Summary
Denne artikel præsenterer en effektiv metode til at udføre myokardieiskæmi og efterfølgende kronisk reperfusion hos rotter ved hjælp af en minimalt invasiv tilgang. Desuden vurderes rotternes venstre ventrikelhærefunktion ved ekkokardiografi og isolerede arbejdshjertemetoder.
Abstract
Myokardieinfarkt (MI) er fortsat den største bidragyder til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Derfor er forskning i dette emne obligatorisk. En let og meget reproducerbar MI induktion procedure er nødvendig for at opnå yderligere indsigt og bedre forståelse af de underliggende patologiske ændringer. Denne procedure kan også bruges til at vurdere virkningerne eller styrken af nye og lovende behandlinger (som lægemidler eller interventioner) i akut MI, efterfølgende remodeling og hjertesvigt (HF). Efter intubation og præoperativ præoperativ forberedelse af dyret blev der udført en bedøvelsesprotokol med isofluran, og den kirurgiske procedure blev udført hurtigt. Ved hjælp af en minimalt invasiv tilgang, venstre forreste faldende arterie (LAD) var placeret og okkluderet af en ligatur. Okklusionen kan udføres akut for efterfølgende reperfusion (iskæmi/ reperfusion skade). Alternativt kan fartøjet være ligeret permanent at undersøge udviklingen af kronisk MI, remodeling eller HF. På trods af almindelige faldgruber er frafaldsprocenterne minimale. Forskellige behandlinger såsom fjernbetjening iskæmisk konditionering kan undersøges for deres cardioprotective potentielle præ-, peri- og post-operatively. Den postoperative genopretning var hurtig, da anæstesien blev kontrolleret præcist, og operationens varighed var kort. Postoperativ analgesi blev administreret i tre dage. Den minimalt invasive procedure reducerer risikoen for infektion og betændelse. Desuden letter det en hurtig genopretning. De "arbejdshjerte" målinger blev udført ex vivo og aktiveret præcis kontrol af preload, efterlast og flow. Denne procedure kræver særligt udstyr og uddannelse for at opnå tilstrækkelig ydeevne. Dette manuskript giver en detaljeret trinvis introduktion til udførelse af disse målinger.
Introduction
Selv om forekomsten er konstant faldende, akut myokardieinfarkt (MI) er stadig den største bidragyder til sygelighed og dødelighed på verdensplan1. Der er begrænsninger på at evaluere effekten af potentielle behandlinger som lægemidler eller kirurgiske procedurer, der forebygger og behandler akut MI. Før deres virkninger kan undersøges hos mennesker, skal disse behandlinger testes for risici på forhånd, herunder in vivo-undersøgelser hos dyr. Der er ingen bedre mulighed for at studere en patologi end under in vivo betingelser. Derfor, MI induktion i rotter eller mus og endda store dyremodeller (svin eller får) tillader undersøgelse af kort- (akut) og langsigtede (kroniske) ændringer på grund af iskæmi i kranspulsårerne og det omgivende myokardi, samt systemiske ændringer på grund af nedsat hjertefunktion. Infarkt størrelse var tidligere det vigtigste mål, men for nylig efterfølgende hjerte remodellering processer i akut MI eller iskæmi / reperfusion skade samt i på hinanden følgende hjertesvigt (HF) er blevet af stor interesse. Derfor er der behov for en sammenlignelig og let reproducerbar metode for at opnå ensartede resultater.
Mens brugen af cryo-ablation at få MI er blevet rapporteret2, vores metode bygger på andre undersøgelser, hvor efterforskere occlude venstre forreste faldende arterie (LAD) ved en enkelt søm ligation. I forhold til (hemi-)sternotomy procedurer, den minimalt invasive tilgang, som vil blive præsenteret i denne artikel, tillader en hurtigere postoperativ opsving og markant reducerer driftstiden. Et fælles trin i andre kirurgiske procedurer er løft-out af hjertet fra brystkassen til at udføre hjertet søm3. Metodens fremgangsmåde gør dette trin unødvendigt. Afhængigt af protokollen kan der udføres to forskellige procedurer: en midlertidig okklusion ved hjælp af en årepresse til at fremkalde iskæmi/reperfusion over en bestemt periode; eller en permanent okklusion af arterien ved fastsættelse af ligaturen. Succesen med okklusion kan evalueres med elektrokardiogram (EKG) og de makroskopiske ændringer i venstre hjertekammer (LV) samt dens paling.
