Summary
אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת סמים בזמן אמת בפרוסות רקמת הגידול organotypic. האסטרטגיה הניסיונית המתוארים כאן מספקת פלטפורמה לביצוע מסכי סמים בינוניים בעלי תפוקה גבוהה על פרוסות רקמה הנגזרות מגידולים קליניים או של העכבר בתנאים vivo לשעבר.
Abstract
רקמות הגידול מורכבות של תאים סרטניים, לחדור תאים חיסוניים, תאי האנדותל, פיברוהפיצוצים, ומטריקס מסחטות. הסביבה המורכבת הזאת מהווה את מיקרואקולוגיה של הגידול (TME) והיא יכולה לווסת את התגובה לטיפול בvivo או בתגובה לסם vivo לשעבר. מסכי גילוי סמים קונבנציונליים של הסרטן מתבצעים על תאים שאינם מתורבתים במונאולייר, מערכת שחסרה באופן ביקורתי בהשפעת TME. לפיכך, מערכות נסיוניות המשלבות רגישות ותפוקה גבוהה מספר עם TME פיסיולוגי יחזק את תהליך גילוי התרופות הקדם-קליני. כאן, אנו מציגים לשעבר vivo רקמות הגידול לחתוך את התרבות כפלטפורמה בינונית-high-תפוקה ההקרנה התרופה. התרבות הפרוסה של רקמות הרקמה האורגנותית מהווה חיתוך מדויק של מקטעי גידול דקים הנשמרים בתמיכת קרום נקבובי בממשק באוויר הנוזלי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההכנה והתחזוקה של פרוסות רקמה המוכנים מגידולים בעכבר וגידולים מדגמי מבע מטופל (pdx). כדי להעריך את השינויים בכדאיות של רקמות בתגובה לטיפול בסמים, אנו ממונפת את היכולת הביונסעית המבוססת על ביונציה המאפשרת מדידה בזמן אמת, מהירה ורגישה של תאים מתאימים ברקמה. באמצעות פלטפורמה זו, הערכנו הערכת תגובות תלויי-מינון של פרוסות רקמה לחומר מעכבי רב-קינאז, סטרוספורטין, וסוכן ציטוטוקסי, דוקסורוביצין. יתר על כן, אנו להדגים את היישום של פרוסות רקמה עבור לשעבר vivo פרמקולוגיה על ידי הקרנת 17 תרופות קליני וטרום קליני על פרוסות רקמה מוכן גידול PDX יחיד. שלנו מבחינה פיזיולוגית, רלבנטי, רגיש מאוד, ועמיד לשעבר vivo ההקרנה פלטפורמת הקרנה יהיה מאוד לחזק את גילוי תרופות מאונקולוגיה טרום קלינית הטיפול בקבלת החלטות.
Introduction
תאי המגע הסרטניים עם התכונות הפיזיות והביוכימי של רקמת הסטרומה המקיפים את המבנה מהווה את ה-TME. TME יכול לעורר צמיחה הגידול, גרורות, ולווסת את תגובת הגידול לטיפול1. ב התפתחות התרופה המקובלת טרום קלינית, מועמדים לסמים הם בדרך כלל הוקרן לראשונה באמצעות שורות מתרבות התאים הסרטניים, פלטפורמת שיטת הפעולה באופן ביקורתי חסר TME2. חוסר זה של TME פיסיולוגי בשלבים מבוססי-מראש תא עשוי להגביל את הגילוי של סוכנים יעילים במודלים בעלי חיים הנושאת גידול והוא עשוי לתרום שיעור התשה גבוהה של תרופות אונקולוגית מבטיח רבים בשלבים קליניים מאוחר יותר של פיתוח3.
למרות החשיבות של TME בתגובות התרופה הגידול מודייגצוב, אילוצים ניסיוניים להגביל את היישום של מערכות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית בשלבים המוקדמים של גילוי סמים ופיתוח. זה לא מעשי להקרין מאות סוכנים טיפוליים על גידולים מדגמי בעלי חיים או דגימות הסרטן החולה. ואכן, דגימות כירורגי הן משאבים נדירים עם רקע גנטי מגוון והקרנת אלפי מולקולות של מועמדים במודלים של בעלי חיים אינה אפשרית בשל היקף ניסיוני, עלות, ורווחה בעלי חיים.
