Summary
Denne artikkelen presenterer en effektiv metode for å utføre myokardiskemi og påfølgende kronisk reperfusjon hos rotter ved hjelp av en minimal invasiv tilnærming. I tillegg er venstre ventrikulær hemodynamisk funksjon av rotter vurdert av ekkokardiografi og isolerte arbeidende hjertemetoder.
Abstract
Hjerteinfarkt (MI) er fortsatt den viktigste bidragsyteren til sykelighet og dødelighet over hele verden. Derfor er forskning på dette emnet obligatorisk. En enkel og svært reproduserbar MI induksjonsprosedyre er nødvendig for å få ytterligere innsikt og bedre forståelse av de underliggende patologiske endringene. Denne prosedyren kan også brukes til å evaluere effekten eller styrken av nye og lovende behandlinger (som legemidler eller intervensjoner) ved akutt MI, påfølgende ombygging og hjertesvikt (HF). Etter intubasjon og preoperativ forberedelse av dyret ble det utført en bedøvelsesprotokoll med isofluran, og den kirurgiske prosedyren ble utført raskt. Ved hjelp av en minimal invasiv tilnærming ble den venstre fremre synkende arterien (LAD) plassert og okkludert av en ligatur. Okklusjonen kan utføres akutt for etterfølgende reperfusjon (iskemi/reperfusjonsskade). Alternativt kan fartøyet bli bestått permanent for å undersøke utviklingen av kronisk MI, ombygging eller HF. Til tross for vanlige fallgruver, er frafallet minimale. Ulike behandlinger som ekstern iskemisk kondisjonering kan undersøkes for deres kardiobeskyttende potensial pre-, peri- og postoperativt. Den postoperative utvinningen var rask da anestesi var nøyaktig kontrollert og varigheten av operasjonen var kort. Postoperativ analgesi ble administrert i tre dager. Den minimalt invasive prosedyren reduserer risikoen for infeksjon og betennelse. Videre forenkler det rask gjenoppretting. "Arbeidshjerte"-målingene ble utført ex vivo og aktivert nøyaktig kontroll av forhåndsbelastning, etterbelastning og flyt. Denne prosedyren krever spesifikk utstyr og opplæring for tilstrekkelig ytelse. Dette manuskriptet gir en detaljert trinnvis innføring for å gjennomføre disse målingene.
Introduction
Selv om forekomsten avtar kontinuerlig, er akutt hjerteinfarkt (MI) fortsatt den viktigste bidragsyteren til sykelighet og dødelighet over hele verden1. Det er restriksjoner på evaluering av effekten av potensielle behandlinger som legemidler eller kirurgiske prosedyrer som forebygger og behandler akutt MI. Før deres effekter kan undersøkes hos mennesker, må disse behandlingene testes for risiko på forhånd, inkludert in vivo undersøkelser hos dyr. Det er ingen bedre mulighet til å studere en patologi enn under in vivo forhold. Derfor tillater MI induksjon hos rotter eller mus og til og med store dyremodeller (griser eller sauer) undersøkelse av korte (akutte) og langsiktige (kroniske) endringer på grunn av iskemi i koronararteriene og det omkringliggende myokardiet, samt systemiske endringer på grunn av nedsatt hjertefunksjon. Infarkt størrelse var tidligere hovedmålet, men mer nylig påfølgende hjerte ombygging prosesser i akutt MI eller iskemi / reperfusjon skade samt i påfølgende hjertesvikt (HF) har blitt av stor interesse. Derfor er en sammenlignbar og lett reproduserbar metode nødvendig for å nå konsistente resultater.
