Summary
نحن وصف بروتوكول لنموذج ثقافة ثلاثية الأبعاد المشتركة من الشعب الهوائية المصابة، وذلك باستخدام CFBE41o- الخلايا، الضامة THP-1، وSوى pseudomonas aeruginosa،التي أنشئت في واجهة الهواء السائل. يوفر هذا النموذج منصة جديدة لاختبار فعالية المضادات الحيوية في وقت واحد، وظيفة الحاجز الظهاري، وعلامات الالتهاب.
Abstract
البحوث fDrug لعلاج التهابات الرئة تتقدم نحو النماذج التنبؤية في المختبر عالية التعقيد. يمكن أن يؤدي وجود البكتيريا متعددة الأوجه في نماذج الرئة إلى إعادة تكييف الترتيب الظهاري ، في حين تنسق الخلايا المناعية استجابة التهابية ضد البكتيريا في البيئة الدقيقة. بينما في نماذج الجسم الحي كانت الخيار لاختبار جديدة مضادة للعدوى في سياق التليف الكيسي، فإنها لا تزال لا تحاكي بدقة في الظروف في الجسم الحي من هذه الأمراض في البشر ونتائج العلاج. ويمكن لنماذج معقدة في المختبر من الشعب الهوائية المصابة على أساس الخلايا البشرية (الظهارية الشعب الهوائية و الضامة) ومسببات الأمراض ذات الصلة سد هذه الفجوة وتسهيل ترجمة جديدة لمكافحة العدوى في العيادة. لهذه الأغراض، تم إنشاء نموذج مشترك للثقافة من التليف الكيسي البشري القصبي خط الخلايا الظهارية CFBE41o- و THP-1 monocyte المستمدة من الضامة، تقليد عدوى الغشاء المخاطي القصبي البشري من قبل P. aeruginosa في الهواء السائل واجهة (ALI) الظروف. تم إعداد هذا النموذج في سبعة أيام ، ويتم تقييم المعلمات التالية في وقت واحد: سلامة الحاجز الظهاري ، والهجرة الضامة ، والبقاء على قيد الحياة البكتيرية ، والالتهاب. ويصف هذا البروتوكول نظاما قويا ويمكن استنساخه لتقييم فعالية الأدوية والاستجابات المضيفة التي يمكن أن تكون ذات صلة باكتشاف مضادات جديدة للعدوى وتعظيم إيصالها للهباء الجوي إلى الرئتين.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa هو الممرض ذات الصلة في التليف الكيسي (CF) الذي يساهم في ضعف أنسجة الرئة1. إنتاج السكريات، مثل ألجينات وغيرها من exucoid exopolysaccharides، ينسق تقدم المرض، مما يؤدي إلى الالتزام البكتيري عنيد، يحد من تقديم المضادات الحيوية إلى البكتيريا ويحمي البكتيريا ضد الجهاز المناعي المضيف2. إن انتقال P. aeruginosa من مرحلة planktonic إلى تشكيل البيوفيلم مسألة حاسمة في هذا السياق ، مما يسهل أيضًا حدوث التسامح مع المضادات الحيوية.
في سياق CF، تم استخدام الفأرة في المقام الأول كنموذج. الفئران، ومع ذلك، لا تتطور تلقائيا هذا المرض مع إدخال الطفرات CF3. وقد أجريت معظم البكتيريا بيو فيلم التنمية والدراسات القابلية للأدوية على الأسطح غير الحيوية، مثل أطباق بيتري. غير أن هذا النهج لا يمثل التعقيدات الحيوية. على سبيل المثال، هناك حواجز بيولوجية مهمة غائبة، بما في ذلك الخلايا المناعية وكذلك ظهارة المخاطية. على الرغم من P. aeruginosa هو سامة جدا للخلايا الظهارية, وقد تمكنت بعض المجموعات للمشاركة في زراعة في وقت سابق P. aeruginosa بيو فيلم مع الخلايا القصبية البشرية. نشأت هذه الخلايا من مرضى التليف الكيسي مع طفرة CFTR (CFBE41o- الخلايا)4 وسمح لتقييم فعالية المضادات الحيوية5 أو تقييم تصحيح بروتين CFTR أثناء العدوى6. وقد تبين أن هذا النموذج لتحسين القدرة على التنبؤ بكفاءة المخدرات ، بالإضافة إلى تمكين توصيف القضايا مع الأدوية التي فشلت في المراحل اللاحقة من تطور المخدرات7.