רקמת הגידול התרבות פרוסה, שם לחתוך בדיוק, מקטעים הגידול דק הם מvivo לשעבר תרבותי, יכול להתמודד עם המגבלה של TME פיסיולוגיים בסינון תרופות assays. מבחינה היסטורית, התחום של מדעי המוח החלוץ ועשה מיטוב נרחב של תרבות הפרוסה עבור רקמת המוח4. לאחרונה, מחקרים רבים הפגינו הכנה של פרוסות מסוגים שונים של רקמת הגידול כולל שורה של תאים הנגזרים, מודלים הגידול ספונטנית, החולה נגזר xenografts (PDX), וגידולים החולה העיקרי. תרבות הפרוסה vivo Ex משלבת הטבות הן בvivo והן בתרבות החוץ-גופית5. פרוסות רקמת הגידול לשמור על ארכיטקטורת רקמה שלמה והרכב התא מזנים, המאפשר לימוד של תאים סרטניים בתוך ההקשר TME.
פרוטוקול זה מציג מערכת הגידול organotypic רקמות הגידולים בשילוב עם שיטת הכדאיות בזמן אמת, רגיש מאוד להערכת תגובות הסמים. בדיקות יעילות התרופה על פרוסות רקמת הגידול אורגאוטיפקס בפרוטוקולים שהוצגו בעבר להסתמך על מדידת שינויים הכדאיות התא על ידי התאגדות צבען פלורסנט, אימונוהיסטוכימיה (ihc), או mtt (3-[4, 5-diמתילטיק-2-yl]-2, 5 דיפנקסילטטרזויום ברומיד) שיטת6,7,8,9. עם זאת, כל השיטות הללו מסתיימות בנקודת הסיום וסובלות מרגישות נמוכה, זמן עיבוד ארוך, ניתוח נתונים מורכב, טווח אותות צר ושגיאה ניסויית גבוהה. שלנו מבוסס האור המבוססת על תאים לחיות בקנה מידה משפר את בחני אלה על ידי מתן טווח אותות רחב (~ 5 דקות) מדידה ללא עיבוד קודם ועיבוד מינימלי post. מגיב זה הוא רגיש מאוד ויכול להתקיים יחד במדיה של תרבות התא, המאפשר מדידה רציפה וזמן מסלול של הכדאיות התא. מערכת שיטה זו ישימה להקרנה בתפוקה גבוהה של מועמדים לסמים על פרוסות רקמה בהתפתחות תרופות טרום-קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי העכבר בוצעו על פי ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של חוק רווחה בעלי חיים והמוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במחקר ביו-רפואי.
1. הכנת פרוסות רקמת הגידול
- הכנת התרבות פרוסת הרקמה (TSC) בינוני אחרי המתכון בטבלה 1. לסנן את המדיום עם יחידת מסנן ואקום 0.45 יקרומטר לחטא.
- Aliquot 250 μL של מדיום TSC לבאר עבור הצלחת 24 שעות, או 1 mL של בינונית לכל טוב עבור צלחת 6 היטב. שמור את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2 מחולל חממה עד השימוש.
הערה: המדיום ותוספי התזונה יכולים להיות ממוטבים בהתאם לסוגי הרקמה והמטרות הנסיוניות. כמות המדיום צריכה להיות מספיקה רק כדי להשרות את הקרום הנקבובי של הוספת התרבות. אין לחרוג מרמת הקרום. כוונן את אמצעי האחסון הבינוני אם רמת המדיום נמוכה מדי או גבוהה מדי. אם חוקרים בודקים סוכנים אימונומודולטוריים, אנו ממליצים על תוספי המדיום עם IL-210. - אם שימוש ברקמת הגידול נגזר עכברים, המתת החסד עכברים עם הליך מומלץ, חיטוי העור חשופים של עכברים על ידי ריסוס 70% אתנול, ולנתח גידולים עם טכניקות אספטי. לאחסן את רקמת הגידול בצינור המכיל הקרח קר האנק מאוזן תמיסת מלח (HBSS).
- אם שימוש ברקמות הסרטן החולה טריים, החנות בקרח קר HBSS לטווח קצר, או קרח קר Belzer אוניברסיטת ויסקונסין (UW) פתרון לאחסון ארוך טווח (עד 24 שעות) כדי לשמר את הכדאיות רקמות.