Mens bruken av kryo-ablasjon for å få MI har blitt rapportert2,bygger vår metode på andre studier der forskere okkluderer venstre fremre synkende arterie (LAD) av en enkelt sting ligation. I forhold til (hemi-)sternotomy prosedyrer, minimalt invasiv tilnærming som vil bli presentert i denne artikkelen, tillater en raskere postoperativ utvinning og markert reduserer driftstiden. Et vanlig trinn i andre kirurgiske prosedyrer er opphevingen av hjertet fra thoraxen for å utføre hjertesømmen3. Tilnærmingen til denne metoden gjør dette trinnet unødvendig. Avhengig av protokollen kan to forskjellige prosedyrer utføres: en midlertidig okklusjon ved hjelp av en turniquet for å indusere iskemi / reperfusjon over en definert tid; eller en permanent okklusjon av arterien ved å fikse ligaturen. Suksessen til okklusjon kan evalueres med elektrokardiogram (EKG) og de makroskopiske endringene i venstre ventrikkel (LV) samt paling.
Et annet viktig skritt før operasjonen er intubasjon. Mens i de fleste tilfeller utføres intubasjon via trakeotomi eller via oral innsetting av røret under syn av et hudsnitt i halsen, beskriver denne protokollen endotrakeal intubasjon av det bedøvede dyret som reduserer pustevansker eller infeksjoner postoperativt4,5. For å unngå postoperative komplikasjoner fjernes luft fra thoraxen via en sprøyte før brystet lukkes.
Den andre oppgaven med denne artikkelen er evalueringen av hemodynamisk funksjon via en isolert arbeider hjerte eksperimentell modell, hvordan den brukes i andre prosjekter i vårt institutt6,7. Mens ekkokardiografi, hjertemagnetisk resonansavbildning (MR) og invasiv kvantifisering av trykkvolumløkker er velkjente og mye brukte metoder for å vurdere hjertefunksjon in vivo, er de kjent for å ha noen begrensninger. Invasive tilnærminger, for eksempel bruk av katetre for å undersøke den globale funksjonen eller spesifikke parametere i hjertet, brukes ofte og representerer gullstandarden for hjertemålinger. I motsetning er ex vivo arbeider hjerteapparatet sjelden brukt på grunn av sin kompleksitet og kostnad. Det er mange viktige aspekter, fra blandingen av perfusate til tilstrekkelig kannulation av hjertet, som er avgjørende for vellykket evaluering. Det isolerte arbeidshjerteapparatet ble først beskrevet av Oskar Langendorff i 18978 og har blitt modifisert i løpet av de sistetiårene 9. I dag er det to modeller som brukes: Langendorff (LD) modus og arbeidshjerte (WH) modus. I vår studie brukes LD-modusen til å akklimatisere hjertet til sitt nye miljø (ca. 15 min). I denne modusen er hjertet cannulated via aorta og koronararteriene perfunderes anterogradely, tilstrekkelig leverer myokardiet. I LD-modus utfører ikke hjertet noe trykkvolumarbeid. Derimot, i WH-modus, er venstre atrium cannulated via en lungevene, der perfusatet kommer inn i venstre atrium. Hjertet pumper deretter denne perfusate fysiologisk mot en forhåndsdefinert etterbelastning. Ved å øke etterbelastningen over tid, kan hjertefunksjonen måles kontinuerlig. Parametere som koronarstrøm, hjerteutgang (CO), slagvolum (SV) og arbeid, atriestrøm og LV systolisk og diastolisk trykk kan måles. Virkningen av ulike behandlinger direkte og utelukkende på hjertet kan undersøkes6,10. En gjennomgang av Liao og Podesser9 presenterte den utbredte bruken av denne metoden i evalueringen av farmakologiske effekter på hjertefunksjon og metabolisme, samt i utforskning av ulike sykdommer som MI, HF, fedme og diabetes.
Oppsummert presenterer denne protokollen en reproduserbar metode for å utføre MI eller myokardiskemi / reperfusjon (MIR) skade in vivo. I tillegg tillater det karakterisering av LV (dys-)funksjon på et isolert rottehjerte etter MI. Denne protokollen presenterer en unik kombinasjon av behandling og analyse.
Protocol
Den eksperimentelle protokollen som leverte resultatene som er beskrevet i denne artikkelen, er godkjent av den regionale etikkkomiteen for laboratoriedyreksperimenter ved Medical University of Vienna og det østerrikske føderale utdanningsdepartementet (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Alle eksperimenter samsvarer med veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr, utgitt av US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revidert 1996).