Et andet vigtigt skridt forud for operationen er intubation. Mens intubation i de fleste tilfælde udføres via tracheotomi eller via oral indsættelse af røret under synsvidde ved et hudindsnit i halsen, beskriver denne protokol den endotrakeale intubation af detverestede dyr, hvilket reducerer åndedrætsbesvær eller infektioner postoperativt4,5. For at undgå postoperative komplikationer fjernes luft fra brystkassen via en sprøjte, før brystet lukkes.
Den anden opgave i denne artikel er evalueringen af hæmodynamisk funktion via en isoleret arbejde hjerte eksperimentel model, hvordan det bruges i andre projekter inden for vores institut6,7. Mens ekkokardiografi, hjertemagnetisk resonans imaging (MR) og invasiv kvantificering af trykvolumen sløjfer er velkendte og udbredte metoder til at vurdere hjertefunktion in vivo, de er kendt for at have nogle begrænsninger. Invasive tilgange, såsom brugen af katetre til at undersøge den globale funktion eller specifikke parametre i hjertet, er almindeligt anvendt og repræsenterer guldstandarden af hjertemålinger. I modsætning hertil er ex vivo arbejder hjerteapparat sjældent anvendes på grund af sin kompleksitet og omkostninger. Der er mange vigtige aspekter, fra blandingen af perfusate til tilstrækkelig kannulation af hjertet, som er afgørende for en vellykket evaluering. Det isolerede arbejdshjerteapparat blev først beskrevet af Oskar Langendorff i 18978 og er blevet ændret i de seneste årtier9. I dag er der to modeller, der anvendes: Langendorff (LD) mode og arbejdshjerte (WH) mode. I vores undersøgelse, LD mode bruges til at akklimatisere hjertet til sit nye miljø (ca. 15 min). I denne tilstand, hjertet er cannulated via aorta og kranspulsårerne er perfunderet anterogradely, tilstrækkeligt leverer myokardiet. I LD-tilstand udfører hjertet ikke trykvolumenarbejde. I WH-tilstand er det venstre atrium derimod cannulated via en lungevene, hvorigennem perfusatet kommer ind i venstre atrium. Hjertet derefter pumper denne perfusate fysiologisk mod en foruddefineret efterlast. Ved at øge efterbelastningen over tid, kan hjertefunktionen løbende måles. Parametre som koronar flow, hjerte output (CO), slagtilfælde volumen (SV) og arbejde, atriestrømmen flow og LV systoliske og diastoliske tryk kan måles. Virkningen af forskellige behandlinger direkte og udelukkende på hjertet kan undersøges6,10. En gennemgang af Liao og Podesser9 præsenterede den udbredte brug af denne metode i evalueringen af farmakologiske virkninger på hjertefunktion og stofskifte samt i udforskningen af forskellige sygdomme som MI, HF, fedme og diabetes.
Sammenfattende præsenterer denne protokol en reproducerbar metode til at udføre MI eller myokardieiskæmi / reperfusion (MIR) skade in vivo. Desuden tillader det karakterisering af LV (dys-) funktion på et isoleret rottehjerte efter MI. Denne protokol præsenterer en unik kombination af behandling og analyse.
Protocol
Den forsøgsprotokol, der leverede de resultater, der er beskrevet i denne artikel, er blevet godkendt af den regionale etiske komité for laboratoriedyrsforsøg ved det medicinske universitet i Wien og det østrigske forbundsministerium for uddannelse, videnskab og forskning (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Alle forsøg er i overensstemmelse med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, udgivet af US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revideret 1996).
