Summary
نقدم بروتوكوللقياس استجابة المخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم organotypic. توفر الاستراتيجية التجريبية المبينة هنا منصة لتنفيذ شاشات الأدوية المتوسطة والعالية على شرائح الأنسجة المشتقة من أورام سريرية أو فأرة في ظروف الجسم الحي.
Abstract
تتكون أنسجة الورم من خلايا سرطانية وخلايا مناعية مخترقة وخلايا إنهيليلية وخلايا ليفية ومصفوفة خارج الخلية. هذا الوسط المعقد يشكل البيئة الدقيقة الورم (TME) ويمكن تعديل الاستجابة للعلاج في الجسم الحي أو استجابة المخدرات على سبيل الكفو. يتم تنفيذ شاشات اكتشاف أدوية السرطان التقليدية على الخلايا المستزرعة في طبقة أحادية ، وهو نظام يفتقر بشكل خطير إلى تأثير TME. وبالتالي ، فإن الأنظمة التجريبية التي تدمج المقالات الحساسة وعالية الإنتاجية مع TME الفسيولوجية ستعزز عملية اكتشاف الأدوية قبل السريرية. هنا، نقدم زراعة شريحة أنسجة ورم الجسم الحي كمنصة لفحص المخدرات متوسطة-عالية الإنتاجية. تشكل زراعة شرائح الأنسجة المنقّبة على وجه التحديد أقسام الورم الرقيقة التي يتم الحفاظ عليها بدعم من غشاء مسامي في واجهة السائل والهواء. في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعداد وصيانة شرائح الأنسجة المعدة من أورام الفئران والأورام من نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX). لتقييم التغيرات في قابلية الأنسجة للاستمرار استجابة للعلاج من المخدرات، استفدنا من فحص قابلية البقاء القائم على الإضاءة المتوافق بيولوجيًا والذي يتيح قياس الخلايا القابلة للحياة في الأنسجة في الوقت الحقيقي والسريع والحساس. باستخدام هذه المنصة، قمنا بتقييم الاستجابات المعتمدة على الجرعة من شرائح الأنسجة إلى مثبط اتيبيز متعدد الكيناز، staurosporine، وعامل السامة للخلايا، دوكسوروبيسين. علاوة على ذلك ، نبين تطبيق شرائح الأنسجة لعلم الأدوية على سبيل الكفيو عن طريق فحص 17 دواءً سريريًا وما قبل سريري على شرائح الأنسجة المعدة من ورم PDX واحد. لدينا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، وحساسة للغاية، وقوية منصة فحص الجسم الحي السابق سوف تعزز إلى حد كبير اكتشاف المخدرات الأورام قبل السريرية واتخاذ القرارات العلاجية.
Introduction
تفاعلات الخلايا السرطانية مع الخصائص الفيزيائية والبيوكيميائية للأنسجة سترومال المحيطة تشكل TME. TME يمكن أن تحفز نمو الورم، الانبثاث، وتعدل استجابة الورم للعلاج1. في تطوير الأدوية التقليدية قبل السريرية ، عادة ما يتم فحص المرشحين للأدوية لأول مرة باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المثقفة ، وهي منصة فحص تفتقر بشكل حرج إلى TME2. هذا النقص في TME الفسيولوجية في مراحل الفحص المسبق القائمة على الخلايا قد يحد من اكتشاف العوامل الفعالة في النماذج الحيوانية الحاملة للورم وقد يساهم في ارتفاع معدل الاستنزاف للعديد من أدوية الأورام الواعدة في المراحل السريرية اللاحقة من التطور3.
على الرغم من أهمية TME في تعديل استجابات أدوية الورم ، فإن القيود التجريبية تحد من تطبيق أنظمة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية خلال المراحل المبكرة من اكتشاف المخدرات وتطويرها. من غير العملي فحص مئات العوامل العلاجية على الأورام من النماذج الحيوانية أو عينات أورام المريض. والواقع أن العينات الجراحية هي موارد شحيحة ذات خلفيات وراثية متنوعة، كما أن فحص الآلاف من الجزيئات المرشحة في النماذج الحيوانية غير ممكن بسبب النطاق التجريبي والتكلفة ورعاية الحيوان.