MERK: 10–12 uker gamle hann Sprague Dawley rotter på 250–300 g kroppsvekt (BW) brukes. Som følgende prosedyrer og behandlinger utføres i et sterilt miljø av et operasjonsrom (OR), bruk skrubber, hansker, ansiktsmasker og hetter når du håndterer dyr. Før du går inn i OR, må du kontrollere at hendene vaskes og desinfiseres. Hvis hensikten er å operere på flere dyr i en kirurgisk økt, enten vaske og desinfisere, eller autoklaver instrumentene mellom operasjoner. Disse hygieniske retningslinjene er gyldige for alle prosedyrer som presenteres i protokolldelen.
1. Preoperativ forberedelse og anestesi
- Initier preoperativ anestesi ved å injisere en blanding av xylazin (4 mg/kg BW) og ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt.
- Intuber rotter med en 14 G rør og volumstyrt ventilasjon med en blanding av O2,luft og isofluran (1−2,5%) ved 75−85 slag/min, 100 ml/slag/BW (figur 1A). Om nødvendig, for en bedre visning mens du intuberer: bruk Xylocain via en bomullsullspiss på det nedre svelget for å oppnå lokal avslapning.
- Plasser rottene på et oppvarmet operasjonsbord i liggende stilling og fest forbenene med tape (Figur 1B).
- Mål rektal temperatur med en sonde.
MERK: Den skal opprettholdes mellom 37,5–38,5 °C. - Barber thoraxen og rengjør driftsområdet med antiseptisk povidonjodinløsning. Påfør øyesalve på rotten for å forhindre tørking av øynene.
- Administrer intraoperativ analgesi ved å injisere piritramid (0,1 ml/kg BW) intraperitonealt.
- Plasser EKG-sonder subkutoust i ekstremiteter av dyret.
- Kontroller hale- og tåreflekser før du starter den kirurgiske prosedyren.
2. Kirurgisk prosedyre – induksjon av myokardiskemi
- Utfør hudsnitt ved hjelp av en skalpell. Sørg for å starte 2 mm parasternal på venstre thorax på nivået av tredje interkostalrom og fortsett til fremre aksillær linje på nivået av femte interkostalrom (Figur 1C).
- Bytt ut de overfladiske musklene forsiktig for å gjøre ribbeina synlige (Figur 1D).
- Ved mindre blødning, bruk en cauter for å utslette eller koble fra det omkringliggende vevet.
- Utfør thoracotomien på nivået av det fjerde interkostalromet og sett inn en retractor for å få synlighet av hjertet og lungene (Figur 1E). Åpne forsiktig pleuraen for å unngå blødning.
- Midlertidig okkludere LAD ved hjelp av en turniquet for å indusere iskemi / reperfusjon (MIR) over en definert tid; eller permanent (MI) okkludere det ved å lage 6-7 knop ved hjelp av en 6-0 sutur for å lukke ligation (Figur 1F, G).
MERK: Det rette stedet for okklusjon av LAD ligger ca. 2−3 mm under venstre auricle på ventral/venstre sidemarg i hjertet. Vellykket okklusjon er forbundet med EKG-endringer (ST-segmenthøyde) og makroskopiske endringer i LV som paling. - I tilfelle av iskemi / reperfusion modell, gjenåpne LAD ved fjerning av turniquet etter 30 min okklusjon.
- Lukk thoraxen med tre enkeltknappsyturer ved hjelp av en 4-0 enkelt monofilamentsytur (figur 1H). Før du strammer den siste suturen, fjern eventuell gjenværende luft fra thoraxen med en 10 ml sprøyte for å forhindre pneumothorax (figur 1I).
- Omplasser musklene og slå av flyktige anestesi.
- Sutur huden med en kontinuerlig sutur ved hjelp av en 4-0 sutur (Figur 1J).