BEMÆRK: Der anvendes 10-12 uger gamle hanr. Som følgende procedurer og behandlinger udføres i et sterilt miljø af en operationsstue (OR), slid scrubs, handsker, ansigtsmasker og hætter ved håndtering af dyr. Før du går ind i OR, skal du sørge for, at hænderne vaskes og desinficeres. Hvis hensigten er at operere på flere dyr i en kirurgisk session, enten vaske og desinficere, eller autoklave instrumenterne i mellem operationer. Disse hygiejniske retningslinjer gælder for alle procedurer, der præsenteres i protokolafsnittet.
1. Præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativ
- Indlede præoperativ anæstesi ved at indsprøjte en blanding af xylazin (4 mg/kg BW) og ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt.
- Indtubae rotterne med et 14 G rør og volumenstyret ventilation med en blanding af O2,luft og isofluran (1−2,5%) ved 75−85 slag/min., 100 ml/slagtilfælde/BW (Figur 1A). Hvis det er nødvendigt, for et bedre overblik, mens intubating: anvende Xylocain via en vat spids på den nederste svælget for at opnå lokal afslapning.
- Rotterne anbringes på et opvarmet operationsbord i liggende stilling, og forlimmerne fastgøres med tape (Figur 1B).
- Rektaltemperaturen måles med en sonde.
BEMÆRK: Den skal holdes mellem 37,5−38,5 °C. - Barber brystkassen, og rengør arbejdsområdet med antiseptisk povidonjodopløsning. Påfør øjensalve på rotten for at forhindre tørring af øjnene.
- Indfør intraoperativ analgesi ved at injicere piritramide (0,1 ml/kg BW) intraperitonealt.
- EKG-sonder anbringes subkutanet i dyrets ekstremiteter.
- Kontroller hale- og tåreflekser, før den kirurgiske procedure påbegyndes.
2. Kirurgisk procedure-induktion af myokardieiskæmi
- Udfør hud snit ved hjælp af en skalpel. Sørg for at starte 2 mm parasternal på venstre brystkasse på niveau med det tredje interkostale rum og fortsætte til den forreste aksillære linje på niveau med det femte interkostale rum (figur 1C).
- Udskift de overfladiske muskler forsigtigt for at gøre ribbenene synlige (Figur 1D).
- I tilfælde af mindre blødning, bruge en cauter at udslette eller til at afbryde det omgivende væv.
- Thoracotomien udføres på niveau med det 4. interkostale rum, og indsæt en retractor for at opnå synlighed af hjertet og lungen (Figur 1E). Åbn forsigtigt lungehinden for at undgå blødning.
- Midlertidigt occlude LAD ved hjælp af en årepresse til at fremkalde iskæmi / reperfusion (MIR) over et bestemt tidsrum; eller permanent (MI) okkludere det ved at gøre 6−7 knob ved hjælp af en 6-0 sutur for at lukke ligation (Figur 1F,G).
BEMÆRK: Det rigtige sted til okklusion af LAD er placeret ca. 2−3 mm under venstre aurikel på hjertets ventrale/venstre laterale margin. Vellykket okklusion er forbundet med EKG-ændringer (ST-segment elevation) og makroskopiske ændringer i LV som paling. - Hvis der er tale om iskæmi-/reperfusionsmodellen, skal LAD'en åbnes igen ved at fjerne årepresse efter 30 min. okklusion.
- Brystkassen lukkes med tre enkeltknapsafture ved hjælp af en 4-0 enkelt monofilamenter sutur (Figur 1H). Før den sidste sutur strammes, fjernes eventuel restluft fra brystkassen med en 10 ml sprøjte for at forhindre en pneumothorax (Figur 1I).
- Flyt musklerne og sluk for den flygtige anæstesi.
- Sutur huden med en kontinuerlig sutur ved hjælp af en 4-0 sutur (Figur 1J).
- Administrere en antiseptisk spray for at beskytte mod infektioner og bidende af suturen af rotter.