زراعة شرائح الأنسجة السرطانية ، حيث قطع بدقة ، يتم استزراع أقسام الورم الرقيقة على سبيل المثال ، يمكن معالجة الحد من TME الفسيولوجية في فحوصات فحص الدواء. تاريخيا، كان مجال علم الأعصاب رائداً وحقق تحسينات واسعة النطاق لثقافة الشريحة لأنسجة الدماغ4. في الآونة الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات إعداد شرائح من أنواع مختلفة من الأنسجة السرطانية بما في ذلك الأورام المشتقة من خط الخلية، ونماذج الورم العفوية، xenografts المشتقة من المريض (PDX)، وأورام المريض الرئيسي. الثقافة شريحة الأنسجة الأفو السابقين يدمج فوائد من كل من في الجسم الحي والثقافة في المختبر5. تحافظ شرائح الأنسجة السرطانية على بنية الأنسجة السليمة وتكوين الخلايا المتنوعة ، مما يتيح دراسة الخلايا السرطانية في سياق TME.
يقدم هذا البروتوكول نظام زراعة شرائح أنسجة الورم الأورغية مقرونة بشهادة قابلية البقاء الحساسة للغاية في الوقت الحقيقي لتقييم استجابات الأدوية. اختبارات فعالية الدواء على شرائح أنسجة الورم organotypic في بروتوكولات أدخلت سابقا تعتمد على قياس التغيرات في قابلية الخلية من خلال دمج الصبغة الفلورية، الكيمياء المناعية (IHC)، أو MTT ((3- [4- 5-dimethylthiazol-2-yl]-2، 5 ثنائي الفينيل تترازوليوم بروميد) قياس66،7،,8،,9. ومع ذلك، كل هذه الأساليب هي المقالات نقطة النهاية وتعاني من حساسية منخفضة، وقت المعالجة الطويل، تحليلات البيانات المعقدة، نطاق الإشارة الضيقة، والخطأ التجريبي العالي. يعمل كاشف الخلايا الحية المتوافق مع الخلايا المتوافق مع الخلايا المعتمة على تحسين هذه المقالات من خلال توفير نطاق إشارة واسع وقياس فوري (~ 5 دقيقة) دون معالجة مسبقة والحد الأدنى من المعالجة. هذا الكاشف حساس للغاية ويمكن أن يتعايش في وسائط ثقافة الخلية ، مما يسمح بقياس مستمر وزمني لصلاحية الخلية. ينطبق نظام الفحص هذا على فحص الإنتاجية العالية للمرشحين للأدوية على شرائح الأنسجة في تطوير الأدوية قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع تجارب الفئران وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لقانون رعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية الحيوانات واستخدامها في البحوث الطبية الحيوية.
1. إعداد شرائح أنسجة الورم
- إعداد زراعة شرائح الأنسجة (TSC) متوسطة تتبع الوصفة في الجدول 1. تصفية المتوسطة مع وحدة تصفية فراغ 0.45 ميكرون لتعقيم.
- Aliquot 250 ميكرولتر من TSC متوسطة لكل بئر للوحة بئر 24 ، أو 1 مل من المتوسط لكل بئر للوحة بئر 6. احتفظ باللوحة في حاضنة رطبة بزاوية 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربونحتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تحسين الوسط والمكملات الغذائية اعتمادًا على أنواع الأنسجة والأهداف التجريبية. وينبغي أن تكون كمية المتوسطة ما يكفي لامتصاص الغشاء المسامية من إدراج الثقافة. لا تتجاوز مستوى الغشاء. ضبط مستوى الصوت المتوسط إذا كان المستوى المتوسط منخفضًا جدًا أو مرتفعًا جدًا. إذا كان الباحثون يختبرون عوامل المناعة ، فإننا نوصي بمكملات الوسط مع IL-210. - إذا كان استخدام أنسجة الورم المشتقة من الفئران، القتل الرحيم الفئران مع إجراء الموصى بها، وتعقيم الجلد المكشوف من الفئران عن طريق رش 70٪ الإيثانول، وتشريح الأورام مع تقنيات العقيم. تخزين أنسجة الورم في أنبوب يحتوي على الجليد الباردة هانك محلول الملح المتوازن (HBSS).
- إذا كان استخدام أنسجة أورام المريض الطازجة, تخزين في HBSS الجليد الباردة على المدى القصير, أو الجليد الباردة جامعة بيلزر جامعة ويسكونسن (UW) حل للتخزين على المدى الطويل (تصل إلى 24 ح) للحفاظ على صلاحية الأنسجة.
ملاحظة: تم إعداد شرائح من أنسجة PDX التي يتم شحنها بين عشية وضحاها في حل UW الباردة في الجليد بنجاح. - نقل أنسجة الورم إلى لوحة ثقافة 10 سم تحتوي على HBSS الجليد الباردة. قطع الورم إلى أنصاف مع مشرط في حين غمرت في HBSS الجليد الباردة. شكل أنسجة الورم في اسطوانات باستخدام لكمة خزعة قطرها 6 مم وتقليم جانب واحد لإنشاء سطح مستو. تخزين الأنسجة في HBSS الجليد الباردة حتى الاستخدام.