- Administrer en antiseptisk spray for å beskytte mot infeksjoner og biting av suturen av rotter.
3. Postoperative behandlings- og ekskluderingskriterier
- Hold rottene på varmebordet til de våkner. Extubate rotter så snart de begynner å puste spontant.
- Sett de eksuberte rottene i et bur under en varmelampe for å hindre dem i å kjøle seg ned.
- Returner rotter til dyrehusene under standardiserte forhold når de begynner å oppføre seg normalt igjen.
- Tilsett 2 ampuller piritramid og 30 ml 5% glukose til 250 ml vann til postoperativ analgesi i tre dager.
- Kontroller rotters egnethet og oppførsel med sjekkliste- og ekskluderingskriteriene (tabell 1). Observer dyrene to ganger om dagen i den påfølgende uken, deretter to ganger i uken.
MERK: I samsvar med internasjonale standarder, presentere eventuelle lidende dyr, eller dyr som får opptil 6 poeng i evalueringen med sjekklisten, til veterinærer å ta terapi-relaterte beslutninger. Alle dyr som får 7 eller flere poeng må umiddelbart ofres med en overdose ketamin og xylazine.
| Eksamen | Observasjon | Score |
| Kroppsvekt | Stabil | 0 |
| 10% tap | 4 | |
| 15% tap for 48 h | 7 | |
| 18% tap | 7 | |
| normal (pels flat og skinnende) | 0 | |
| Eksternt utseende | piloerection (andre) | 1 |
| hematom | 2 | |
| hudsår/kutt/bitemerker | 2 | |
| sterkt redusert stell | 4 | |
| (åpninger uren/clotted eller fuktig) | 7 | |
| alvorlige hudirritasjoner eller sår | 7 | |
| pukkelstilling >2 h | 7 | |
| signifikant abdominal distensjon (ascites) | 7 | |
| Atferd | normal (sovende, nysgjerrige, sosiale kontakter, reaksjon når berørt) | 0 |
| uvanlig atferd, f.eks. | 2 | |
| selvisolasjon, uttalt hyperaktivitet eller stereotypi | 4 | |
| lethargia for <6 h | 4 | |
| sløvhet i 6 timer til 8 timer | 7 | |
| apathia >8 h | 7 | |
| stereotypia uavbrutt i > 10 min. og fortsatt vedvarer etter 2 h | 7 | |
| tegn på smerte når de berøres | 7 | |
| automutilation (automutilation) | 7 | |
| Fordøyelsen | Normal | 0 |
| diaré (myk avføring) | 3 | |
| diaré i 72 timer eller vannaktig | 7 | |
| blodig avføring | 7 |
Tabell 1: Kriterier for sjekkliste og ekskludering. Denne tabellen inneholder undersøkelsene som må observeres og tilsvarende poengsum. Følgelig må den postoperative behandlingen av dyret tilpasses, eller en veterinær må konsulteres.
4. Ekkokardiografi målinger
MERK: Ekkokardiografi utføres vanligvis to ganger, før induksjon av MI og før organene høstes.
- Injiser rotter med en blanding av xylazin (4 mg/kg BW) og ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt.
- Plasser rottene i liggende stilling på et varmebrett. Påfør ekkogel på brystet, noe som hjelper ultralydbølgene til å reise bedre og reduserer signalforstyrrelser.
- Få parasternal kort aksevisninger av LV hulrom på nivået av papillær muskelen.
- Utfør M-modus ekkokardiografi for å måle venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon og morfologi.
5. Organhøsting (uten fungerende hjerte)
- Administrer xylazin (4 mg/kg BW) og ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt før organhøsting. Sørg for at refleksene er negative.
MERK: Ingen intubasjon er nødvendig da prosedyren ikke varer lenger enn 1 min. - Bruk en skalpell for å lage et hudsnitt under xiphoid og utvide den parallelt til ribbeina på begge sider ved hjelp av saks.
- Klipp ribbeina i forakselen og ta tak i xiphoid for å løfte brystet opp (Figur 2A).