הערה: פרוסות מרקמת PDX שנשלחו לידי לילה בפתרון UW קר בהצלחה מוכנים. - להעביר את רקמת הגידול לתוך לוחית 10 ס מ תרבות המכילים קרח קר HBSS. חותכים את הגידול לחצאים עם אזמל בזמן השקוע בקרח קר HBSS. ברקמות הגידול צורה לתוך צילינדרים באמצעות אגרוף ביופסיה 6 מ"מ קוטר לקצץ צד אחד כדי ליצור משטח שטוח. לאחסן את הרקמות בקרח קר HBSS עד השימוש.
הערה: הימנע כולל את האזור נקרוטיק של הרקמה, אשר בדרך כלל במרכז ויש לו מראה אטום ושברירי. - הגדר את הרטט. לחטא את כל הציוד באמצעות 70% אתנול. מניחים את מגש מאגר הרטט מכוסה במכסה זכוכית אקרילי במרכז אמבט הקרח הרטט. להוסיף קרח לאמבט קרח ולמלא את מגש המאגר עם HBSS מקורר כדי לשמור על הרקמה קריר תוך כדי חיתוך. . חברו סכין גילוח למחזיק הלהב
הערה: למרות ששמירה על הרטט בסביבה סטרילית למחצה לא השפיעה על ניסויים קודמים, מומלץ לאחסן את הרטט מתחת לארונית ביולוגית אם היא זמינה. - בזהירות להרים את רקמת הגידול מנוקב ביופסיה מן HBSS באמצעות מלקחיים שיניים ולהסיר מאגר עודף על ידי בינג את הרקמה עם מגבת נייר ללא מוך.
- מניחים טיפה של דבק כיתה רפואי בכיתה בלוח הדגימה ומניחים את הרקמה על המסירה הזו. לייבש את הדבק עבור 2 – 3 דקות ולמקם את הצלחת לתוך מגש המאגר. תוספת עם כמה HBSS עד הרקמה הוא שקוע לגמרי במאגר.
הערה: התקנה של רקמות בתנוחה זקופה ויציבה היא קריטית ליצירת פרוסות חיתוך אחיד. אם הרקמות רכוב הם לא יציבים, או להוסיף דבק יותר על הרקמה הסובבת כדי לשמור על מיקום זקוף או לפרוק את הרקמה, לשטח את החלק התחתון, ולהדביק אותו שוב. רקמות אלסטיים נוטות לקבל דחף וכפוף בקלות רבה יותר במהלך החיתוך, ובמקרה זה אורכים קצרים יותר (< 5 מ"מ) ומספר רב של מסלולים עשוי להיות מתאים. עבור רקמות שבירות מאוד, נייר מגבות יכול להרוס את הרקמה. במקרה זה, את הרקמה ניתן להניח על משטח פלסטיק לפתיל הרחק כמה HBSS עודפים. - כוונן את הגדרות הרטט. ההגדרות הבאות משמשות: חיתוך עובי = 250 μm, משרעת = 3.00 mm, חיתוך מהירות = 0.01 – 0.25 מ"מ/s, ו זווית להב = 15 ° – 21 °.
הערה: מטב את הגדרות הפרוסות בהתאם לקשיות של הרקמה. רקמות רכות יותר בקלות לחתוך עם זווית להב עמוק יותר במהירות נמוכה. זווית להב של 18 °, מהירות חיתוך בין 0.10 – 0.18 mm/s, ו משרעת של 3.00 mm עובד היטב עבור העכבר 4T1 ו PDX HCI010 גידולים. ניתן לחתוך את רקמת הסטיפר במהירות להב מהירה יותר. - הגדר את מיקומי ההתחלה והסיום של הלהב והתאם את גובה השלב. הפעל את הכלי במצב רציף כדי לחתוך פרוסות עבור מחזורי מספר עד שהרקמות נחתכו בצורה אחידה.
- . המשך לחתוך את הרקמה העבר את הפרוסות יחד עם כמות קטנה של מאגר HBSS לתוך הכנסת תרבות התא עם בינוני עם מיכל העברה של עצה רחבה, תוך שימוש ביניקה כדי להרים את הפרוסה כולה. מניחים פרוסה אחת לכל הוספה בצלחת של 24 שעות. הוספה של 6 צלחות היטב יכולה להכיל עד ארבע פרוסות לצורך שכפול.