ملاحظة: تجنب بما في ذلك المنطقة النخرية من الأنسجة، والتي هي عموما في المركز ولها مظهر مبهموهشة. - إعداد الهزاز. تطهير جميع المعدات باستخدام الإيثانول 70٪. ضع علبة عازل الهزاز المغطاة بغطاء زجاجي أكريليك في وسط حمام الثلج الهزاز. إضافة الثلج إلى حمام الجليد وملء علبة عازلة مع HBSS المبردة للحفاظ على برودة الأنسجة أثناء تشريح. نعلق شفرة حلاقة إلى حامل شفرة.
ملاحظة: على الرغم من أن حفظ الهزاز اتّصال في بيئة شبه معقمة لم يؤثر على التجارب السابقة، فمن المستحسن تخزين الهزاز تحت خزانة السلامة البيولوجية إذا كان متوفراً. - رفع بعناية حتى أنسجة الورم اللكم خزعة من HBSS باستخدام ملقط مسنن وإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق dabbing الأنسجة مع منشفة ورقية خالية من الوبر.
- وضع قطرة من الصف الطبي الغراء سيانواكريلات على لوحة عينة ووضع الأنسجة على هذا الانخفاض. الهواء الجاف الغراء لمدة 2-3 دقيقة ووضع لوحة في علبة عازلة. الملحق مع بعض HBSS حتى يتم غمر الأنسجة بالكامل في المخزن المؤقت.
ملاحظة: الأنسجة المتصاعدة في وضع ثابت ومستقر أمر بالغ الأهمية لتوليد شرائح قطع بشكل موحد. إذا كانت الأنسجة المركبة غير مستقرة، فإما إضافة المزيد من الغراء إلى الأنسجة المحيطة للاحتفاظ بوضع ية تستقيم أو تفريغ الأنسجة، وتسطيح القاع، والغراء مرة أخرى. الأنسجة المرنة تميل إلى الحصول على دفع وعازمة بسهولة أكبر أثناء تشريح, وفي هذه الحالة أقصر أطوال (<5 مم) وأشواط متعددة قد تكون مناسبة. بالنسبة للأنسجة الهشة للغاية، يمكن للمناشف الورقية أن تدمر الأنسجة. في هذه الحالة، يمكن وضع الأنسجة على سطح بلاستيكي لفتيل بعيدا بعض HBSS الزائدة. - ضبط إعدادات الهزاز. يتم استخدام الإعدادات التالية: سمك القطع = 250 ميكرومتر، والسعة = 3.00 مم، وسرعة القطع = 0.01-0.25 مم/س، وزاوية الشفرة = 15 درجة-21 درجة.
ملاحظة: تحسين إعدادات تشريح اعتمادا على صلابة الأنسجة. يتم قطع الأنسجة الناعمة بسهولة أكبر مع زاوية شفرة أعمق بسرعة أقل. زاوية شفرة من 18 درجة، وقطع السرعة بين 0.10-0.18 ملم / سنة، وسعة 3.00 ملم يعمل بشكل جيد لأورام الماوس 4T1 و PDX HCI010. يمكن قطع الأنسجة الأكثر صلابة بسرعة شفرة أسرع. - تعيين مواقع البداية والنهاية للشفرة وضبط ارتفاع المرحلة. تشغيل الصك مع وضع مستمر لقطع شرائح لعدة دورات حتى يتم قطع الأنسجة بشكل موحد.
- استمر في تقطيع الأنسجة. نقل شرائح جنبا إلى جنب مع كمية صغيرة من العازلة HBSS على إدراج ثقافة الخلية مع المتوسطة مع ماصة نقل واسعة الطرف، وذلك باستخدام شفط لرفع شريحة كاملة. ضع شريحة واحدة لكل إدراج على لوحة بئر 24. يمكن لإدراج 6 لوحات جيدا استيعاب ما يصل إلى أربع شرائح للفحص تكرار.
ملاحظة: إذا كانت الحافة الأخيرة من شريحة الأنسجة لا تزال متصلة بالأنسجة غير المصقولة، فأوقف الهزاز وفصل شريحة الأنسجة بزوجين من ملقط البقشيش الناعم دون لمس شرائح الأنسجة أو بدسها. شفرة حلاقة منفصلة يمكن أن تكون مفيدة في إزالة الأنسجة المعلقة. - إزالة أي المخزن المؤقت الزائد مع غرامة تلميح نقل pipette.