3. Postoperativ behandling og udelukkelseskriterier
- Hold rotterne på varmebordet, indtil de vågner. Udvis rotterne, så snart de begynder at trække vejret spontant.
- Sæt de udsmurte rotter i et bur under en varmelampe for at forhindre dem i at køle.
- Tilbagelever rotter til dyrehusene under standardiserede forhold, når de begynder at opføre sig normalt igen.
- Der tilsættes 2 ampuller piritramide og 30 ml 5% glukose til 250 ml vand til postoperativ analgesi i tre dage.
- Kontroller rotternes egnethed og funktionsmåde med kriterierne for tjekliste og udelukkelse (tabel 1). Overhold dyrene to gange om dagen i den følgende uge, derefter to gange om ugen.
BEMÆRK: I overensstemmelse med internationale standarder skal dyrlæger præsentere eventuelle lidende dyr eller dyr, der får op til 6 point i evalueringen med tjeklisten, for dyrlæger til at træffe terapirelaterede beslutninger. Alle dyr, der får 7 eller flere point, skal straks ofres med en overdosis ketamin og xylazin.
| Undersøgelse | Observation | Score |
| Kropsvægt | Stabil | 0 |
| 10% tab | 4 | |
| 15% tab for 48 timer | 7 | |
| 18% tab | 7 | |
| normal (pels flad og skinnende) | 0 | |
| Udvendigt udseende | piloerection delte et sted. | 1 |
| hæmatom | 2 | |
| hudsår/snit/bidemærker | 2 | |
| stærkt reduceret grooming | 4 | |
| (åbninger urene / clotted eller fugtig) | 7 | |
| alvorlige hudirritationer eller sår | 7 | |
| hunched kropsholdning >2 h | 7 | |
| betydelig abdominal udspiling (ascites) | 7 | |
| Adfærd | normal (sovende, nysgerrige, sociale kontakter, reaktion, når de berøres) | 0 |
| usædvanlig adfærd, f.eks. | 2 | |
| selvisolation, udtalt hyperaktivitet eller stereotypia | 4 | |
| sløvhed for <6 h | 4 | |
| sløvhed i 6 timer til 8 timer | 7 | |
| apathia >8 h | 7 | |
| stereotypia uafbrudt i >10 min. og stadig ved efter 2 timer | 7 | |
| tegn på smerte ved berøring | 7 | |
| automatiskmutation | 7 | |
| Fordøjelsen | Normal | 0 |
| diarré (blød afføring) | 3 | |
| diarré i 72 timer eller vandig | 7 | |
| blodig afføring | 7 |
Tabel 1: Kriterier for tjekliste og udelukkelse. Denne tabel indeholder de undersøgelser, der skal observeres, og den tilsvarende score. Derfor skal den postoperative behandling af dyret tilpasses, eller en dyrlæge skal høres.
4. Målinger af ekkokardiografi
BEMÆRK: Ekkokardiografi udføres normalt to gange, før induktion af MI og før organerne høstes.
- Indsprøjt rotter med en blanding af xylazin (4 mg/kg BW) og ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt.
- Placer rotterne i en liggende stilling på en varmebakke. Påfør ekkogel på brystet, hvilket hjælper ultralydbølgerne med at bevæge sig bedre og reducerer signalforstyrrelser.
- Opnå parasternal kort akse visninger af LV hulrum på niveau med papillære muskel.
- Udfør M-mode ekkokardiografi for at måle venstre ventrikel udslyngning fraktion og morfologi.
5. Organhøst (uden at arbejde hjerte)
- Xylazin (4 mg/kg BW) og ketamin (100 mg/kg BW) indgives intraperitoneligt før organhøst. Sørg for, at reflekserne er negative.
BEMÆRK: Der kræves ingen intubation, da proceduren ikke varer længere end 1 min. - Brug en skalpel til at gøre en hud snit under xiphoid og udvide det parallelt med ribbenene på begge sider ved hjælp af en saks.
- Skær ribbenene i den forreste aksillære linje og tag fat i xiphoid at løfte brystet op (Figur 2A).
