치는 영향. (A)LV 수축기 압력(LVSP),(B)심장 출력(CO), 및(C)뇌졸중 부피(SV) 결과는 14일째심근 후 레퍼퍼퓨전일동안 고립된 작업 심장으로부터 얻어졌다. (D)CO는 애프터로드의 함수로 묘사된다; (F)외부 심장 작용은 애프터로드의 함수로서, 정량화된 결과 바그래프(E 및 G). 데이터는 그룹당 평균 ±SEM 및 n=4-7로 표현됩니다. *p&05; **p< 0.01; p < 0.001. MIR, 심근 허혈/ 재관전; RIPerc, 원격 허혈성 사전 조절; EHW, 외부 심장 작업; SV, 스트로크 볼륨; AUC, 곡선 아래 영역. 엘스비어의 허락을 받아 필즈 외6에서 전재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
불리한 리모델링 포스트 MI는 심부전의 발달에 있는 중요한 기계장치로 여겨질 것입니다. 따라서 심혈관 연구의 연속성을 보장하기 위해 실험 절차와 기술을 재현할 수 있어야 합니다. 이해하기 만하고 명확하게 정의된 실험 프로토콜은 재현성의 기본 요소입니다. 재현성은 여러 과학자에 의해 반복될 수 있고 실험실 에서 검증되는 결과를 말합니다. 이 연구는 만성 또는 재침투 MI를 유도하고 쥐에 있는 심장 혈역학 기능을 평가하기 위하여 반 최소 침습적인 방법을 제시하는 것을 겨냥했습니다.
이러한 결과 및 추가 게시 된 데이터는이 수술 방법의 높은 힘과 MI, 리모델링 및 HF에 대한 연구에서의 중요성을 보여줍니다. 허혈/재관류 손상은 후속 재관전을 통해 MI의 변화를 이해하는 데 사용될 수 있지만, 영구적인 폐색은 심근의 단기 및 장기 리모델링 과정을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다. 그밖 외과 접근은 더 많은 조직 손상을 일으키는 원인이 되고 동물은 감염 및 기퇴 호르몬을 개발의 더 높은 리스크를 보여줍니다, 더 높은 탈락 비율의 결과로. 대조적으로, 이 절차는 설치 및 취급에 있는 특정 개선에 의하여 사망을 감소시키는 것을 목표로 합니다. 또한, 그들은 불안정한 LAD 폐색으로 인해 섬유성 흉터 확장의 변화를 보여줍니다.
우리의 프로토콜은 전체 절차의 가장 중요한 단계 중 하나 인 삽관에 대한 쉬운 방법을 제공합니다. 다른 여러출판물(12)과는달리, 기관 절제술은 우리의 절차에서 수행되지 않습니다. 이것은 동물이 수술 후 측정을 겪기 전에 이 외과 절차에 의한 병리학적 변화의 발달로 이끌어 내는 수술 후 동물의 각성 그리고 재활을 향상시킵니다. 분명히, 그것은 비 생존 프로토콜 인 경우, 기관 절제술은 비전에서 수행되므로 수행하기 가 더 쉽습니다. 또한 생존 프로토콜에서 기관 절제술을 닫는 것은 적용되지 않습니다. 흉부가 열리면 붕괴를 방지하기 위해 폐를 환기시키는 것이 필수적입니다. 따라서, 쥐는 외과 적 수술 전에 삽관된다. 최소 침습 적 접근법은 흉부의 컴팩트함과 안정성을 유지하므로 갈비뼈 또는 흉골을 절단하지 않습니다. 따라서 동물의 회복이 개선되고 자발적인 기발이나 출혈의 위험이 상대적으로 낮습니다.
앞서 언급했듯이, 삽관은 명확한 장점이지만, 수행하기 어렵고 실험 초기에 더 높은 탈락률을 유발할 수 있다. 이 문제는 훈련과 해부학 적 지식으로 완화 될 수 있습니다. 튜브를 직각으로 삽입하고 빛이 보컬 입술을 통해 빛날 때까지 동물의 몸을 스트레칭하는 것이 중요하며, 그 후에 튜브를 부드럽게 앞으로 밀어 낼 수 있습니다. 이 건반의 붓기, 후속 폐색및 질식을 일으킬 수 있으므로 보컬 입술을 해치지 않도록주의하십시오.