- Fjern anatomiske eller fibrotiske vevsadhesjoner ved å forsiktig rupture vevet med to par tang.
- Ta blodprøver (for blodgassevaluering eller molekylære analyser) fra vena cava dårligere med en 5 ml sprøyte.
- Utfør utskjæringen av hele hjertet på innløps- og utløpsnivået (Figur 2B). Fortsett om nødvendig med arbeidshjerteevaluering som beskrevet i avsnitt 6.
- Høstorganer, sjokk frost dem i flytende nitrogen og lagre i -80 °C for ytterligere molekylære analyser, eller i formaldehyd for histologiske formål.
6. Ex vivo hemodynamiske målinger via et fungerende hjertesystem
MERK: Det generelle oppsettet og komponentene i apparatet er tidligere beskrevet11. Følgende protokoll beskriver håndteringen av dyrets hjerte og de nødvendige trinnene for å evaluere LV-funksjonen.
- Bedøv rotter som beskrevet i trinn 5.1 og injiser 200 IE heparin intravenøst (lårbensvenen).
- Åpne thoraxen via et snitt under costal buen med en skalpell og utvide den til både fremre aksillær linjer med saks og heve brystbenet.
- Skjær de store fartøyene i nærheten av utløpet eller innløpet til hjertet for å avgiftsdirektoratet det (Figur 2B).
- Senk hjertet i iskald Krebs-Henseleit buffer og monter det på erytrocytt-perfundert isolert hjertesystem via kannulering av aorta (Figur 3A).
- Start med LD-modus med en konstant etterbelastning på 60 mmHg (stabiliseringsperiode).
- Etter 15 min LD-modus bytter du til WH-modus. Derfor kankantulere venstre atrium via en lungevene (Figur 3B). Deretter endrer du strømningsretningen i systemet ved å åpne klippet som okkluderer atrie kanylen. Dette resulterer i en perfusjon av venstre atrium og en fysiologisk blodstrøm i venstre hjerte11.
- Ta opp hemodynamiske målinger i 20 min i WH-modus.
- Samle bloddråper av korononene med en 2 ml sprøyte for å måle koronar strømning (CF, ml/ min) hver 5.
MERK: CF måles som forskjellen mellom venstre atriestrøm (LAF) og aortastrømning (AF). - Utfør kontinuerlige målinger av LAF (tilsvarende hjerteutgang) og AF med en strømningsprobe.
MERK: Sonden settes inn via WH-apparatet i LV. Alle data registreres kontinuerlig. - Hvis den pågående protokollen ber om, setter du inn et høy-fidelity kateter retrograd via aortaventilen i LV og måler venstre ventrikkel systolisk trykk (LVSP).
- For å vurdere trykkvolumarbeidet som utføres per minutt, må du beregne slagvolum som hjerteutgang dividert med hjertefrekvens.
- Beregn eksternt hjertearbeid (EHW) i henhold til følgende formel: CO x LVSP (g x m/min) normalisert til hjertevekt.
Representative Results
Følgende resultater har blitt publisert av Pilz et al.6. Med denne presise kirurgiske prosedyren kan den kardiobeskyttende effekten av ekstern iskemisk forkondisjonering (RIPerc) undersøkes. Dette er en potensiell ny behandling for pasienter som lider av akutt MI eller MIR og påfølgende ventrikulær remodeling, som i mange tilfeller fører til påfølgende HF. Etterligne de patofysiologiske endringene av MI / MIR er et obligatorisk skritt i evalueringen av behandlinger som in vitro eller ex vivo studier ikke gir fysiologiske miljøet. I denne protokollen ble dyrene utsatt for 30 min av LAD okklusjon etterfulgt av reperfusjon (dvs. MIR).
