Måle sanntids narkotikarespons i organotypic tumor vev skiver
Summary
Vi introduserer en protokoll for måling av sanntids narkotikarespons i organotypic tumorvevskiver. Den eksperimentelle strategien skissert her gir en plattform for å utføre middels høye gjennomstrømningsmedikamentskjermer på vevsskiver avledet fra kliniske eller mussvulster i ex vivo-forhold.
Abstract
Tumorvev består av kreftceller, infiltrerte immunceller, endotelceller, fibroblaster og ekstracellulær matrise. Dette komplekse miljøet utgjør tumormikromiljøet (TME) og kan modulere respons på terapi in vivo eller legemiddelrespons ex vivo. Konvensjonelle kreft narkotika oppdagelse skjermer utføres på celler dyrket i en monolayer, et system kritisk mangler påvirkning av TME. Dermed vil eksperimentelle systemer som integrerer sensitive og høygjennomstrømningsanalyser med fysiologisk TME styrke den prekliniske narkotikaoppdagelsesprosessen. Her introduserer vi ex vivo tumorvevskivekultur som en plattform for middels høy gjennomstrømning ser ut til å være en av de ulike i de ulike årene. Organotypic vev skive kultur utgjør nøyaktig kuttet, tynne tumor seksjoner som opprettholdes med støtte fra en porøs membran i en flytende luft grensesnitt. I denne protokollen beskriver vi forberedelse og vedlikehold av vevsskiver utarbeidet av musesvulster og svulster fra pasientavledede xenograft (PDX) modeller. For å vurdere endringer i vevslevedyktighet som svar på medikamentell behandling, utnyttet vi en biokompatibel luminescensbasert levedyktighetsanalyse som muliggjør sanntid, rask og sensitiv måling av levedyktige celler i vevet. Ved hjelp av denne plattformen evaluerte vi doseavhengige responser av vevsskiver til multikinasehemmeren, staurosporin og cytotoksisk middel, doksorubicin. Videre demonstrerer vi anvendelsen av vevsskiver for ex vivo farmakologi ved screening 17 kliniske og prekliniske legemidler på vevskiver utarbeidet fra en enkelt PDX-svulst. Vår fysiologisk relevante, svært følsomme og robuste ex vivo screening plattform vil i stor grad styrke preklinisk onkologi narkotika oppdagelse og behandling beslutningstaking.
Introduction
Kreftcelleinteraksjoner med de fysiske og biokjemiske egenskapene til det omkringliggende stromalvevet danner TME. TME kan stimulere tumorvekst, metastase og modulere tumorrespons på terapi1. I konvensjonell preklinisk legemiddelutvikling blir legemiddelkandidater vanligvis først screenet ved hjelp av kultiverte kreftcellelinjer, en analyseplattform som kritisk mangler TME2. Denne mangelen på fysiologisk TME i cellebaserte prescreeningstadier kan begrense oppdagelsen av effektive midler i tumorbærende dyremodeller og kan bidra til den høye attrisjonsraten til mange lovende onkologimedisiner i senere kliniske stadier av utvikling3.
Til tross for betydningen av TME i modulerende tumor narkotika responser, eksperimentelle begrensninger begrense anvendelsen av mer fysiologisk relevante systemer i de tidlige stadiene av narkotika oppdagelse og utvikling. Det er upraktisk å screene hundrevis av terapeutiske midler på svulster fra dyremodeller eller pasienttumorprøver. Faktisk er kirurgiske prøver knappe ressurser med variert genetisk bakgrunn og screening tusenvis av kandidatmolekyler i dyremodeller er ikke mulig på grunn av eksperimentell skala, kostnader og dyrevelferd.
Tumorvevskivekultur, hvor nøyaktig kuttet, tynne tumorseksjoner er kultivert ex vivo, kan ta opp begrensningen av fysiologisk TME i legemiddelscreeningsanalyser. Historisk, feltet av nevrovitenskap pioner og gjort omfattende optimaliseringer av skive kultur for hjernevev4. Nylig har mange studier vist preparat av skiver fra ulike typer tumorvev, inkludert cellelinjeavledede svulster, spontane tumormodeller, pasientavledede xenografts (PDX) og primære pasientsvulster. Ex vivo vev skive kultur integrerer fordeler fra både in vivo og in vitro kultur5. Tumorvevskiver beholder intakt vevsarkitektur og spraglete cellesammensetning, noe som muliggjør studiet av kreftceller i TME-konteksten.
Denne protokollen introduserer en organotypic tumor vev stykke kultursystem kombinert med en sanntid, svært følsom levedyktighet analyse for å evaluere narkotikaresponser. Effekttester på organotypic tumorvevskiver i tidligere introduserte protokoller er avhengige av måling av endringer i cellelevedyktighet ved fluorescerende dye inkorporering, immunohistochemistry (IHC) eller MTT ((3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazoliumbromid) analyse6,,7,,8,9. Alle disse metodene er imidlertid sluttpunktanalyser og lider av lav følsomhet, lang behandlingstid, komplekse dataanalyser, smalt signalområde og høy eksperimentell feil. Vår luminescence-baserte live celle-kompatible reagens forbedrer disse påstandene ved å gi et bredt signalområde og øyeblikkelig (~ 5 min) måling uten forutgående behandling og minimal etterbehandling. Denne reagensen er svært følsom og kan eksistere sammen i cellekulturmediet, noe som gir kontinuerlig og time-course måling av cellelevedyktighet. Dette analysesystemet gjelder for høy gjennomstrømning screening av narkotikakandidater på vevskiver i preklinisk legemiddelutvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen demonstrerer vi en plattform for kvantitative, og sanntids legemiddeleffektstudier på organotypic tumorvevskiver. Vevskivekultursystemet gir tydelige fordeler fremfor tradisjonelle cellebaserte in vitro-metoder ved å fange celleheterogenitet og fysiologiske egenskaper ved det innfødte tumormikromiljøet. Denne plattformen muliggjør også høyere gjennomstrømning for testing av legemiddeleffekter, noe som bidrar til å bygge bro mellom cellekulturstudier og in vivo-eksperimenter.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], og Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Vi vil gjerne takke Dr. Alana Welm (University of Utah) for å gi brystkreft PDX svulst. Vi vil også takke de ansatte ved Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) for vedlikehold av PDX-modellen og medlemmer av Gujral-laboratoriet for nyttige diskusjoner. N.N.A støttes av JSPS Overseas Research Fellowship og Tverrfaglig opplæringsstipend fra FHCRC. A.J.B. støttes av Chromosom Metabolism and Cancer Training Grant fra FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