ومع ذلك ، في الرئة ، يتعرض ظهارة المخاطية للهواء. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المناعية الموجودة في الشعب الهوائية، مثل الضامة الأنسجة، تلعب دورا أساسيا ضد مسببات الأمراض المستنشقة أو الجسيمات8. تهاجر الضامة عبر طبقات الخلايا المختلفة للوصول إلى تجويف الشعب الهوائية ومحاربة العدوى. وعلاوة على ذلك، الأدوية المستنشقة أيضا للتعامل مع وجود المخاط كعنصر إضافي غير الخلوية من حاجز الدم الهوائية الرئوي9. في الواقع، تم تطوير العديد من النماذج المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر، بهدف زيادة أهمية في الجسم الحي. ولا تزيد نظم الاستزراع المشترك من تعقيد نظم المختبرات لاكتشاف المخدرات فحسب، بل تمكن أيضا من دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية. وقد تم تناول هذا التعقيد في دراسات حول هجرة الضامة10، والافراج عن الببتيدات المضادة للميكروبات من قبل العدلات11، ودور المخاط في العدوى9، ورد فعل الخلية الظهارية للضرر المفرط12. ومع ذلك، يمكن الاعتماد عليها CF المصابة في المختبر نموذج الذي يتميز الطفرة الجينية في CF، التي تتعرض للهواء (زيادة الحالة الفسيولوجية)، ويدمج الخلايا المناعية لا تزال تفتقر.
ولسد هذه الفجوة، فإننا نصف بروتوكولاً لثقافة الإنسان المشتركة المستقرة ثلاثية الأبعاد في الخطوط الجوية المصابة. النموذج هو الذي يتألف من الخلايا الظهارية 5 والخلايا الضامة، المصابة بP. aeruginosa وقادرة على تمثيل كل من حاجز الانتشار والمناعية. بهدف اختبار مضادات العدوى في إنتاجية عالية إلى حد معقول، تم تأسيس هذه الثقافة المشتركة على غشاء فلتر نفاذي من إدراج لوحة جيدا، وذلك باستخدام اثنين من خطوط الخلايا البشرية: CFBE41o- و THP-1 monocyte المشتقة من الضامة. وعلاوة على ذلك، لدراسة ترسب الهباء الجوي المضادللعدوى 13،تم إنشاء النموذج في واجهة الهواء السائل (ALI) بدلاً من الظروف المغطاة السائلة (LCC).
كما نحن التقرير هنا, هذا النموذج يسمح بتقييم البقاء على قيد الحياة ليس فقط البكتيرية على العلاج بالمضادات الحيوية ولكن أيضا السمية الخلوية الخلية, سلامة الحاجز الظهارية, الهجرة عبر الضامة, والاستجابات الالتهابية, التي هي معلمات أساسية لتطوير المخدرات.