- عندما يصل النصل إلى مكان قريب من الأنسجة الملتصقة، أوقف الأداة، ويخفض المرحلة، ويزيل الأنسجة المتصلبة بشفرة منفصلة، ويشن نسيجًا جديدًا. استمر في التقطيع حتى يتم جمع شرائح كافية.
- ثقافة لوحات في حاضنة رطبة تعيين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. يتم استزراع شرائح الأنسجة في الطور البيني بين الهواء والسائل على إدراج ثقافة الخلية. شرائح الأنسجة جاهزة للتجارب 24-48 ساعة بعد إعداد الشريحة الأولية. للزراعة على المدى الطويل، وتبادل المتوسطة كل 2-3 أيام.
2- قياس الجدوى
- لقياس الجدوى من شريحة الأنسجة، تبادل المتوسطة مع كاشف قياس قابلية البقاء القائمة على الإنارة التي تحتوي على كل من لوسيفيراز وprosubstrate في 1:1،000 تخفيف في وسط TSC بعد تعليمات الشركة المصنعة. يقيس الكاشف نشاط تقليل الخلايا الحية من الركيزة الأيضية إلى لوسيفيرين11. نقل 50 ميكرولتر من خليط الأنزيم الركيزة على رأس كل شريحة من الأنسجة.
- احتضان مع الانفعالات لطيف على شاكر المداري ة تقع داخل حاضنة رطبة تعيين في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
- يمكن قياس إشارات الإنارة باستخدام قارئ ميكروبليت أو أداة تصوير في الجسم الحي للأنسجة المستزرعة في لوحة بئر 24. لقياس قابلية الأنسجة المتعددة الفردية على لوحة بئر 6 ، يجب استخدام نظام تصوير في الجسم الحي.
- عند استخدام قارئ microplate، تعيين microplate دون غطاء. أي نوع من قارئ microplate قادرة على قياس كثافة الإنارة ينبغي أن تكون مناسبة للتجربة. استخدمنا الإعدادات التالية: قراءة الوقت = 1 s، القياس من الأعلى، كسب = 200.
ملاحظة: للحصول على دقة أعلى، استخدم لوحة صغيرة ذات جدار أبيض لإعداد التجربة. تم اختبار الجدار الأبيض ، واضحة القاع 24 لوحات البئر ، وفي معظم الحالات ، لوحات جيدة واضحة لا تعرض للخطر النتائج. - عند استخدام نظام تصوير في الجسم الحي لقياس الجدوى، ضع اللوحة في وسط المرحلة وإزالة الغطاء. الحصول على الصور الفوتوغرافية العادية تليها الصور الإنارة مع حقل الإعداد المرحلة في C، وقت التعرض السيارات، و توقف = 1، الإعداد الموضوعي كما microplate مع ارتفاع الموضوع = 0.0 سم.
- قياس كثافة الإنارة باستخدام برنامج التصوير يرافقه في نظام التصوير في الجسم الحي. رسم مناطق متسقة من الفائدة (ROI) حول كل شريحة الأنسجة. يستخدم هذا البروتوكول دائرة قطرها 1 سم كعائد استثمار (انظر الشكل 1). قياس التدفق الإجمالي (p/s) للمنطقة.
- عند استخدام قارئ microplate، تعيين microplate دون غطاء. أي نوع من قارئ microplate قادرة على قياس كثافة الإنارة ينبغي أن تكون مناسبة للتجربة. استخدمنا الإعدادات التالية: قراءة الوقت = 1 s، القياس من الأعلى، كسب = 200.
3- تقييم تأثير المخدرات على شرائح الأنسجة
- قياس قابلية الخط الأساسي للاستمرار قبل العلاج باستخدام كاشف قياس الجدوى القائم على الإضاءة على النحو المبين في القسم 2.
ملاحظة: إذا كان العديد من الأنسجة أقل بكثير من الجدوى بالمقارنة مع الآخرين، حذف الأنسجة من القياس. - إذابة الأدوية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لجعل حلول الأسهم. إعداد محلول المخدرات 10x مع TSC أو غيرها من الثقافة المتوسطة (25 ميكرولتر / جيدا للوحة بئر 24 تحتوي على 250 ميكرولتر من المتوسط) في تركيزات المطلوب. للتحكم في السيارة، قم بإعداد وسيط يحتوي على حجم مكافئ من DMSO.
- تكملة حل المخدرات 10x إلى وسط الثقافة في الجزء السفلي من البئر. مزيج عن طريق الأنابيب ونقل 50 ميكرولتر من المتوسط على رأس الأنسجة.
