Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi
Summary
Organotipik tümör doku dilimlerinde gerçek zamanlı ilaç yanıtını ölçmek için bir protokol uyguluyoruz. Burada özetlenen deneysel strateji, ekstrem koşullarda klinik veya fare tümörlerinden elde edilen doku dilimlerinde orta-yüksek iş yapma ilaç ekranları yürütmek için bir platform sağlar.
Abstract
Tümör dokuları kanserli hücreleroluşur, infiltrasyon bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, ve ekstrasellüler matriks. Bu karmaşık ortam tümör mikroçevresini (TME) oluşturur ve in vivo veya ilaç yanıtı ex vivo tedaviye yanıtı modüle edebilir. Konvansiyonel kanser ilaç keşif ekranları tek katmanlı kültürlü hücreler üzerinde yapılır, kritik TME etkisi yoksun bir sistem. Böylece, hassas ve yüksek iş yapma lı tahlilleri fizyolojik TME ile birleştiren deneysel sistemler klinik öncesi ilaç keşif sürecini güçlendirecektir. Burada, orta-yüksek-eldeli ilaç taraması için bir platform olarak ex vivo tümör doku dilimi kültürü tanıtmak. Organotipik doku dilimi kültürü, sıvı hava arabiriminde gözenekli bir zarın desteği ile sürdürülen hassas kesimli, ince tümör kesitleri oluşturur. Bu protokolde fare tümörlerinden ve hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinden alınan tümörlerden hazırlanan doku dilimlerinin hazırlanması ve sürdürülmesi ni açıklanmıştır. İlaç tedavisine yanıt olarak doku canlılığındaki değişiklikleri değerlendirmek için, dokudaki canlı hücrelerin gerçek zamanlı, hızlı ve hassas ölçümlerini sağlayan biyouyumlu lüminesans tabanlı canlılık testinden yararlandık. Bu platformu kullanarak doku dilimlerinin çoklu kiril inhibitörü, staurosporin ve sitotoksik ajan doksorubisin’e verdiği doza bağlı yanıtları değerlendirdik. Ayrıca, tek bir PDX tümöründen hazırlanan doku dilimleriüzerinde 17 klinik ve preklinik ilaç taranarak ex vivo farmakoloji için doku dilimlerinin uygulanmasını gösteriyoruz. Fizyolojik olarak ilgili, son derece hassas ve sağlam ex vivo tarama platformumuz klinik öncesi onkoloji ilaç keşfini ve tedavi karar verme kararını büyük ölçüde güçlendirecektir.
Introduction
Kanser hücresi etkileşimleri ile çevreleyen stromal dokunun fiziksel ve biyokimyasal özellikleri TME’yi oluşturur. TME tümör büyümesini uyarabilir, metastaz, ve tedaviye tümör yanıtı modüle1. Konvansiyonel klinik öncesi ilaç geliştirmede, ilaç adayları genellikle ilk kültürlü kanser hücre hatları kullanılarak taranır, kritik TME yoksun bir test platformu2. Hücre bazlı ön tarama aşamalarında fizyolojik TME Bu eksikliği tümör taşıyan hayvan modellerinde etkili ajanların keşfi ni sınırlayabilir ve gelişmenin daha sonraki klinik aşamalarında birçok umut verici onkoloji ilaçların yüksek yıpranma oranına katkıda bulunabilir3.
TME’nin tümör ilaç yanıtlarının modüle edilmesindeki önemine rağmen, deneysel kısıtlamalar ilaç keşfi ve gelişiminin erken aşamalarında fizyolojik olarak daha alakalı sistemlerin uygulanmasını sınırlandırmaktadır. Hayvan modellerinden veya hasta tümör örneklerinden tümörler de yüzlerce terapötik ajanın taranması pratik değildir. Gerçekten de, cerrahi örnekler çeşitli genetik geçmişe sahip kıt kaynaklardır ve hayvan modellerinde binlerce aday molekülün taranması deneysel ölçek, maliyet ve hayvan refahı nedeniyle mümkün değildir.
Tümör doku dilimi kültürü, tam olarak kesilmiş, ince tümör bölümleri kültürlü ex vivo, ilaç tarama tahlillerinde fizyolojik TME sınırlama adresi olabilir. Tarihsel olarak, nöroloji alanında öncülük ve beyin dokusu için dilim kültürünün geniş optimizasyonlar yaptı4. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, hücre hattı kaynaklı tümörler, spontan tümör modelleri, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) ve primer hasta tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli tümör dokusu tiplerinden dilimlerin hazırlanmasını göstermiştir. Ex vivo doku dilimi kültürü hem in vivo hem de in vitro kültür5yararları entegre. Tümör doku dilimleri bozulmamış doku mimarisi ve alacalı hücre bileşimi korumak, TME bağlamında kanser hücrelerinin çalışma sağlayan.
Bu protokol, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için gerçek zamanlı, son derece hassas bir canlılık testile birlikte bir organotipik tümör doku dilimi kültür sistemi tanıttı. Daha önce tanıtılan protokollerde organotipik tümör doku dilimleri üzerinde ilaç etkinliği testleri floresan boya dahil, immünohistokimya (IHC) veya MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenil tetrazolium bromür) tahlil6,,7,8,9. Ancak, tüm bu yöntemler in bitiş noktası tahlilleri dir ve düşük hassasiyet, uzun işlem süresi, karmaşık veri analizleri, dar sinyal aralığı ve yüksek deneysel hata dan muzdariptir. Bizim lüminesans tabanlı canlı hücre uyumlu reaktif geniş bir sinyal aralığı ve anlık (~ 5 dakika) ölçüm ön işleme ve minimum post processing olmadan sağlayarak bu tahlilleri geliştirir. Bu reaktif son derece hassastır ve hücre kültürü medyasında bir arada bulunabilir, hücre canlılığının sürekli ve zaman içinde ölçülmesine izin verir. Bu araştırma sistemi, klinik öncesi ilaç gelişiminde ilaç adaylarının doku dilimleri üzerinde yüksek işlem taraması için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, organotipik tümör doku dilimleri üzerinde kantitatif ve gerçek zamanlı ilaç etkinliği çalışmaları için bir platform gösteriyoruz. Doku dilimi kültür sistemi, hücre heterojenliğini ve doğal tümör mikroortamının fizyolojik özelliklerini yakalayarak geleneksel hücre bazlı in vitro yöntemlere göre farklı avantajlar sağlar. Bu platform aynı zamanda uyuşturucu etkinliği testi için daha yüksek verim sağlar, hücre kültürü çalışmaları ve in vivo deneyler arasındaki boşlu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] ve Sidney Kimmel Vakfı [Kimmel Scholar Award], Akciğer Kanseri Discovery Ödülü (LCD-505536) tarafından desteklendi. Biz Dr Alana Welm (Utah Üniversitesi) meme kanseri PDX tümör sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Karşılaştırmalı Tıp, Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi (FHCRC) pdx modeli ve yararlı tartışmalar için Gujral laboratuvar üyeleri bakımı için personel teşekkür etmek istiyorum. N.N.A, FHCRC’nin JSPS Yurtdışı Araştırma Bursu ve Disiplinlerarası Eğitim Bursu ile desteklenir. A.J.B. FHCRC’den Kromozom Metabolizması ve Kanser Eğitim Bursu ile desteklenir.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