הערה: אם הקצה האחרון של הפרוסה הרקמה עדיין מחוברת הרקמה נימולים, לעצור את הרטט ולהפריד את הפרוסה הרקמה עם שני זוגות של מלקחיים תשר דק מבלי לגעת או לדקור את פרוסות הרקמה. להב גילוח נפרד יכול להיות שימושי בהסרת רקמה תלויה. - הוצא כל מאגר עודף עם פיפטה דק להעברת עצות.
- כאשר הלהב מגיע קרוב לרקמות מודבקות, לעצור את המכשיר, להנמיך את הבמה, להסיר את הרקמה ההתקשות עם להב נפרד, ולטעון רקמה חדשה. המשך לחתוך עד לאיסוף מספיק פרוסות.
- תרבות הצלחות בחממה מחולל לחות שנקבעה ב-37 ° c, 5% CO2. פרוסות הרקמה הינן מתורדות באוויר-הפאזה הנוזלית בהכנסת תרבות התא. פרוסות הרקמה מוכנות לניסויים 24 – 48 שעות לאחר הכנת הפרוסה הראשונית. לטיפוח ארוך טווח, החלפת המדיום כל 2-3 ימים.
2. מדידת הכדאיות
- למדידת יכולת הכדאיות של הפרוסה הרקמה, להחליף את המדיום עם מדידת הכדאיות המבוססת על ההפריה מגיב המכיל הן לוציפראז ו prosubstrate ב 1:1000 דילול במדיום TSC בעקבות הוראות היצרן. הכימית מודדת את פעילות ההפחתה של תאים חיים של prosubstrate מטבוליזם כדי לוציפראב11. העבר 50 μL של תערובת האנזים-המצע על גבי כל פרוסת רקמה.
- הדגירה עם עצבנות עדינה על שייקר מסלולית הממוקם בתוך החממה לחות שנקבעו ב 37 ° צ' עם 5% CO2 לילה.
- אותות זורח ניתן למדוד באמצעות קורא מיקרופלייט או בכלי הדמיה vivo עבור רקמות התרבותי ב 24 צלחת הבאר. כדי למדוד את הכדאיות האישית של רקמות מרובות על צלחת 6 הבאר, מערכת הדמיה vivo יש להשתמש.
- בעת שימוש בקורא מיקרופלייט, הגדר את המיקרולוחית ללא המכסה. כל סוג של קורא אימונולוגיה מסוגל למדוד עוצמה זורח צריך להיות מתאים לניסוי. השתמשנו בהגדרות הבאות: לקרוא זמן = 1 s, מדידה מלמעלה, לצבור = 200.
הערה: לדיוק גבוה יותר, השתמש במיקרו-לוח לבן כדי להגדיר את הניסוי. הקיר הלבן, ברור למטה 24 צלחות היטב נבדקו, וברוב המקרים, ברור צלחות היטב לא להתפשר על התוצאות. - בעת שימוש במערכת דימות vivo כדי למדוד את הכדאיות, למקם את הצלחת במרכז הבמה ולהסיר את המכסה. לרכוש תמונות הצילום הרגיל ואחריו תמונות זורח עם שדה של הגדרת שלב ב C, זמן חשיפה אוטומטית, f-stop = 1, הגדרה אובייקטיבית כמו אימונולוגיה עם גובה הנושא = 0.0 ס מ.
- לכמת את עוצמת זורח באמצעות תוכנת דימות מלווה עם במערכת הדמיה vivo. צייר אזורים עקביים של ריבית (ROI) סביב כל פרוסת רקמה. פרוטוקול זה משתמש בעיגול בקוטר 1 ס מ כהחזר (ראה איור 1). למדוד את השטף הכולל (p/s) של האזור.
- בעת שימוש בקורא מיקרופלייט, הגדר את המיקרולוחית ללא המכסה. כל סוג של קורא אימונולוגיה מסוגל למדוד עוצמה זורח צריך להיות מתאים לניסוי. השתמשנו בהגדרות הבאות: לקרוא זמן = 1 s, מדידה מלמעלה, לצבור = 200.
3. הערכת אפקט התרופה על פרוסות הרקמה
- למדוד את הכדאיות הבסיסית לפני טיפול באמצעות מדידת הכדאיות המבוססת על האור מגיב כפי שהוסבר בסעיף 2.
הערה: אם יש מספר רקמות נמוכות באופן משמעותי בהשוואה לאחרים, השמט את הרקמות מהכדאיות. - התמוססות תרופות diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי ליצור פתרונות מלאי. להכין פתרון התרופה 10x עם TSC או בינונית תרבותית אחרת (25 μL/טוב עבור 24 צלחת לוחית המכילה 250 μL של בינוני) בריכוזים הרצוי. לבקרת רכב, הכן בינוני המכיל נפח שווה ערך של DMSO.