ملاحظة: إذا كانت هناك عدة شرائح نسيج متوفرة، قم باختبار التكرارات أو ثلاثية لكل حالة. - احتضان بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف على شاكر المداري في 37 درجة مئوية, 5% CO2,حاضنة الترطيب.
- إزالة لوحة من شاكر واحتضان بشكل ثابت في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،حاضنة الترطيب.
- عند النقاط الزمنية المطلوبة، قم بقياس كثافة الإنارة من الأنسجة باستخدام قارئ ميكروبليت أو في نظام تصوير في الجسم الحي. عادة، تصبح آثار المخدرات قابلة للكشف بعد 1-6 أيام من العلاج.
ملاحظة: كاشف قابلية التشغيل المستندة إلى الإنارة مستقر لمدة 3 أيام على الأقل في ظل ظروف الثقافة. ومع ذلك ، قد يتم استنفاد الركيزة أثناء عملية الفحص اعتمادًا على النشاط الأيضي للأنسجة. إذا لوحظ انخفاض إشارة كبيرة في الأنسجة مع إشارات عالية سابقا, تكملة الركيزة في جميع الآبار. - حساب الجدوى المتبقية من أنسجة الورم المعالجة باستخدام المعادلة التالية:
يتم تطبيع صلاحية الأنسجة المعالجة من خلال قابليتها للاستمرار الأساسية وتحول قابلية البقاء لأنسجة الورم المكافحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، ونحن نظهر دورة زمنية، بروتوكول تقييم فعالية المخدرات متعددة لشرائح أنسجة الورم أعدت من الماوس 4T1 أنسجة ورم الثدي ونموذج PDX سرطان الثدي، HCI01012. قمنا بإعداد شرائح الأنسجة بنجاح من العديد من الأورام المشتقة من الماوس ، PDX ، وأورام المريضالطازجة 10. ويرد وصف سير العمل العام لإعداد أنسجة الورم واختبار فعالية الدواء في الشكل 1. بشكل عام، يمكننا إعداد شرائح الأنسجة 20-40 من ورم واحد السائبة من 1000-1500 ملم3 في الحجم.
بالنسبة لقياسات الجدوى، قمنا باستغلال كاشف قابلية البقاء المتوافق مع الخلايا الحية والقائم على الإنارة. علاج مثبط الكيناز المتعدد ، staurosporine ، بتركيز 1 ميكرومتر لمدة 4 أيام قلل من كثافة الإشارة بمقدار 100 x ، مقارنة بأنسجة الورم المعالجة بالتحكم في DMSO(الشكل 2A). تم الحفاظ على شرائح الأنسجة المعدة من ورم 4T1 لمدة 21 يومًا على الأقل مع تبادل متوسط عرضي(الشكل 2B). تم إجراء معظم قياسات الاستجابة للأدوية في غضون 7 أيام من إعداد شرائح الأنسجة. نظرًا لأن الكاشف الحي المتوافق مع الخلية لا يتطلب المعالجة أو التثبيت قبل القياس ، فقد سمح لنا بإجراء قياسات مسار الوقت. يتم تلخيص التغيرات المعتمدة على الوقت في صلاحية شرائح أنسجة الورم من أنسجة الورم 4T1 متطابقة في الشكل 2C. Staurosporine في 500 nM انخفض التلألوؤ من اليوم 1 ووصلت إلى أدنى مستوى في اليوم 4، وتبقى منخفضة لكل نقطة زمنية لاحقة. وعلى النقيض من ذلك، ظلت كثافة الإنارة من مجموعة التحكم من الأنسجة المكملة DMSO مستقرة حتى اليوم 6. بالإضافة إلى ذلك ، تم علاج شرائح الأنسجة المعدة من أورام 4T1 متطابقة بجرعات متسلسلة من الستاوروسبورين (0-1 ميكرومتر) لمدة 4 أيام ، وأظهرت تغييرات تعتمد على الجرعة في قابلية البقاء وEC50 (الشكل 2D).
اختبرنا الأدوية العلاجية الكيميائية على شرائح الأنسجة المعدة من نموذج PDX تقويم العظام لسرطان الثدي, HCI010. تم التعامل مع شرائح الأنسجة PDX مع doxorubicin, دواء العلاج الكيميائي القياسية, بجرعات من 0-5 ميكرومتر لمدة 6 أيام, توفير التغييرات التي تعتمد على الجرعة في قابلية البقاء(الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، تم اختبار فعالية 17 دواء، بما في ذلك الأدوية المعتمدة قبل السريرية وسريريا، في ثلاثة مرات على شرائح الأنسجة المعدة من ورم HCI010 واحد السائبة. تم تطبيق الأدوية عند 0.5 ميكرومتر لمدة 4 أيام في ثلاثية(الشكل 3B). توفر هذه النتائج إثباتًا للمفهوم الذي يمكن إجراء فحص المخدرات متوسط الإنتاجية على شرائح الورم مع TME الأصلي.