- Fjern anatomiske eller fibrotiske væv sammenvoksninger ved forsigtigt at briste vævet med to par pincet.
- Tag blodprøver (til vurdering af blodgas eller molekylære analyser) fra vena cava ringere med en 5 ml sprøjte.
- Udfør ekscisionen af hele hjertet ved indløbs- og udløbsniveauet (Figur 2B). Hvis det er nødvendigt, fortsætte med at arbejde hjerte evaluering som beskrevet i afsnit 6.
- Høst organer, chok frost dem i flydende nitrogen og opbevares i -80 °C for yderligere molekylære analyser, eller i formaldehyd til histologiske formål.
6. Ex vivo hæmodynamiske målinger via et fungerende hjertesystem
BEMÆRK: Den generelle opsætning og komponenterne i apparatet er tidligere beskrevet11. Følgende protokol beskriver håndteringen af dyrets hjerte og de nødvendige skridt til at evaluere LV-funktionen.
- Anesthetize rotter som beskrevet i trin 5.1 og injicere 200 IE af heparin intravenøst (femoral vene).
- Åbn brystkassen via et snit under den omkostningsmæssige bue med en skalpel og udvid den til både forreste aksillære linjer med en saks og løft brystbenet.
- Skær de store fartøjer i nærheden af deres udløb eller indløb til hjertet for at punktafgifter det (Figur 2B).
- Fordyb hjertet i iskold Krebs-Henseleit buffer og montere det på erythrocyt-perfused isolerede hjertesystem via kannulating aorta (Figur 3A).
- Start med LD-tilstanden med en konstant efterladning på 60 mmHg (stabiliseringsperiode).
- Efter 15 minutters LD-tilstand skal du skifte til WH-tilstand. Derfor kanylte venstre atrium via en lungevene (Figur 3B). Derefter skal du ændre strømningsretningen i systemet ved at åbne det klip, der tilslutter den atrielige kanyle. Dette resulterer i en perfusion af venstre atrium og en fysiologisk blodgennemstrømning i venstre hjerte11.
- Optag hæmodynamiske målinger i 20 min i WH-tilstand.
- Opsaml bloddråber af koronarerne med en 2 ml sprøjte til at måle koronar flow (CF, ml/ min) hver 5 min.
BEMÆRK: CF måles som forskellen mellem venstre atriestrøm (LAF) og aortaflow (AF). - Udfør kontinuerlige målinger af LAF (svarende til hjerteoutput) og AF med en flowsonde.
BEMÆRK: Sonden indsættes via WH-apparatet i LV'en. Alle data registreres løbende. - Hvis den igangværende protokol anmoder om, indsætte en high-fidelity kateter retrograd via aortaklappen i LV og måle venstre ventrikel systolisk tryk (LVSP).
- For at vurdere det trykvolumenarbejde, der udføres pr. minut, skal du beregne slagvolumen som hjerteoutput divideret med puls.
- Beregn eksternt hjertearbejde (EHW) i henhold til følgende formel: CO x LVSP(g x m/min) normaliseret til hjertevægt.
Representative Results
Pilz et al. 6 har offentliggjortfølgenderesultater . Med denne præcise kirurgiske procedure, den kardiobeskyttende virkning af fjernbetjening iskæmisk perconditioning (RIPerc) kan undersøges. Dette er en potentiel ny behandling for patienter, der lider af akut MI eller MIR og efterfølgende ventrikelremodellering, hvilket i mange tilfælde fører til på hinanden følgende HF. Efterligner de patofysiologiske ændringer af MI/MIR er et obligatorisk trin i vurderingen af behandlinger, da in vitro- eller ex vivo-undersøgelser ikke giver det fysiologiske miljø. I denne protokol blev dyrene udsat for 30 min LAD okklusion efterfulgt af reperfusion (dvs. MIR).