يجمع هذا البروتوكول بين نوعين من الخلايا ذات الصلة لعلاج استنشاق الشعب الهوائية الرئوية: الضامة وظهارة الشعب الهوائية CF. وتُزرع هذه الخلايا على طرفي نقيض من إدراجات الدعم القابلة للنفاذ، مما يسمح بتعرض الخلايا للهواء (وتسمى ظروف الواجهة الهوائية السائلة (ALI). هذه الثقافة المشتركة للخلايا المضيفة المصابة في وقت لاحق مع P. aeruginosa. كلا خطوط الخلية المضيفة هي من أصل الإنسان: الخلايا الظهارية تمثل ظهارة الشعب الهوائية التليف الكيسي، مع طفرة على قناة CF (CFBE41o-) ، وخلايا THP-114 هي خط خلية تشبه الضامة. يسمح لأول مرة لطبقة ظهارية التقاء لتشكيل على الجانب العلوي من إدراج لوحة جيدا قبل أن تضاف الخلايا الضامة مثل إلى المقصورة المقابلة. بمجرد تأسيس الثقافة المشتركة في ALI ، يتم تلقيح النظام مع P. aeruginosa على الجانب apical. ثم يتم استخدام هذا النظام المصاب المشترك في الثقافة لتقييم فعالية المضادات الحيوية، مثل التوسرامايسين. يتم تحليل نقاط النهاية التالية: سلامة الحاجز الظهاري من حيث المقاومة الكهربائية عبر الطرفية (TEER) ، والتصور لتفاعلات الخلايا الخلوية والبكتيريا بواسطة المجهر المسح الضوئي بالليزر (CLSM) ، والبقاء على قيد الحياة البكتيرية من خلال عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) ، والبقاء على قيد الحياة الخلية المضيفة (السمية الخلوية) وإطلاق سراح السيتوكين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو وتمايز الخلايا في إدراج الدعم نفاذة
- زراعة CFBE41o- في قارورة T75 مع 13 مل من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ الأحماض الأمينية غير الضرورية و 600 ملغم / لتر الجلوكوز في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 الغلاف الجوي. أضف وسطًا جديدًا إلى الخلايا كل 2-3 أيام.
- فصل الخلايا بعد الوصول إلى التقاء 70٪ في القارورة مع 3 مل من التربسين- حمض الإيثيلين اديامينيتيتراتيكتيك (EDTA) في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إضافة 7 مل من MEM الطازجة والطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل عظمى وإضافة 10 مل جديدة من MEM في حين تعطيل الكتل عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
- عد الخلايا التي تحتوي على عداد خلية تلقائي أو غرفة قياس الهيموسيت. خلايا البذور مع كثافة 2 × 105 خلايا / جيدا في 12-جيدا لوحات مع دعامات نفاذية (حجم المسام من 3 ميكرومتر، انظر جدول المواد).
ملاحظة: يحدد عداد الخلايا التلقائي رقم الخلية وتوزيع الحجم وملاءمة الخلايا (راجع جدول المواد). ويمكن استخدام دعامات نفاذية بحجم مسام 0.4 ميكرومتر هنا؛ ومع ذلك، يجب إضافة الضامة في هذه الحالة مباشرة إلى الجانب apical، ولن يتم تقييم الهجرة عبر الخلية الخاصة بهم في هذه الحالة. - خلايا البذور في حالة السائل السائل (LLC) عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية على الجانب apical من الدعم نفاذية و 1.5 مل من المتوسطة الطازجة في الجانب الباسطية. ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2، لمدة 72 ساعة.
- للانتقال إلى ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI)، في اليوم الثالث بعد البذر، قم بإزالة الوسط من الجانب الباسطي أولاً، ثم من الجانب الزكي. إلى الجانب القاعدي، إضافة 500 ميكرولتر من ميو الطازجة وتغيير المتوسطة كل يوم الثاني حتى الخلايا تشكل أحادية التقاء.
ملاحظة: للشروط المستخدمة في هذا البروتوكول، تكون الخلايا CFBE41o- عادةً التقاء بعد 3-7 أيام في الثقافة. - تقييم خصائص الحاجز الظهاري في اليوم 7 عن طريق احتضان CFBE41o- الخلايا مع 500 μL خلية متوسطة في الجانب apical و 1.5 مل في الجانب الباسطني لمدة 1 ساعة، في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- قياس خصائص الحاجز عبر المقاومة الكهربائية عبر الذبذبات (TEER)، مع قطب عيدان STX2 ومقياس فولت الظهارية؛ بعد 7 أيام هذا هو أعلى من 300 Ω × سم2.