- משלימים את פתרון התרופה 10x למדיום התרבותי בתחתית הבאר. מערבבים על ידי ליטוף ולהעביר 50 μL של המדיום על גבי הרקמות.
הערה: אם מספר פרוסות רקמה זמינות, בדיקת כפילויות או טריליטים עבור כל תנאי. - דגירה לילה עם טלטול עדין על שייקר מסלולית ב 37 ° c, 5% CO2, מחולל לחות מאינקובטור.
- הסר את הצלחת מן השייקר ו הדגירה הסטטית ב 37 ° c, 5% CO2, מחולל לחות.
- בזמן הרצוי נקודות, למדוד את העוצמה זורח מן הרקמות באמצעות קורא מיקרופלייט או במערכת הדמיה vivo. בדרך כלל, השפעות התרופה הופכות לזיהוי לאחר 1 – 6 ימים של טיפול.
הערה: הכדאיות המבוססת על לומינסנציה יציבה לפחות 3 ימים בתנאים תרבותיים. עם זאת, המצע עשוי להיות מרוקן במהלך התהליך בהתאם לפעילות חילוף החומרים של הרקמה. אם ירידה באות משמעותית נצפתה ברקמות עם אותות גבוהים בעבר, להשלים את המצע בכל הבארות. - לחשב את הכדאיות הנותרת של רקמות הגידול שטופלו באמצעות המשוואה הבאה:
הכדאיות של הרקמה המטופלת מנורמלת על ידי הכדאיות הבסיסית שלה משמרת הכדאיות של רקמות הגידול בשליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מדגימים זמן מסלול, מספר הערכה של יעילות הסמים פרוטוקול עבור פרוסות רקמת הגידול המוכן מתוך העכבר 4T1 הגידול ברקמות סרטן השד מודל PDX, HCI01012. הכנו בהצלחה פרוסות רקמה מתוך מספר גידולים עכבר שנגזר, PDX, וטריים גידולים החולה10. זרימת העבודה הכוללת של הכנת רקמת הגידול ובדיקת יעילות התרופה מתוארת באיור 1. באופן כללי, אנחנו יכולים להכין 20-40 פרוסות רקמה מגידול בצובר אחד של 1000 – 1500 מ"מ3 בנפח.
בשביל מדידות הכדאיות, אנו מנצלים את היכולת העצמית המבוססת על התאים החיים התואמים. טיפול של מעכבי רב קינאז, סטרוספורטין, בריכוז 1 μM במשך 4 ימים הפחיתו את עוצמת האות על ידי 100x, לעומת רקמות הגידול שטופלו בקרת DMSO (איור 2A). פרוסות רקמה מוכן הגידול 4T1 נשמר לפחות 21 ימים עם החליפין בינונית מדי פעם (איור 2B). רוב מדידות תגובת התרופה נערכו בתוך 7 ימים מן ההכנה לפרוסות רקמה. מכיוון שהמגיב התואם לתאים החיים אינו דורש עיבוד או קיבעון לפני המדידה, הוא איפשר לנו לבצע מדידות של קורס זמן. שינויים תלויי זמן בכדאיות של פרוסות רקמת הגידול מן רקמת הגידול הזהה 4T1 מסוכמים באיור 2C. סטרוספורטין ב 500 ננומטר ירד מיום 1 והגיע לרמה הנמוכה ביותר ביום 4, שנותר נמוך עבור כל נקודת זמן לאחר מכן. לעומת זאת, עוצמת האור זורח מקבוצת הבקרה של רקמות שיושלם עם DMSO נשאר יציב עד יום 6. בנוסף, פרוסות רקמה המוכן גידולים 4T1 זהים טופלו עם מינונים סידוריים של סטרופספורטין (0 – 1 μM) עבור 4 ימים, והראה שינויים תלויי מינון בכדאיות ו-EC50 (איור 2d).