For å bevise reproduserbarheten av prosedyren ble histologiske kutt og flekker utført (Figur 4A). Det var klart at det fibrotiske arret hos MIR+RIPerc-behandlede dyr var sammenlignbare med arrdannelsen av Sham-dyrene, mens sammenligningen av fibrose mellom Sham- og MIR-gruppene var signifikant (figur 4B). I tillegg viste MIR+RIPerc-behandlede dyr signifikant redusert fibrose sammenlignet med MIR-behandlede dyr. Imidlertid klargjør de representative histologiske bildene styrken til denne kirurgiske prosedyren, da infarktet er eksplisitt opprettholdt i MIR-gruppen (figur 4A). Ved hjelp av in vivo echography ble ejeksjonsfraksjon, LV end-diastolisk og end-systoliske diametre (LVEDD og LVESD) målt og viste signifikant redusert hjertefunksjon på grunn av MIR-behandling mens hemodynamiske parametere ble bevart av RIPerc (Figur 4C−F). Ex vivo hemodynamiske data viste effektiviteten av prosedyren da MIR-gruppen viste signifikant reduksjon i LVSP, hjerteutgang (CO), slagvolum (SV) samt eksternt hjertearbeid (EHW) (Figur 5A−G).
Et litteratursøk om denne kirurgiske prosedyren rapporterte ingen negative eller utilfredsstillende kommentarer og resultater når det ble tilstrekkelig utført. Likevel, fallgruver nevnt i innledningen og diskusjonen må forebygges og opplæring er obligatorisk for å skaffe seg et stabilt nivå av ytelse og for å oppnå sammenlignbare resultater.
Figur 1: Preoperativt preparat og kirurgisk prosedyre. (A) Intubasjon av dyret ved hjelp av et 14 G-rør. (B) Liggende posisjonering og desinfeksjon av det kirurgiske feltet. (C) Hud snitt (2 mm parasternal på venstre thorax på nivået av tredje interkostalrom). Snittet må nå fremre aksillær linje på nivået av den femte interkostalrom. (D) Forskyv musklene for å gjøre ribbeina synlige. (E) Åpning av thoraxen. (F) Permanent okklusjon av LAD ved hjelp av 6-7 knop. (G)Forbigående okklusjon av LAD ved hjelp av en turniquet. (H) Lukking av brystet etter myokardiskemi og reperfusjon ved å plassere tre enkeltknutesykturer rundt ribbeina. RiktigIlukking av thoraxen. Bruk en 10 ml sprøyte til å fjerne eventuell gjenværende luft fra thoraxen før den siste knuten festes godt. Dette er integrert for å forhindre en pneumothorax. (J)Hudsytur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Organhøsting. (A)Åpne brystet med sub-xiphoidal kutt og utvide dem til begge midten av aksillær linjer. Ytterligere kutt gjennom ribbeina utføres for å lette løfting av brystbenet. (B)Eksisjon av hjertet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Isolert hjerteapparat. (A)Langendorff-modus. Hjertet er montert på WH-apparatet via kanyling av aorta. (B)Arbeidshjertemodus. Systemet kan byttes til WH-modellen for å evaluere hjertefunksjonen ved å kannulere venstre atrium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Effekt av fjerniske iskemiske kondisjonering på arrdannelse, venstre ventrikkelfunksjon og ombygging. (A)Histologiske LV skiver høstet på dag 14 post-myokard reperfusjon. (B) Kvantifiserte resultater av fibrose i søylegrafer. (C)Representative M-modus ekkokardiogrammer. (D) Utstøtingsfraksjon (EF) kvantifisert i søylegrafer. (E) LV ende-systolisk diameter (LVESD) kvantifisert i søylegrafer. (F) LV ende-diastolisk diameter (LVEDD) kvantifisert i søylegrafer. MIR, myokardiskemi-reperfusjon; RIPerc, ekstern iskemisk forkondisjonering. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Gjengitt fra Pilz et al.6 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Effekt av RIPerc på LV hemodynamisk funksjon. (A) LV systolisk trykk (LVSP), (B) hjerteeffekt (CO) og (C) slagvolum (SV) resultatene ble hentet fra det isolerte arbeidshjertet på dag 14 post-myokardreperfusjon. (D) CO er avbildet som en funksjon av etterlast; (F) eksternt hjertearbeid som funksjon av etterlast, kvantifiserte resultater i søylegraf (E og G). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM og n = 4–7 per gruppe. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. MIR, myokardiskemi/reperfusjon; RIPerc, ekstern iskemisk forutsetning; EHW, eksternt hjertearbeid; SV, slagvolum; AUC, område under kurven. Gjengitt fra Pilz et al.6 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Negativ remodeling post-MI anses å være en viktig mekanisme i utviklingen av hjertesvikt. Derfor, for å sikre kontinuiteten i kardiovaskulær forskning, bør eksperimentelle prosedyrer og teknikker være reproduserbare. En forståelig og klart definert eksperimentell protokoll er et grunnleggende element i reproduserbarhet. Reproduserbarhet refererer til resultater som kan gjentas av flere forskere og validerer på tvers av laboratorier. Denne studien hadde som mål å presentere en semi-minimal invasiv metode for å indusere kronisk eller re-perfused MI og vurdere hjerte hemodynamisk funksjon hos rotter.