ملاحظة: في نهاية المطاف، في بعض إدراج الغشاء، والخلايا لديها TEER منخفضة. لذلك لا تستخدم إدراج نفاذية مع TEER < 300 Ω × سم ².
- لزراعة THP-1 الخلايا، تنمو لهم في قارورة T75 باستخدام 13 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FCS، واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2. انقسام الخلايا كل يوم الثاني عن طريق البذر 2 × 106 الخلايا / خلايا مل في قارورة T75 جديدة.
ملاحظة: تزرع خلايا THP-1 غير مميزة كوحدات أحادية في التعليق.- التفريق بين الخلايا THP-1 على النحو التالي. محتويات أجهزة الطرد المركزي من T75 في 300 × ز لمدة 4 دقائق. تجاهل supernatant، resuspend بيليه في المتوسطة الطازجة ووضع في T75 جديدة. إضافة 10 نانوغرام/مل Phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA) incubatig الخلايا في RPMI ل 48 ح في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 الغلاف الجوي15.
ملاحظة: بعد التمايز مع PMA، لا تتكاثر الخلايا بعد الآن وتُلحق القارورة. - لفصل الخلايا الشبيهة بالضمة THP-1، اغسل مرة واحدة بالمحلول الملحي العازل للفوسفات (PBS) عند 37 درجة مئوية واحتضانها مع 3 مل من محلول مفرزة الخلايا (مثل accutase) الذي يحتوي على 0.5 mM EDTA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- فحص الخلايا تحت مجهر مقلوب للبحث عن انفصال الخلية. أضف 7 مل من الوسيلة الجديدة والطرد المركزي عند 300 x ز لمدة 4 دقائق في RT.
ملاحظة: يمكن أيضا فصل الضامة مع التربسين-EDTA، 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك، التربسين هو أقسى إلى الضامة من الحل المفرزة الخلية المختارة (انظر جدول المواد). - بعد إزالة عظمى، إعادة تعليق خلايا الضامة في 3 مل من THP-1 المتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل، عد الخلايا كما هو موضح في 1.1.2. واحتضان لمدة أقصاها 1 ح في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 قبل إعداد ثقافة المشاركة.
ملاحظة: يمكن أن تلطخ الخلايا THP-1 في التعليق مع الأصباغ قابلة للحياة لصورة ثقافة المشاركة كذلك. في هذه الخطوة، استخدم الإجراء أدناه (الخطوة 1.2.5). - الضامة البقعة مع 10 μM من صبغة صلاحية الخلية (على أساس تحويل مزيتات خلات من قبل esterases داخل الخلايا، انظر جدول المواد)الذي يتم تطبيق 3 ميكرولتر من صبغة صلاحية الخلية إلى تعليق الخلية. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،ثم غسل 1x مع برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية لإزالة الصبغة.
ملاحظة: الطرد المركزي الخلايا لإزالة الصبغة في 300 س ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- التفريق بين الخلايا THP-1 على النحو التالي. محتويات أجهزة الطرد المركزي من T75 في 300 × ز لمدة 4 دقائق. تجاهل supernatant، resuspend بيليه في المتوسطة الطازجة ووضع في T75 جديدة. إضافة 10 نانوغرام/مل Phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA) incubatig الخلايا في RPMI ل 48 ح في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 الغلاف الجوي15.
2. إنشاء ثقافة الظهارية - الضامة المشتركة على دعامات نفاذية
- استخدام CFBE41o- monolayers في ALI مع TEER ≥ 300 Ω × سم² (الخطوة 1.1.6.). إزالة المتوسطة من الغرفة السفلية، وعكس بعناية الدعم داخل طبق بيتري الزجاج المعقم (50 مم × 200 ملم)، وإزالة الخلايا متضخمة من خلال مسام الغشاء على الجانب السفلي من الغشاء باستخدام مكشطة الخلية.