الشكل 1: التخطيطي يظهر إعداد شريحة الأنسجة متبوعاً بتقييم فعالية الدواء. تمت معالجة أنسجة الورم إلى شرائح قطرها 6 مم وسمكها 250 ميكرومتر واستزراعها في الطور البيني للسائل الهوائي بدعم من إدراج اتّصال الخلايا. تم قياس صلاحية الأنسجة باستخدام كاشف حيوي قبل وبعد العلاج بالعقاقير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس قابلية شريحة الأنسجة للصلاحية والاستجابة للأدوية. (أ)صور تمثيلية لقياسات الجدوى القائمة على الإضاءة في شرائح أنسجة ورم الثدي. تم احتضان شرائح الأنسجة من ورم 4T1 مع 1 μM staurosporine أو DMSO السيطرة جنبا إلى جنب مع كاشف القدرة على البقاء الإنارة صالحة لمدة 4 أيام. تم الحصول على الصور باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي وتحليلها من خلال برامج تحليل الصور المصاحبة. تشير الدوائر الحمراء إلى عائد الاستثمار الذي تم قياسه للإضاءة الحيوية. أسفل = مؤامرة تظهر إشارة مضيئة من شرائح أنسجة الورم المعالجة مع staurosporine أو التحكم كما تقاس في نظام التصوير في الجسم الحي. شريط يشير إلى متوسط شرائح الأنسجة الأربع المعروضة كدوائر (التحكم) أو مربع (staurosporine المعالجة). (ب)مؤامرة تظهر جدوى 4T1 شرائح الأنسجة الورم المستزرعة لمدة 21 يوما من التحضير. تم تطبيع الجدوى في اليوم 21 التي تقاس بنظام تصوير في الجسم الحي إلى أن من اليوم 3. كل نقطة تشير إلى القياس من شريحة واحدة; شريط يشير إلى المتوسط؛ يظهر المربع quartiles، وشعيرات تظهر الحد الأدنى إلى أقصى قيمة للقياس. (C)قياسات دورة الزمن من صلاحية الأنسجة بعد علاج staurosporine. تم قياس صلاحية شرائح الأنسجة من الورم 4T1 المعالج بالستاوروسبورين (500 nM) أو ما يعادلحجم DMSO كتحكم بمرور الوقت. تم قياس كثافة الإضاءة بواسطة قارئ ميكروبليت على النقاط الزمنية المشار لها. توضح كل نقطة نقطة بيانات من شريحة نسيج فردية ، ويشير الرسم البياني الشريطي إلى متوسط SEM. (D) العلاج المعتمد على الجرعة من staurosporine على شرائح الأنسجة. تم استكمال شرائح الأنسجة المعدة من ورم 4T1 بجرعات متسلسلة من الستاوروسبورين أو DMSO كتحكم في السيارة. تم قياس قابلية البقاء المتبقية على أساس التلألّان من خلال نظام تصوير في الجسم الحي بعد 4 أيام من بدء العلاج. تم حساب الجدوى النسبية باستخدام المعادلة الموضحة في البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: شاشة الدواء في شرائح الأنسجة المعدة من نموذج PDX سرطان الثدي. (أ)مؤامرة تبين التغيرات في قابلية البقاء استجابة لجرعات مختلفة من دوكسوروبيسين. تم إعداد شرائح الأنسجة من ورم PDX سرطان الثدي التقويمية، HCI010. تم قياس قابلية البقاء في شرائح تعامل مع جرعات titrated من دوكسوروبيسين. بعد 6 أيام ، تم قياس التلألؤ باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي. شريط = يعني ± SEM.(B)على نطاق صغير العلاج الكيميائي فحص المخدرات على شرائح أنسجة الورم من ورم سرطان الثدي PDX تقويم العظام. الرسم البياني شريط = يعني ± SEM من تجربة ثلاثية. وقد نشرت هذه البيانات سابقا10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المواد | مل | التركيز النهائي | الاسهم |