Disse resultatene og videre publiserte data viser den høye styrken til denne kirurgiske metoden og dens betydning i forskning på MI, ombygging og HF. Mens iskemi/reperfusjonsskade kan brukes til å forstå endringene i MI med påfølgende reperfusjon, gir permanent okklusjon ytterligere forståelse av de kortsiktige og langsiktige ombyggingsprosessene til myokardiet. Andre kirurgiske tilnærminger forårsaker mer vevsskade og dyr viser høyere risiko for å utvikle infeksjoner og pneumothorax, noe som resulterer i høyere frafall. I motsetning er denne prosedyren rettet mot å redusere dødeligheten ved spesifikke forbedringer i oppsett og håndtering. I tillegg viser de variasjoner i fibrotisk arrutvidelse på grunn av ustabil LAD-okklusjon.
Vår protokoll gir en enkel metode for intubasjon, som er en av de mest kritiske trinnene i hele prosedyren. I motsetning til flere andre publikasjoner12, trakeotomi er ikke utført i vår prosedyre. Dette forbedrer oppvåkning og rehabilitering av dyrene postoperativt, noe som fører til utviklingen av de patofysiologiske endringene som er ment av denne kirurgiske prosedyren før dyrene gjennomgår postoperative målinger. Selvfølgelig, hvis det er en ikke-overlevelsesprotokoll, utføres trakeotomi under syn og er dermed lettere å utføre. I tillegg er lukking av trakeotomi i en overlevelsesprotokoll ikke anvendelig. Hvis thoraxen åpnes, er det obligatorisk å ventilere lungene for å forhindre kollaps. Derfor er rottene intubert før den kirurgiske prosedyren. Den minimalt invasive tilnærmingen kutter ikke ribbeina eller brystbenet og opprettholder thoraxens kompakthet og stabilitet. Følgelig er dyrenes utvinning forbedret, og risikoen for spontan pneumothorax eller blødning er relativt lav.
Som nevnt, mens intubasjonen er av klar fordel, er det vanskelig å utføre og kan føre til en høyere frafallshastighet i begynnelsen av eksperimentene. Dette problemet kan reduseres med trening og litt anatomisk kunnskap. Det er viktig å sette inn røret i riktig vinkel og strekke dyrets kropp til lyset skinner gjennom vokale lepper hvoretter røret kan skyves forsiktig fremover. Pass på å ikke skade vokalleppene, da dette kan forårsake hevelse, påfølgende okklusjon av glottis og kvelning.
