Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver
Summary
Vi indfører en protokol til måling af medicinsk respons i realtid i organotypic tumorvævsskiver. Den eksperimentelle strategi, der er skitseret her giver en platform til at udføre medium-høj gennemløb narkotika skærme på væv skiver stammer fra kliniske eller mus tumorer i ex vivo betingelser.
Abstract
Tumorvæv er sammensat af kræftceller, infiltrerede immunceller, endotelceller, fibroblaster, og ekstracellulære matrix. Dette komplekse miljø udgør tumor mikromiljø (TME) og kan modulere respons på behandling in vivo eller lægemiddelrespons ex vivo. Konventionelle kræft stof opdagelse skærme udføres på celler dyrket i et monolag, et system kritisk mangler indflydelse TME. Således vil forsøgssystemer, der integrerer følsomme analyser med høj gennemløb med fysiologisk TME, styrke den prækliniske lægemiddelopdagelsesproces. Her introducerer vi ex vivo tumorvæv skive kultur som en platform for medium-high-throughput narkotika screening. Organotypic væv skive kultur udgør præcist-cut, tynde tumor sektioner, der opretholdes med støtte fra en porøs membran i en flydende luft interface. I denne protokol beskriver vi forberedelse og vedligeholdelse af vævsskiver fremstillet af musetumorer og tumorer fra patient-afledte xenograft (PDX) modeller. For at vurdere ændringer i vævslevedygtighed som reaktion på narkotikabehandling udnyttede vi en biokompatibel luminescensbaseret levedygtighedsanalyse, der muliggør hurtig og følsom måling af levedygtige celler i vævet i realtid. Ved hjælp af denne platform evaluerede vi dosisafhængige reaktioner af vævsskiver på multikinasehæmmeren, staurosporin og cytotoksisk middel, doxorubicin. Endvidere demonstrerer vi anvendelsen af vævsskiver til ex vivo farmakologi ved screening 17 kliniske og prækliniske lægemidler på vævsskiver fremstillet af en enkelt PDX tumor. Vores fysiologisk relevante, meget følsomme og robuste ex vivo screening platform vil i høj grad styrke prækliniskonologi lægemiddelopdagelse og behandling beslutningstagning.
Introduction
Kræft celle interaktioner med de fysiske og biokemiske egenskaber af de omkringliggende stromale væv danner TME. TME kan stimulere tumorvækst, metastase, og modulere tumor respons på terapi1. I konventionelle prækliniske lægemiddeludvikling, er narkotika kandidater typisk først screenet ved hjælp af kulturformekræft cellelinjer, en analyse platform, der kritisk mangler TME2. Denne mangel på fysiologiskt TME i cellebaserede præscreeningsfaser kan begrænse opdagelsen af effektive midler i tumorholdige dyremodeller og kan bidrage til den høje nedslidningsrate for mange lovende onkologilægemidler i senere kliniske udviklingsstadier3.
På trods af betydningen af TME i modulerende tumor stof svar, eksperimentelle begrænsninger begrænse anvendelsen af mere fysiologisk relevante systemer i de tidlige stadier af narkotika opdagelse og udvikling. Det er upraktisk at screene hundredvis af terapeutiske midler på tumorer fra dyremodeller eller patient tumor prøver. Faktisk er kirurgiske prøver knappe ressourcer med forskellige genetiske baggrunde og screening tusindvis af kandidat molekyler i dyremodeller er ikke muligt på grund af eksperimentelle skala, omkostninger og dyrevelfærd.
Tumorvæv skive kultur, hvor præcist skåret, tynde tumor sektioner er dyrket ex vivo, kan løse begrænsningen af fysiologiske TME i narkotika screening assays. Historisk, inden for neurovidenskab banebrydende og gjort omfattende optimeringer af skive kultur for hjernevæv4. For nylig har mange undersøgelser vist forberedelse af skiver fra forskellige typer af tumorvæv, herunder cellelinje-afledte tumorer, spontane tumormodeller, patient-afledte xenografts (PDX), og primære patient tumorer. Ex vivo væv skive kultur integrerer fordele fra både in vivo og in vitro kultur5. Tumorvæv skiver bevarer intakt væv arkitektur og brogede cellesammensætning, gør det muligt at studere kræftceller i TME sammenhæng.
Denne protokol indfører en organotypic tumorvæv skive kultur system kombineret med en real-time, meget følsom levedygtighed assay at evaluere narkotika reaktioner. Drug effekt test på organotypic tumorvæv skiver i tidligere indførte protokoller er afhængige af måling af ændringer i cellernes levedygtighed ved fluorescerende farvestof inkorporering, immunhistokemi (IHC), eller MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromid) analyse6,7,8,9. Men alle disse metoder er slutpunktsanalyser og lider af lav følsomhed, lang behandlingstid, komplekse dataanalyser, et snævert signalområde og høje eksperimentelle fejl. Vores luminescensbaserede levende cellekompatible reagens forbedrer disse analyser ved at give et bredt signalområde og øjeblikkelig (~5 min) måling uden forudgående behandling og minimal efterbehandling. Dette reagens er meget følsomt og kan eksistere side om side i cellekulturmediet, hvilket muliggør kontinuerlig og tidsforløbsmåling af cellelevedygtighed. Dette analysesystem gælder for screening af lægemidler med høj gennemløb på vævsskiver i præklinisk lægemiddeludvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, Vi viser en platform for kvantitative, og real-time drug effektivitet undersøgelser på organotypic tumorvæv skiver. Vævsskivekultursystemet giver klare fordele i forhold til traditionelle cellebaserede in vitro-metoder ved at opfange celleheterogenitet og fysiologiske egenskaber af det oprindelige tumormikromiljø. Denne platform muliggør også højere gennemløb for test af lægemiddeleffektivitet, hvilket bidrager til at bygge bro mellem cellekulturstudier og in vivo-eksperimenter.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] og Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Vi vil gerne takke Dr. Alana Welm (University of Utah) for at give brystkræft PDX tumor. Vi vil også gerne takke personalet på Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) for vedligeholdelse af PDX model og medlemmer af Gujral lab for nyttige diskussioner. N.N.A er støttet af JSPS Overseas Research Fellowship og tværfaglig uddannelse Tilskud fra FHCRC. A.J.B. understøttes af kromosommetabolismen og kræfttræningstilskuddet fra FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