| وليام المتوسطة E | 500 | ||
| نيكوتيناميد | 6 | 12 متر متر مربع | 1 م مخزون من نيكوتيناميد في وليامز 'M المتوسطة E، معقم |
| حمض الأسكوربيك | 6 | 50.4 ميكروغرام/مل | 0.21 غ/50 مل (أكثر من 10 مليون متر) من حمض الأسكوربيك في M متوسطة وليام، معقم |
| بيكربونات الصوديوم | 15 | 2.25 ملغ/مل | 7.5% (ث/v) حل |
| مخزن العازلة HEPES | 10 | 20 متر متر مربع | 1 M حل المخزون |
| الجلوكوز | 10 | 5 ملغ/مل | 250 ملغ/مل مخزون، مجسم |
| بيروفات الصوديوم | 5 | 1 متر متر | 100 متر مخزون |
| L-الجلوتامين | 5 | 2 mM | 200 متر مربع |
| ITS + بريميكس | 5 | يحتوي على الأنسولين المؤتلف البشري، ونقل الإنسان (12.5 ملغ لكل منهما)، حمض سيلينوس (12.5 ميكروغرام)، BSA (2.5 غرام)، وحمض اللينوليك (10.7 ملغ) | |
| البنسلين-ستريبتوميسين | 2 | 40 IU/mL القلم، 40 ميكروغرام/مل العقدية | 10,000 وحدة دولية/مل القلم، 10,000 ميكروغرام/مل العقدية |
| EGF المؤتلف | 0.5 | 20 نانوغرام/مل | 20 ميكروغرام/مل مخزون |
الجدول 1: وصفة متوسطة TSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نظهر منصة لدراسات فعالية المخدرات الكمية والوقت الحقيقي على شرائح أنسجة الورم organotypic. يوفر نظام زراعة شرائح الأنسجة مزايا متميزة على الطرق المختبرية التقليدية القائمة على الخلايا من خلال التقاط عدم تجانس الخلايا والخصائص الفسيولوجية للبيئة الدقيقة للورم الأصلي. هذه المنصة تمكن أيضا إنتاجية أعلى لاختبار فعالية الدواء، مما يساعد على سد الفجوة بين الدراسات ثقافة الخلية وفي التجارب على الجسم الحي.
للحصول على نتائج دقيقة ومتسقة ، من الضروري تقليل تلف الأنسجة أثناء التحضير. وينبغي التعامل مع شرائح الأنسجة مع الماصة البلاستيكية تلميح واسعة لتجنب الأضرار الناجمة عن الاتصال الجسدي. يجب الحفاظ على حجم الثقافة المتوسطة للسماح لشريحة الأنسجة بالاتصال بكل من الهواء والمتوسطة طوال مدة التجربة.
يجب تحسين وسيط الثقافة اعتمادًا على نوع الأنسجة والغرض التجريبي. وTSC المتوسطة المستخدمة في هذا البروتوكول هو وسيلة خالية من المصل التي وضعت أصلا لثقافة الكبدالأولية 13. وقد استخدمت هذه الوسيلة أيضا للحفاظ على عدة أنواع من الأورام، بما في ذلك الثدي والكبد والقولون والبنكرياس10. علاوة على ذلك ، أظهرنا تعزيز بقاء الخلايا المناعية باستخدام متوسط يستند إلى DMEM الأمثل10. يجب تحسين إعدادات Vibratome استنادًا إلى نسيج النسيج للحصول على شرائح أنسجة الورم سليمة وموحدة. عادة ما يتم إجراء تقطيع الأنسجة الناعمة و / أو الموحدة بشكل فضفاض أسهل باستخدام زوايا شفرة أعمق ، وسرعة قطع أبطأ ، وشرائح أكثر سمكًا. في بعض الأحيان ، تكون الأنسجة ناعمة جدًا بحيث لا يمكن قطعها ، وفي هذه الحالة يجب على الباحثين التفكير في تضمين الأنسجة داخل نقطة انصهار منخفضة agarose ، وهي تقنية شائعة في أنسجة الدماغ تشريح14،15.