ملاحظة: بسبب حجم المسام من 3 ميكرومتر، تميل الخلايا الظهارية إلى النمو من خلال المسام نحو الجانب القاعدي. لذلك، يحتاج أحد إلى إزالتها قبل إضافة الضامة على هذا الجانب. CFBE41o- يمكن أن تلطخ خلايا الظهارية الرئة في هذه الخطوة. يمكن استخدام الإجراء في الخطوة 1.2.5; ومع ذلك، بدلا من تعليق الخلية، يتم تطبيق حل صبغ في MEM (500 μL الجانب apical فقط) على الخلايا الملتزم بها على الدعم نفاذية. - استخدام 2 × 105 خلايا / جيدا (في 200 μL من RPMI) من تعليق الخلية من الضامة THP-1 متمايزة PMA ووضع الخلايا على الجانب القاعدي من إدراج مقلوب.
- أغلق أطباق بيتري بعناية و احتضن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
- ضع الإدراج مرة أخرى في الألواح الدقيقة ذات الـ 12 بئرًا وأضف 500 ميكرولتر من وسيط MEM في الجانب القاعدي من الإدراج المُفَرّر للحفاظ على شروط ALI. الخلايا جاهزة الآن للعدوى.
3. العدوى عن طريق P. aeruginosa
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية من هنا في مختبر من مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2).
- تطعيم 15 مل من مرق الليسوجيني (LB) تكملها 300 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة Erlenmeyer (50 مل) مع مستعمرة واحدة من P. aeruginosa PAO1-GFP.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام سلالات أخرى من P. aeruginosa هنا، على سبيل المثال، نوع البرية PAO1، PA14، أو السلالات السريرية، بعد بروتوكولات الزراعة الخاصة بهم. - احتضان البكتيريا لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية، تهتز عند 180 دورة في الدقيقة.
- نقل محتويات بعد 18 ساعة إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي في 3850 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل عظمى وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة في 37 درجة مئوية.
- قياس الكثافة البصرية على مقياس الطيفي في الطول الموجي 600 نانومتر وضبط تركيز البكتيريا باستخدام متوسطة ثقافة الخلية إلى تركيز نهائي من 2 × 105 CFU / مل. وهذا يتوافق مع تعدد العدوى (MOI) من بكتيريا واحدة لكل خلية ظهارية.
- إضافة 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى الجانب apical من الدعم نفاذية (الخطوة 2.4.) واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 ل 1 ساعة، للسماح للبكتيريا التعلق بالخلايا. ثم، إزالة السائل apical بعناية مع ماصة لاستعادة شروط ALI. إبقاء بعض العينات غير المصابة كتحكم.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن تكون مطلية البكتيريا المرفقة في أجار LB (انظر الخطوات 5.4/5.5) لتحديد البكتيريا الأولية inoculum. - احتضان المخدرات ذات الاهتمام بعد الالتصاق البكتيري في الخلايا. لتجارب العلاج، إضافة 500 ميكرولتر من محلول المخدرات المخفف في خلية المتوسطة (في هذا البروتوكول tobramycin 6 تم استخدام ميكروغرام /مل) إلى الجانب apical. إضافة 1500 μL من خلية المتوسطة دون المخدرات على الجانب القاعدي.
ملاحظة: بدلاً من غرس الأدوية كحل، يمكن أيضًا تكييف النموذج مع ترسب الهباء الجوي. لهذه الأغراض، يتم تغذية الخلايا في ALI من الجانب القاعدي مع 500 ميكرولتر من خلية متوسطة. ثم يتم ابخ المخدرات أولا ويسمح للإيداع في المقصورة apical من قبل جهاز مناسب (غير موصوفة هنا). يمكن فحص العينة المصابة والمعالجة من أجل نقاط النهاية الموضحة في الأقسام 4-7. من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن استخدام دعامات نفاذية لخلق إما الصور (القسم 4) أو للحصول على نتائج نمو البكتيريا والخلايا الثدييات البقاء، من بين أمور أخرى (الأقسام 5-7).