בדקנו תרופות כימותרפיות על פרוסות רקמה שהוכנו על ידי מודל מדגם PDX של סרטן השד, HCI010. פרוסות רקמה PDX טופלו עם דוקסורוביצין, תרופה כימותרפיה סטנדרטית, במינונים של 0 – 5 μM עבור 6 ימים, מתן שינויים תלויי מינון בכדאיות (איור 3A). יתר על כן, היעילות של 17 תרופות, כולל תרופות מאושרות טרום קלינית קלינית, נבדק בטריליטה על פרוסות רקמה מוכן גידול בתפזורת HCI010 בודד. התרופות הוחלו ב 0.5 μM במשך 4 ימים בטרילקאט (איור 3B). תוצאות אלה מספקות הוכחת הרעיון כי הקרנת התרופה בינונית התפוקה ניתן לבצע על פרוסות גידול עם TME יליד.
איור 1: סכמטית מראה הכנת פרוסות רקמה ולאחריה הערכת יעילות התרופה. רקמות הגידול עובדו לפרוסות 6 מ"מ בקוטר ו 250 יקרומטר עבה ותרבותי באוויר-הפאזה נוזלי עם תמיכה מוסיף תרבות תאים. לפני ואחרי הטיפול בסמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכדאיות ברקמת הרקמה מדידה ותגובה לסמים. (א) מייצגים תמונות של מדידות הכדאיות המבוססת על מידות בפרוסות רקמת השד. פרוסות רקמה מ 4T1 הגידול היו מודבטים עם 1 μM סטרובטין או DMSO שליטה יחד עם שיטת הכדאיות זורח מגיב במשך 4 ימים. תמונות הושגו באמצעות מערכת הדמיה vivo מנותח על ידי המלווה תוכנת ניתוח תמונה. עיגולים אדומים מציינים את הROI שנמדד עבור ביולומינסנציה. בתחתית = מזימה המציגה אות זורח מפרוסות רקמת הגידול שטופלו עם סטרופייטין או שליטה כפי שנמדד על ידי מערכת הדמיה vivo. הבר מציין את הממוצע של ארבע פרוסות הרקמה המוצגות כעיגולים (בקרה) או כיכר (שטופלו בסטרוספורטין). (ב) מזימה המציגה יכולת הכדאיות של פרוסות רקמת הגידול 4T1 המתורבתות במשך 21 ימים מהכנה. הכדאיות ביום 21 נמדדת על ידי מערכת הדמיה vivo היה מנורמל זה של היום 3. כל נקודה מציינת מדידה מפרוסה אחת; הבר מציין את הממוצע; התיבה מציגה רביאולים, והשפם מראה את המינימום לערך המקסימלי של המדידה. (ג) זמן-מדידות הקורס של היכולת לאחר הטיפול בסטרופטין. הכדאיות של פרוסות רקמה מן הגידול 4T1 שטופלו סטרופייטין (500 nM) או נפח שווה ערך של DMSO כפקד נמדדו לאורך זמן. כוונות לומינסנציה נמדדות על ידי קורא מיקרופלייט על נקודות הזמן שצוינו. כל נקודה ממחישה נקודת מאגר מפרוסת רקמה בודדת, וגרף העמודות מציין ממוצע של ± SEM. (ד) טיפול במינון התלוי ברקמת הרקמה. פרוסות רקמה שהוכנו על ידי גידול 4T1 הוכנו עם מינונים סדרתיים של סטרובטין או DMSO כפקד רכב. הכדאיות הנותרת על בסיס לומינסנציה נמדדה על ידי מערכת הדמיה vivo במשך 4 ימים לאחר תחילת הטיפול. הכדאיות היחסית חושבה באמצעות המשוואה המוצגת בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מסך התרופה בפרוסות רקמה שהוכנו ממודל של סרטן השד PDX. (א) מזימה המציגה שינויים בכדאיות בתגובה למינונים שונים של דוקסורוביצין. פרוסות הרקמה הוכנו מסרטן שד הנושא אורתואקס, HCI010. הכדאיות נמדדה בפרוסות שטופלו במינונים מדוקסורוביצין. לאחר 6 ימים, נמדד לומינציה באמצעות מערכת הדמיה vivo. בר = ממוצע ± SEM. (ב) מסך התרופה כימותרפיה בקנה מידה קטן על פרוסות רקמת הגידול מסרטן השד בנושא הגידול של pdx. גרף העמודות = ממוצע ± SEM של ניסוי בטרילקייט. נתונים אלה פורסמו בעבר10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חומר | מ ל | ריכוז סופי | לאי |