في السابق، أدخلت العديد من الدراسات طرق اختبار الأدوية العلاجية على شرائح الأنسجة المستزرعة. اعتمدت هذه الدراسات على دمج صبغة الفلورسنت، الكيمياء المناعية، أو ماختبارات MTT لتقييم صلاحية الأنسجة6،7،8،9. في هذا البروتوكول، استخدمنا الكاشف الحي المتوافق مع الخلايا المضيئة RealTime-Glo11 لقياس الجدوى. المقالات القائمة على الإضاءة لها العديد من الفوائد على الطرق المستخدمة سابقا، بما في ذلك زيادة الحساسية، ونطاق أوسع للإشارة، والقدرة على إجراء قياسات الجدوى في الوقت الحقيقي بسرعة. قياس الوقت قصير لكل من القراء microplate (~ 1 ق / جيدا) ونظام التصوير في الجسم الحي (~ 1 دقيقة / لوحة) ويمكن أن توفر قراءات كثافة الإشارة مباشرة مع الحد الأدنى من المعالجة. إن الاستحواذ الأسرع على الإشارة وتقليل خطوات ما بعد المعالجة هي ميزات ضرورية في فحص الأدوية عالية الإنتاجية ، مما يسمح بقياسات الجدوى المستندة إلى اللوسيفرين لتمكين إنتاجية عينة أكبر بكثير في زراعة شرائح الأنسجة. في حين أن القياس القائم على اللوسيفز يوفر قياسًا دقيقًا وكمية لقابلية الشريحة الكاملة للحياة ، إلا أنها غير قادرة على اكتشاف التغيرات الخاصة بنوع الخلايا الناجمة عن المخدرات في الأنسجة. ومع ذلك، فإن اقتران قياسات الجدوى المستندة إلى الإضاءة مع نقطة النهاية IHC على شريحة الأنسجة نفسها سيمكن القياسات الخاصة بنوع الخلية.
في حين أن نظام زراعة شرائح الأنسجة هو أداة قوية في جلب تعقيد أنسجة الورم إلى منصة فحص عالية الإنتاجية ، إلا أنه يحتوي على العديد من العيوب. التغاير المتأصل داخل نسيج الورم قد يسبب استجابات المخدرات التفاضلية بين شرائح الأنسجة حتى من نفس الورم السائبة. في بعض الأحيان ، لاحظنا اختلافات كبيرة نسبيًا في استجابة الدواء بين شرائح الأنسجة في تجاربنا. يمكننا التغلب جزئيا على هذا الاختلاف عن طريق متوسط شرائح الأنسجة المتعددة المعدة من مواقع مختلفة داخل نفس الورم. على الرغم من أنه يمكن الحفاظ على زراعة شرائح الأنسجة عند مستوى خط الأساس من الجدوى لمدة 21 يومًا على الأقل(الشكل 2B)، تتغير مجموعات الخلايا بمرور الوقت. لقد وصفنا التحولات في عدد الخلايا المناعية خلال تجارب زراعة شرائح الأنسجة10. لذلك ، نوصي بدراسة شرائح الأنسجة على فترات زمنية أقصر لتلخيص خصائص الأنسجة الأصلية.
ومن المتوقع أن تملأ زراعة شرائح الأنسجة فجوة حرجة في اكتشاف المخدرات وتطورها بين فحص ثقافة الخلايا عالية الإنتاجية والتجارب على الحيوانات. يمكن تقييم مئات الأدوية على شرائح يتم إنتاجها من خزعة ورم واحد ، مما يضيف زيادة الصلة الفسيولوجية قبل الدراسات الحيوانية. ويمكن أن يساعد هذا النظام على تقليل عدد التجارب على الحيوانات اللازمة لجلب المخدرات إلى السوق. وعلاوة على ذلك، فإن شرائح الأنسجة المعدة من أورام المريض لديها إمكانات مفيدة في توجيه خطط العلاج في العيادة. أكثر من مائة دواء علاجي متوفرة اليوم ، ومع ذلك هناك عدد قليل من المؤشرات الحيوية لتوجيه اختيارهم. وعلاوة على ذلك، فإن عدم التجانس في المرضى يؤدي أيضا إلى تفاوتات في الاستجابة. يمكن استخدام شرائح الأنسجة من خزعة المريض لاختبار أدوية متعددة قبل العلاج بشكل منهجي ، مما يوفر معلومات قيمة عن فعالية الدواء في غضون أسبوع. عموما، في الوقت الحقيقي والسريع اختبار المخدرات باستخدام أنظمة زراعة شرائح الأنسجة لديها إمكانات كبيرة في تطوير أدوية السرطان والقرارات العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NCI [K22CA201229 ، P30CA015704] ، ومؤسسة سيدني كيميل [جائزة الباحث كيميل] ، جائزة اكتشاف سرطان الرئة (LCD-505536). نود أن نشكر الدكتورألا نالة (جامعة يوتا) لتوفير سرطان الثدي PDX الورم. كما نود أن نشكر العاملين في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في الطب المقارن على صيانة نموذج PDX وأعضاء مختبر غوجرال على المناقشات المفيدة. يتم دعم N.N.A من قبل زمالة JSPS للبحوث في الخارج ومنحة التدريب متعددة التخصصات من FHCRC. ويدعم A.J.B. من قبل عملية التمثيل الغذائي للكروموسوم ومنحة التدريب على السرطان من FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