4. إعداد العينة للمجهر الليزر المسح confocal (CLSM)
- بعد إنشاء الثقافة المشتركة، والعدوى والعلاج من المخدرات، وإزالة جميع المتوسطة من الجانب apical والبصلة. اغسل 1x مع PBS عند 37 درجة مئوية ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 3% شبه شكلي (PFA) مقابل 1 ساعة في RT (300 ميكرولتر على apical/600 μL على basolateral). تلطخ نواة الخلية بـ 5 ميكروغرام/مل من DAPI-PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: PFA خطرة. - قطع الأغشية باستخدام مشرط ووضعها بين اثنين من الشرائح 12 مم المجهر غطاء باستخدام المتوسطة تصاعد (انظر جدول المواد). اتركها تجف داخل مقعد التدفق لمدة 30 دقيقة قبل التخزين عند 4 درجات مئوية. تصور عن طريق المجهر المسح confocal.
ملاحظة: بعد المشتركة في الثقافة وقبل تصاعد، يمكن تنفيذ مناعة الوصلات الضيقة. لذلك، يتم إصلاح الخلايا مع paraformaldehyde 3٪ لمدة 30 دقيقة، وغسلها مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني، و permeabilized مع saponin 0.05٪/BSA 1٪ في برنامج تلفزيوني. في هذا البروتوكول، تم الكشف عن البروتين occludens zonula (زو-1) عن طريق الماوس المضادة للجسم المضاد 1 زو 1 (1:400، حضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها). ثم تم احتضان العينات لمدة 2 ساعة في RT مع الماعز المضادة للماوس IgG الأجسام المضادة اليكسا فلور 633 (1:2000 في الأحمر). كانت النوى ملطخة بـ DAPI (1 ميكروغرام/مل) ومثبتة مع متوسطة التركيب على الأغطية. - استخدم مجهرًا مشتركًا لتصوير الأغشية المخزنة. اختر 25x أو 63x أهداف الغمر بالماء وأشعة الليزر على 405، 488، 505 أو 633 نانومتر للكشف. يجب أن يكون للصور دقة 1024 × 1024 بكسل.
ملاحظة: يتم اختيار الليزر وفقا للصبغة المستخدمة. - احصل على طرق عرض مُنَفَذة ومتقاطعة، واستخدم وضع كومة زيتا (10-15 مكدسات) لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج التصوير.
5. قياس الانتشار البكتيري عبر وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)
- جمع المتوسطة apical والبصلة (التي تحتوي على البكتيريا) لتقييم CFU من البكتيريا غير المرفقة. جمع 500 μL من الجانبين apical والبصلية و تجمع لهم.
ملاحظة: استخدم هذا التعليق مباشرةً لحساب البكتيريا (الخطوة 5.4) أو الطرد المركزي عند 21,250 x غم لمدة 10 دقائق لتقييم اللاكتات dehydrogenase (LDH) من المُنْتَكَر (القسم 6) و/أو إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني لحساب البكتيريا خارج الخلية (الخطوة 5.4). - تقييم بقاء البكتيريا المرفقة و / أو الداخل في الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الماء البارد المعقم غير المؤين في كل حجرة من الدعم نفاذية. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن إما أن تكون مطلية العينات على أجار LB (انظر الخطوة 5.4) أو المجمدة (كلوحة إدراج كاملة) في -20 درجة مئوية للطلاء لاحقاً. - لتقييم CFU من البكتيريا المتمسكة / الداخلية، تذوب عينات في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (إذا المجمدة). باستخدام نصائح ماصة لكل بئر، كشط سطح الغشاء والماصة صعودا وهبوطا لإزالة جميع المحتوى الملتزم بها.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم lysed جميع الخلايا الظهارية والبكتيريا المتمسك / الداخلي متوفرة كمواد تعليق لتكون مطلية. - مع تعليق البكتيرية من كل الكسور، أداء تخفيف المسلسل 1/10 باستخدام Tween-80 0.05٪ في برنامج تلفزيوني وطبقة البكتيريا على لوحات LB أجار.