For at bevise, at proceduren kunne reproduceres, blev der udført histologiske snit og pletter (figur 4A). Det var tydeligt, at det fibrotiske ar i MIR+RIPerc-behandlede dyr var sammenligneligt med fræserdannelsen af shamdyrene, mens sammenligningen af fibrose mellem Sham- og MIR-grupperne var signifikant (figur 4B). Derudover viste MIR+RIPerc-behandlede dyr signifikant reduceret fibrose sammenlignet med MIR-behandlede dyr. Men de repræsentative histologiske billeder tydeliggør styrken af denne kirurgiske procedure, da infarktet udtrykkeligt opretholdes i MIR-gruppen (Figur 4A). Brug af in vivo echografi, udslyngningsfraktion, LV end-diastoliske og ende-systoliske diametre (LVEDD og LVESD) blev målt og viste signifikant nedsat hjertefunktion på grund af MIR-behandling, mens hæmodynamiske parametre blev bevaret af RIPerc (Figur 4C−F). Ex vivo hæmodynamiske data udviste effektiviteten af proceduren, da MIR-gruppen viste signifikante fald i LVSP, hjerteoutput (CO), slagtilfældevolumen (SV) samt eksternt hjertearbejde (EHW) (Figur 5A−G).
En litteratur søgning om denne kirurgiske procedure rapporterede ingen negative eller utilfredsstillende kommentarer og resultater, når det var tilstrækkeligt udført. Ikke desto mindre skal faldgruber, der nævnes i indledningen, og diskussionen forebygges, og uddannelse er obligatorisk for at opnå et stabilt præstationsniveau og opnå sammenlignelige resultater.
Figur 1: Præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt præoperativt og kirurgisk indgreb. A (B) Liggende positionering og desinfektion af det kirurgiske felt. (C) Hudindsnit (2 mm parasternal på venstre brystkasse på niveau med det tredje interkostale rum). Snittet skal nå den forreste aksillære linje på niveau med det femte interkostale rum. (D) Fortrænge musklerne for at gøre ribbenene synlige. (E) Åbning af brystkassen. (F) Permanent okklusion af LAD med 6−7 knob. (G) Forbigående okklusion af LAD ved hjælp af en årepresse. (H) Lukning af brystet efter myokardieiskæmi og reperfusion ved at placere tre enkelt-knude suturer omkring ribbenene. (I) Korrekt lukning af brystkassen. Brug en 10 ml sprøjte til at fjerne eventuel resterende luft fra brystkassen, før den sidste knude fastgøres tæt. Dette er en integreret del for at forhindre en pneumothorax. (J) Hud sutur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Organhøst. (A) Åbn brystet med sub-xiphoidal nedskæringer og udvide dem til begge midten af aksillære linjer. Yderligere snit gennem ribbenene udføres for at lette løft af brystbenet. (B) Excision af hjertet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Isoleret hjerteapparat. (A) Langendorff-tilstand. Hjertet er monteret på WH apparat via kanylering af aorta. (B) Working hjerte tilstand. Systemet kan skiftes til WH-modellen for at evaluere hjertefunktionen ved at cannulere det venstre atrium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Effekt af fjernisk iskæmisk konditionering på ardannelse, venstre ventrikelfunktion og remodeling. (A) Histologiske LV skiver høstet på dag 14 post-myokardierefusion. (B) Kvantificerede resultater af fibrose i søjlediagrammer. (C) Repræsentative M-mode-ekkokardiogrammer. (D) Udslyngningsfraktion (EF) kvantificeret i søjlediagrammer. (E) LV-endesystolisk diameter (LVESD), der er kvantificeret i søjlediagrammer. (F) LV end-diastolisk diameter (LVEDD) kvantificeret i søjlediagrammer. MIR, myokardieiskæmi-reperfusion; RIPerc, fjern iskæmisk perconditioning. Data udtrykkes som middel ± SEM. *p < 0,05; **p < 0.01; p < 0.001. Genoptrykt fra Pilz et al.6 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Virkningen af RIPerc på LV hæmodynamisk funktion. (A) LV systolisk tryk (LVSP), (B) hjerte-output (CO), og (C) slagtilfælde volumen (SV) resultater blev opnået fra det isolerede arbejdshjerte på dag 14 post-myokardierefusion. d) CO er afbildet som en funktion af efterladning; (F) eksternt hjertearbejde som funktion af efterbelastning, kvantificeret resulterer i søjlediagram (E og G). Data udtrykkes som middel ± SEM og n = 4-7 pr. gruppe. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. MIR, myokardieiskæmi/reperfusion; RIPerc, fjern iskæmisk forkonditionering; EHW, eksternt hjertearbejde; SV, slagvolumen; AUC, område under kurven. Genoptrykt fra Pilz et al.6 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Negativ remodeling post-MI anses for at være en vigtig mekanisme i udviklingen af hjertesvigt. For at sikre kontinuiteten i hjerte-kar-forskning bør forsøgsprocedurer og -teknikker derfor kunne reproduceres. En forståelig og klart defineret forsøgsprotokol er et grundlæggende element i reproducerbarheden. Reproducerbarhed refererer til resultater, der kan gentages af flere forskere og er valideret på tværs af laboratorier. Denne undersøgelse havde til formål at præsentere en semi-minimalt invasiv metode til at fremkalde kronisk eller re-perfunderet MI og vurdere hjerte hæmodynamisk funktion hos rotter.