Det er også viktig at LAD er ligated riktig. Det lille kirurgiske vinduet, raskt bankende hjerte og ventilert lunge (unngå å berøre det så mye som mulig som hver kontakt kan føre til blødning i lungene) gjør fartøyet ikke godt synlig. Derfor er anatomisk kunnskap uunnværlig. Venstre auricle er uunnværlig for å bidra til å standardisere både området i fare og å plassere ligation rundt LAD. Stinget må utføres intramuralt, ikke transmuralt i LV, da dette kan føre til en reduksjon av LV-kammerdiameteren og volumet som ikke skyldes de patologiske prosessene. Vellykket okklusjon er forbundet med cyanose i myokardområdet i fare og økning av ST-segment på EKG. Hovedbegrensningen av denne prosedyren er riktig posisjonering av suturen. For å oppnå sammenlignbare resultater må stingene være på samme nivå og må bruke lignende mengder vev. Dette krever et høyt nivå av trening og de forskjellige vektene av dyrene må vurderes. Et annet poeng å vurdere er tilstrekkelig fjerning av pneumothorax før lukking av interkostalrom. Hvis dette ikke er nøyaktig utført, vil dyrene vise vanskeligheter med å puste som inflasjonen av venstre lunge vil bli hindret av en pneumothorax. Som nevnt kan dette reduseres ved å bruke en sprøyte for å fjerne eventuell gjenværende luft fra thoraxen.
For øyeblikket er denne MI-prosedyren en vanlig metode som garanterer sammenlignbare resultater og en høy overlevelsesrate hvis de kritiske trinnene utføres med høy presisjon. Fremtidige prosjekter på ulike behandlinger, enheter eller legemidler i MI, HF eller hjerteremodeling kan evalueres ved å utføre denne minimalt invasive teknikken.
WH-målingene er, som nevnt, ikke ofte brukt som vedlikehold og håndtering krever spesifikt utstyr og kunnskap. For å innhente representative og sammenlignbare data må fallgruver unngås. De mest kritiske trinnene er montering av hjertet og bytte fra D-modellen til WH-modus. Hvis hjertet ikke blir tilstrekkelig utskåret, kan monteringen være vanskelig, da tilstrekkelig aortavevslengde er nødvendig for å feste hjertet til apparatet. Kort tid etter tilkobling til LD-modus, kan hjertefrekvensen reduseres på grunn av vasking i kald buffer, frakobling av fysiologiske stimuli i kroppen eller reperfusjonen med blod fra en annen art av apparatet. I slike tilfeller må en pacemaker brukes på både å gjenopprette og bevare den fysiologiske frekvensen. Dette sikrer sammenlignbare resultater hos alle dyr. Siden blodvolumet i apparatet er et multiplum av det fysiologiske volumet hos rotter, brukes storferøde blodlegemer i en Krebs-Henseleit bufferbasert suspensjon.
Overgangen fra LD-modus til WH-modus er synonymt med en overgang fra passiv til aktivt hjertearbeid. LD-modus brukes til å venne hjertet til sitt nye miljø. I WH-modus må hjertet utføre sine fysiologiske utstøtingsfunksjoner. Derfor er det nødvendig med en kort tilpasningsfase til de nye omstendighetene før evalueringen ved å øke etterbelastningen.
Et annet kritisk skritt som vanligvis glemmes er tilstrekkelig forberedelse og vedlikehold av apparatet og perfusat. Det nøyaktige volumet av hver forbindelse må blandes og temperaturen i systemet må kontrolleres og justeres. Likevel er WH en elegant metode for å vurdere hjerteutgang, slagvolum, venstre ventrikkel systolisk trykk og koronarstrøm samtidig.
Denne svært reproduserbare prosedyren for å indusere MI og de representerer dataene som er innhentet av WH-apparatet, beviser deres evne selv. Den semi-minimalt invasive tilnærmingen, nivået av LAD okklusjon og intubasjonsmetode letter rask gjenoppretting og lav variasjon i infarkt størrelse. I tillegg gir hjertefunksjonsanalyse i isolerte arbeidshjerter verdifulle hemodynamiske resultater.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker operasjonsteaterteamet og teknikerne i Senter for biomedisinsk forskning for deres bidrag, teknisk assistanse, verdifulle innspill og råd. Prosjektene er finansiert av Ludwig Boltzmann Institute, Cluster for Cardiovascular Research (REM-prosjektet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