ملاحظة: يوصى بتخفيف الانبعاثات في ما بين 1 إلى 10. يجب أن تحسب البكتيريا في أعلى تخفيف ، حيث يتم تحديد مستعمرات واحدة لأول مرة. - احتضان لوحات أجار في 30 درجة مئوية لمدة 16-72 ساعة لحساب المستعمرات، وحساب CFU وفقا لذلك.
ملاحظة: درجة حرارة 30 درجة مئوية في وقت حضانة لوحة أمر ضروري للعينات المعالجة ولمراقبة تأخر النمو من المستعمرات.
6. تقييم السمية الخلوية عن طريق فحص اللاكتات ديهيدروجيناز
- استخدام ناظر الخلايا المصابة التي تحتوي على البكتيريا (من الخطوة 5.1) لتقييم صلاحية الخلية لLDH فحص16. أجهزة الطرد المركزي في 21250 س ز لمدة 10 دقائق ل بيليه البكتيريا وبقية في نهاية المطاف من الخلايا. استخدام البكتيريا خالية من البكتيريا فائقة لقياس الافراج عن LDH.
ملاحظة: لا ينبغي أن يتم تجميد ناظر قبل قياس LDH بواسطة هذا الفحص. - نقل 100 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة 96-well، وإضافة 100 ميكرولتر من محلول اختبار LDH (انظر جدول المواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام، ثم قراءة امتصاص في 492 نانومتر.
7. تقييم إطلاق السيتوكينات البشرية
- للحصول على كمية السيتوكين، استخدم إما ELISA أو مجموعة الخرزة السيتوماتية المناعية17(انظر جدول المواد). لهذا، أجهزة الطرد المركزي الفائقة من الخطوة 5.1 في 21250 × ز لمدة 10 دقيقة وقياس إما على الفور أو مخزن -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما حتى التحليل.
- تقييم المُنَاتس مع مجموعة ELISA المتاحة تجاريًا.
ملاحظة: يتبع الإجراء تعليمات التصنيع، والتي تشمل طلاء الألواح مع الأجسام المضادة لالتقاط، إضافة عينات (100 ميكرولتر) ومعايير السيتوكين، الحضانة، والغسيل، وإضافة الأجسام المضادة للكشف عن توفير قياس colorimetric وجود السيتوكين. بدلا من ذلك، يمكن استخدام عملية استئصال التدفق لقياس السيتوكينات عن طريق مجموعات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1A يظهر مورفولوجيا الناتجة المشتركة في الثقافة من الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية و الضامة بعد تزايد كل من ل 24 ح على الجانب apical والبصلة من يدعم نفاذية، على التوالي. يظهر سلامة الحاجز الظهاري بواسطة TEER العالي (834 Ω × سم2)و CLSM عن طريق المناعة للبروتين وصلة ضيقة ZO-1 (الشكل 1B). نفس النتائج التي لوحظت من حيث سلامة حاجز CFBE41o غير المصابة- يمكن رؤية ثقافة أحادية في الثقافات المشتركة الظهارية-الضامة غير المصابة.
لنموذج عدوى بكتيرية، تم تلقيح P. aeruginosa في تعدد العدوى (MOI) من 1:1 على CFBE41o- الخلايا. بعد ست ساعات من العدوى (الشكل 2A) ، لوحظ الضامة على الجانب apical من الثقافة المشتركة. بعد الإصابة، وانخفض TEER من 834 إلى 250 Ω × سم2، مما يدل على حاجز الظهارية للخطر، كما تصور أيضا من قبل ZO-1 تلطيخ (الشكل 2B).