Disse resultater og yderligere offentliggjorte data viser den høje styrke af denne kirurgiske metode og dens betydning i forskning i MI, remodeling og HF. Mens iskæmi / reperfusion skade kan bruges til at forstå ændringerne i MI med efterfølgende reperfusion, permanent okklusion giver yderligere forståelse af de kortsigtede og langsigtede remodeling processer af myokardiet. Andre kirurgiske tilgange forårsage mere vævsskader og dyr viser højere risiko for at udvikle infektioner og pneumothorax, resulterer i højere frafald. I modsætning hertil har denne procedure til formål at reducere dødeligheden ved specifikke forbedringer i opsætning og håndtering. Derudover viser de variationer i fibrotisk ar ekspansion på grund af ustabil LAD okklusion.
Vores protokol giver en nem metode til intubation, som er et af de mest kritiske trin i hele proceduren. I modsætning til flere andre publikationer12, er tracheotomi ikke udføres i vores procedure. Dette øger opvågnen og rehabilitering af dyrene postoperativt, hvilket fører til udvikling af de patofysiologiske ændringer, som er bestemt ved denne kirurgiske procedure, før dyrene gennemgår postoperative målinger. Naturligvis, hvis det er en ikke-overlevelse protokol, tracheotomi udføres under vision og er dermed lettere at udføre. Derudover er lukning af trakeotomi i en overlevelsesprotokol ikke relevant. Hvis brystkassen åbnes, er det obligatorisk at ventilere lungerne for at forhindre kollaps. Derfor er rotterne intuberet før den kirurgiske procedure. Den minimalt invasive tilgang skærer ikke ribbenene eller brystbenet og opretholder dermed brystkassens kompakthed og stabilitet. Dyrenes bedring forbedres derfor, og risikoen for spontan pneumothorax eller blødning er relativt lav.
Som førnævnt, mens intubation er af klar fordel, er det vanskeligt at udføre og kan forårsage en højere frafaldsprocent i begyndelsen af forsøgene. Dette problem kan afhjælpes med uddannelse og nogle anatomiske viden. Det er vigtigt at indsætte røret i den rette vinkel og strække dyrets krop, indtil lyset skinner gennem de vokale læber, hvorefter røret kan forsigtigt skubbes fremad. Pas på ikke at skade de vokale læber, da dette kan forårsage hævelse, efterfølgende okklusion af glottis og kvælning.