LAD가 올바르게 계합되는 것도 중요합니다. 작은 수술 창, 빠른 박동 심장, 그리고 환기 폐 (모든 접촉이 폐출혈을 초래할 수 있으므로 가능한 한 많이 만지지 마십시오) 혈관이 명확하게 보이지 않게 렌더링합니다. 따라서 해부학적 지식은 필수불가결합니다. 왼쪽 auricle위험에 두 영역을 표준화 하 고 LAD 주위 결찰을 배치 하는 데 필수적이다. 스티치는 병리학적 과정으로 인한 것이 아닌 LV 챔버 직경 및 부피의 감소를 일으킬 수 있으므로 LV에서 교원적으로 수행되어야 합니다. 성공적인 폐색은 심전도에 ST 세그먼트의 위험 및 고도에 심근 영역의 시안화와 연관된다. 이 절차의 주요 제한사항은 봉합사의 올바른 위치 지정입니다. 비교 가능한 결과를 얻으려면 바늘은 동일한 수준에 있어야하며 비슷한 양의 조직을 사용해야합니다. 이것은 훈련의 높은 수준을 필요로하고 동물의 다른 무게를 고려해야합니다. 고려해야 할 또 다른 점은 늑간 공간이 폐쇄되기 전에 기발면을 적절히 제거하는 것입니다. 이것이 정확하게 수행되지 않는 경우에, 동물은 왼쪽 폐의 인플레이션이 기질에 의해 방해될 것이기 때문에 호흡에 있는 어려움을 전시할 것입니다. 앞서 언급했듯이, 이것은 주사기를 사용하여 흉부에서 잔류 공기를 제거함으로써 완화될 수 있다.
현재, 이 MI 절차는 중요한 단계가 높은 정밀도로 수행되는 경우에 비교 가능한 결과 및 높은 생존율을 보장하는 일반적으로 이용되는 방법입니다. MI, HF 또는 심장 리모델링의 다양한 치료, 장치 또는 약물에 대한 향후 프로젝트는 이 최소 침습 기술을 수행함으로써 평가될 수 있다.
WH 측정은 전술한 바와 같이 유지 보수 및 처리에 일반적으로 사용되지 않는 특정 장비와 지식이 필요합니다. 대표적이고 유사한 데이터를 획득하려면 함정을 피해야 합니다. 가장 중요한 단계는 심장을 장착하고 D 모델에서 WH 모드로 전환하는 것입니다. 심장이 적절히 절제되지 않으면, 장치에 심장을 고치기 위해 충분한 대동맥 조직 길이가 필요하므로 장착이 어려울 수 있다. LD 모드에 연결한 직후, 심혼 빈도는 감기 완충제의 세척, 신체의 생리자극의 단절 또는 장치에 의한 다른 종으로부터의 혈액과의 재관류로 인해 감소될 수 있다. 이러한 경우, 심박조율기를 생리적 주파수를 복원하고 보존하기 위해 적용되어야 합니다. 이것은 모든 동물에서 비교 결과를 보장합니다. 장치 내의 혈액량이 쥐의 생리적 부피의 배수이기 때문에, 크렙스-헨셀레이트 완충제 계현탁에서 소적혈구가 사용된다.
LD 모드에서 WH 모드로의 전환은 수동에서 활성 심장 작업으로의 전환에 동의어입니다. LD 모드는 새로운 환경에 마음을 익숙해지는 데 사용됩니다. WH 모드에서 는 심장이 생리적 배출 기능을 수행해야 합니다. 따라서 사후 부하를 증가시킴으로써 평가 전에 새로운 상황에 대한 짧은 적응 단계가 요구된다.
일반적으로 잊혀진 또 다른 중요한 단계는 장치 및 perfusate의 적절한 준비 및 유지 보수입니다. 각 화합물의 정확한 부피는 혼합되어야 하며 시스템 내의 온도를 제어하고 조정해야 합니다. 그럼에도 불구하고 WH는 심장 출력, 뇌졸중 부피, 좌심실 수축기 압력 및 관상 동맥 흐름을 동시에 평가하는 우아한 방법입니다.
이러한 매우 재현 가능한 절차는 WH 장치에 의해 획득한 MI 및 대표 데이터를 유도하여 자신의 능력을 스스로 증명하고 있다. 반 최소 침습 적 접근 방식, LAD 폐색 및 삽관 방법의 수준은 경색 크기의 빠른 회복과 낮은 가변성을 용이하게합니다. 또한, 고립 된 작업 심혼에 있는 심장 기능 분석은 귀중한 혈역학 결과를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그들의 기여, 기술 지원, 귀중한 입력 및 조언에 대한 생물 의학 연구 센터의 운영 극장 팀과 기술자에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 루드비히 볼츠만 연구소, 심장 혈관 연구 클러스터 (REM 프로젝트)에 의해 투자됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
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