| המדיום של ויליאם | 500 | ||
| Nicotinamide | 6 | 12 ממ ' | 1 מלאי של ניטינאמיד ב ויליאמס ' בינונית E, מעוקר |
| חומצה אסקורבית | 6 | 50.4 μg/mL | 0.21 g/50 mL (> 10 מ"מ מניות) של חומצה אסקורבית במדיום של ויליאם E, מעוקר |
| נתרן ביקרבונט | 15 | 2.25 מ"ג/mL | 7.5% (w/v) פתרון |
| מאגר הפסי | 10 | 20 ממ ' | 1 מניות פתרון |
| גלוקוז | 10 | 5 מ"ג/mL | 250 מ"ג/ml מלאי, סטרליזציה |
| סודיום פיבט | מיכל 5 | 1 ממ ' | מלאי 100 מ"מ |
| ל-גלוטמין | מיכל 5 | 2 ממ ' | מלאי 200 מ"מ |
| שלה + בכורה | מיכל 5 | מכיל אינסולין רקומביננטי אנושי, העברת האדם (12.5 mg כל אחד), חומצה selenous (12.5 μg), BSA (2.5 g), ו חומצה לינולאית (10.7 mg) | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 2 | 40 IU/mL בעט, 40 μg/mL דלקת | 10,000 IU/mL בעט, 10,000 μg/mL דלקת |
| רקומביננטי EGF | 0.5 | 20 ng/mL | 20 מניות μg/mL |
טבלה 1: מתכון בינוני TSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים פלטפורמה עבור כמותית, ובזמן אמת מחקרים על יעילות הסמים על פרוסות רקמות הגידול אורגאוטימית. מערכת התרבות פרוסה הרקמה מספק יתרונות ברורים על פני התא המסורתי מבוסס בשיטות מבחנה על ידי לכידת תא טרוגניות ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של הסביבה מיקרו הגידול הטבעי. פלטפורמה זו מאפשרת גם תפוקה גבוהה יותר עבור בדיקות יעילות התרופה, המסייעים לגשר על הפער בין לימודי תרבות התא לבין ניסויים vivo.
כדי להשיג תוצאות מדויקות ועקביות, זה הכרחי למזער את הנזק לרקמות במהלך ההכנה. פרוסות רקמה צריך להיות מטופלים עם מיכל פלסטיק רחב טיפים כדי למנוע נזק שנגרם על ידי מגע פיזי. יש לשמור על נפח התרבות הבינוני כדי לאפשר לפרוסת הרקמה ליצור קשר עם האוויר והמדיום במשך הניסוי.
בינונית התרבות צריכה להיות ממוטבת בהתאם לסוג הרקמה ולמטרה הניסיונית. מדיום TSC בשימוש בפרוטוקול זה הוא מדיום ללא סרום שפותחה במקור עבור תרבות ההיציט הראשונית13. בינונית זו שימש גם כדי לשמור על מספר סוגים של גידולים, כולל השד, הכבד, המעי הגס, ואת הלבלב10. עוד, הדגמנו הישרדות התא החיסונית משופרת באמצעות מדיום מבוססי DMEM ממוטבת10. הגדרות הרטט מצריכות להיות ממוטבות על בסיס מרקם רקמות כדי להשיג פרוסות רקמה שלמות ואחידה של הגידול. פריסה של רקמות רכות ו/או מאוחדות באופן רופף מקלה בדרך כלל על-ידי שימוש בזוויות להב עמוקות יותר, במהירות חיתוך איטית יותר ובפרוסות עבות יותר. מדי פעם, הרקמות רכות מדי כדי לחתוך, שבו חוקרים במקרה צריך לשקול להטביע את הרקמה בתוך נקודת התכה נמוכה agarose, טכניקה המשותפת רקמת המוח חותך14,15.