Det er også vigtigt, at LAD er ligeret korrekt. Det lille kirurgiske vindue, det hurtigt bankende hjerte og den ventilerede lunge (undgå at røre ved det så meget som muligt, da enhver kontakt kan resultere i blødning i lungerne) gør beholderen ikke klart synligt. Derfor er anatomisk viden uundværlig. Den venstre aurikel er uundværlig for at hjælpe med at standardisere både det udsatte område og for at placere ligationen omkring LAD. Sømmen skal udføres intramurally, ikke transmurally i LV, da dette kan forårsage en reduktion af LV kammer diameter og volumen, som ikke skyldes de patologiske processer. Vellykket okklusion er forbundet med cyanose af myokardieområdet i fare og forhøjelse af ST-segment på EKG. Den vigtigste begrænsning af denne procedure er den korrekte placering af suturen. For at opnå sammenlignelige resultater skal stingene være på samme niveau og skal bruge lignende mængder væv. Dette kræver et højt uddannelsesniveau, og dyrenes forskellige vægte skal tages i betragtning. Et andet punkt at overveje, er en passende fjernelse af pneumothorax før lukning af interkostale rum. Hvis dette ikke udføres præcist, vil dyrene udviser åndedrætsbesvær, da inflationen i venstre lunge vil blive hæmmet af en pneumothorax. Som nævnt kan dette afbødes ved hjælp af en sprøjte til at fjerne eventuel resterende luft fra brystkassen.
I øjeblikket, denne MI procedure er en almindeligt anvendt metode, som garanterer sammenlignelige resultater og en høj overlevelsesrate, hvis de kritiske trin udføres med høj præcision. Fremtidige projekter om forskellige behandlinger, enheder eller lægemidler i MI, HF eller hjerteremodellering kan evalueres ved at udføre denne minimalt invasive teknik.
WH-målingerne anvendes som nævnt ikke almindeligt, da vedligeholdelse og håndtering kræver specifikt udstyr og viden. For at opnå repræsentative og sammenlignelige data skal faldgruber undgås. De mest kritiske trin er montering af hjertet og skift fra D-modellen til WH-tilstand. Hvis hjertet ikke er fjernet tilstrækkeligt, kan monteringen være vanskelig, da tilstrækkelig aortavævlængde er nødvendig for at fastgøre hjertet til apparatet. Kort efter tilslutning til LD-tilstand, hjertefrekvensen kan falde på grund af vask i kold buffer, afbrydelse af sin fysiologiske stimuli i kroppen eller reperfusion med blod fra en anden art ved apparatet. I sådanne tilfælde skal der anvendes en pacemaker til både at genoprette og bevare den fysiologiske hyppighed. Dette sikrer sammenlignelige resultater hos alle dyr. Da blodvolumenet i apparatet er et multiplum af det fysiologiske volumen hos rotter, anvendes røde kreaturer i en Krebs-Henseleit-bufferbaseret suspension.
Skiftet fra LD-tilstand til WH-tilstand er synonymt med et skift fra passivt til aktivt hjertearbejde. LD-tilstanden bruges til at vænne hjertet til sit nye miljø. I WH-tilstand skal hjertet udføre sine fysiologiske udslyngningsfunktioner. Derfor er der behov for en kort tilpasningsfase til de nye omstændigheder før evalueringen ved at øge efterbelastningen.
Et andet kritisk skridt, som almindeligvis glemmes, er tilstrækkelig forberedelse og vedligeholdelse af apparatet og perfusate. Den nøjagtige mængde af hver forbindelse skal blandes, og temperaturen i systemet skal styres og justeres. Ikke desto mindre, WH er en elegant metode til at vurdere hjerte-output, slagtilfælde volumen, venstre ventrikel systolisk tryk og koronar flow samtidigt.
Denne meget reproducerbare procedure til at fremkalde MI og de repræsentative data, som wh-apparatet har erhvervet, beviser selv deres formåen. Den semi-minimalt invasive tilgang, niveauet af LAD okklusion og intubation metode lette hurtig genopretning og lav variation i infarkt størrelse. Derudover giver hjertefunktionsanalyse i isolerede arbejdshjerter værdifulde hæmodynamiske resultater.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker operationen teater team og teknikere fra Center for Biomedical Research for deres bidrag, teknisk bistand, værdifulde input og rådgivning. Projekterne er finansieret af Ludwig Boltzmann Institute, Cluster for Cardiovascular Research (REM-projektet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