בעבר, מספר מחקרים הציגו בדיקות תרופות טיפוליות גישות על פרוסות רקמה תרבותית. מחקרים אלה סמכו על התאגדות צבען פלורסנט, אימונוהיסטוכימיה, או mtt בחני אומר להעריך את הכדאיות רקמות6,7,8,9. בפרוטוקול זה, השתמשנו המבוססים על מבוססי האור, בשידור חי התואם לתאים בזמן אמת-גלו11 עבור מדידת הכדאיות. לומינסנציה-מבוסס בחני יש כמה יתרונות על פני שיטות שימוש קודם לכן, כולל רגישות מוגברת, טווח איתות רחב יותר, ואת היכולת לעשות במהירות מדידות הכדאיות בזמן אמת. זמן מדידה קצר עבור קוראי מיקרו לוחית הן (~ 1 s/גם) ו במערכת הדמיה vivo (~ 1 דקות/צלחת) והוא יכול לספק את עוצמת האות קריאות ישירות עם עיבוד מינימלי. רכישה מהירה יותר של האות ופחות שלבי העברת התהליכים הם התכונות הדרושות בסינון סמים בתפוקה גבוהה, המאפשר העברת מדידות הכדאיות המבוססת על לוציפראן כדי לאפשר תפוקה מדגם הרבה יותר גדולה בתרבות פרוסת הרקמה. בעוד שיטת לוציפראז מספקת מדידה מדויקת וכמותית של הכדאיות השלמה של הפרוסה, היא אינה מסוגלת לזהות שינויים ספציפיים לסוג התא המושרה על-ידי סמים ברקמה. עם זאת, צימוד מדידות היכולת המבוססת על מדידת הכדאיות עם נקודת הסיום IHC באותה פרוסת רקמות יאפשר מדידות ספציפיות לסוג תא.
בעוד מערכת התרבות פרוסה הרקמה הוא כלי רב עוצמה בהבאת מורכבות רקמות הגידול פלטפורמת ההקרנה גבוהה הסינון, יש לו כמה החסרונות. טרוגניות הטבועה בתוך רקמת הגידול עלול לגרום לתגובות התרופה הדיפרנציאלי בין פרוסות רקמות אפילו מגידול בצובר זהה. לעיתים, הבחנו בווריאציות גדולות יחסית בתגובת הסמים בין פרוסות הרקמה בניסויים שלנו. אנו מסוגלים חלקית להתגבר על וריאציה זו על ידי ממוצע פרוסות רקמה מרובות המוכן מאתרים שונים בתוך אותו גידול. למרות התרבות פרוסה הרקמה יכול להישמר ברמה הבסיסית של הכדאיות לפחות 21 ימים (איור 2B), אוכלוסיות תאים להשתנות לאורך זמן. התחלנו לתאר שינויים באוכלוסיית התאים החיסונית במהלך הניסויים בתרבות הפרוסה10. לכן, אנו ממליצים פרוסות רקמה להיבדק על קצר יותר מרווחי זמן מעבר למאפיינים רקמות יליד מחדש.
התרבות פרוסה הרקמה עומד למלא פער קריטי בגילוי סמים ופיתוח בין הקרנת תרבות תא התפוקה הגבוהה וניסויים בבעלי חיים. מאות תרופות ניתן להעריך על פרוסות המיוצרים ביופסיה בגידול יחיד, הוספת רלוונטיות פיזיולוגית מוגברת לפני מחקרי בעלי חיים. מערכת זו יכולה לסייע להפחית את מספר ניסויי בעלי החיים הנדרשים להביא סמים לשוק. יתר על כן, פרוסות רקמה המוכנים גידולים החולה יש פוטנציאל אינפורמטיבי המנחה תוכניות הטיפול במרפאה. למעלה ממאה תרופות טיפוליות זמינות כיום, אך יש מספר ביוארטים שידריכו את הבחירה שלהם. יתר על כן, טרוגניות בחולים גם תוצאות הפערים בתגובה. ניתן להשתמש בפרוסות רקמה מביופסיה בחולה כדי לבדוק מספר רב של תרופות לפני טיפול באופן מערכתית, ולספק מידע רב ערך על יעילות הסמים בתוך זמן של שבוע. באופן כללי, בזמן אמת ובדיקות מהירות של תרופות באמצעות מערכות תרבות פרוסת הרקמה יש פוטנציאל רב בפיתוח תרופות לסרטן והחלטות טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], והקרן סידני קימל [פרס המלומד קימל], פרס גילוי סרטן הריאות (LCD-505536). אנחנו רוצים להודות ד ר. אלנה Welm (אוניברסיטת יוטה) למתן סרטן השד PDX גידול. כמו כן, אנו רוצים להודות לצוות ברפואה השוואתית, פרד האצ לחקר הסרטן (מרכז המחקר) לתחזוקת מודל PDX וחברי מעבדת Gujral לדיונים מועילים. N. N. A נתמך על ידי מלגת מחקר בחו ל של JSPS ומענק הדרכה בין-תחומי מ-מע. A.J.B. נתמכת על ידי המענק של כרומוזום מטבוליזם וסרטן הדרכה מ-מע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