ويبين الشكل 3 هجرة الضامة عبر المسام الغشاء نفاذية وامتصاص البكتيريا من قبل THP-1 الخلايا على الجانب apical. تم تثبيت العينات في 1 و 3 و 6 ح بعد الحضانة من التجارب المستقلة. في الزّرق أحادية التّنـدّيّة THP-1(الشكل 3A-C)،لوحظت هجرة الضامة في وقت مبكر من ساعة واحدة، بينما في الثقافة المشتركة(الشكل 3D-F)،شوهد هذا بعد 3 عدوى ح. لوحظ امتصاص البكتيريا في THP-1 بعد 3 ساعة من العدوى، في كل من الزراعة الأحادية والثقافة المشتركة. لا يمكن رؤية أي امتصاص بكتيري من قبل CFBE41o. تم وضع وجهات النظر المقطعية العرضية بحيث كان دعم الغشاء المُقَطَر في الوسط كفصل بين المقصورة الفاتولية والباسدية.
ويبين الشكل 4 التصوير المجهري بالليزر الملتقطة بالمسح الضوئي لثقافات مصابة بالعدوى (CFBE41o- + THP-1) المعالجة بـ tobramycin أو بدونها لمدة 6 ح(الشكل 4A, B)أو 20 h (الشكل 4C, D). دون علاج، توفي كل من الخلايا الظهارية و الضامة بعد 20 ح من العدوى (الشكل 4C). ومع ذلك، على علاج tobramycin، يتم الحفاظ على الخلايا المضيفة بعد 20 ح; بعد, بعض جراثيم يستطيع كنت لاحظت في الثقافة. على الرغم من أن ينظر بعد 6 ح من العلاج في الصور المجهرية (الشكل 4B) ، لم تتكاثر البكتيريا كما لوحظ في CFU في المقايسات في الشكل 4E. ومع ذلك، بعد العلاج 20 ح، البكتيريا استعادت القدرة على الانتشار، كما رأينا من قبل المستعمرات في مقايسة CFU(الشكل 4F). بروتوكول تحلل الخلية مع الماء البارد وكشط يمكن إطلاق البكتيريا المرفقة وربما استيعابها في الخلايا. في الوقت نفسه، يتم تدمير الخلايا (الرقم التكميلي S1A، B). لم تعيق خطوات الطرد المركزي المستخدمة في هذه الورقة للخلايا الظهارية (300 x ز) أو البكتيريا (21,250 x ز) جدوى كليهما (الأرقام التكميلية S1C, D). تم إجراء جميع مقايسات CFU عن طريق تجميد العينات في -20 درجة مئوية ، تليها ذوبان الذوبان والطلاء. هذا الإجراء خفض عدد البكتيريا من قبل 2-سجلات، مقارنة مع عينات جديدة(الرقم التكميلي S1E). كما يتم هذا الإجراء في وقت واحد لجميع المجموعات التجريبية (المعالجة وغير المعالجة) في نقاط زمنية مختلفة، سيتم إدراج هذا التخفيض في النتائج النهائية(الشكل التكميلي S1E). وعلاوة على ذلك، لم يظهر تركيز tobramycin المستخدمة هنا أي سمية للخلايا غير المصابة (الرقم التكميلي S2A) وأيضا لا استجابة أخرى للالتهابات(الرقم التكميلي S2B). ومع ذلك، كان ضمن نطاق الحد الأدنى من التركيز المثبط لقتل P. aeruginosa.
ويبين الشكل 5 المقاومة الكهربائية عبر المحيطية (TEER) وقابلية الخلية للحياة. يوضح الشكل 5ألف - باء الـ TEER للثقافات الأحادية والثقافات المشتركة. لم تُحدث الثقافة المشتركة لـ CFBE41o- الخلايا مع THP-1 أي تغيير في سلامة الحاجز الظهاري مقارنة بزراعة أحادية (الحانات الحمراء). عند الإصابة، انخفضت قيمة TEER (شريط أخضر). بعد 1 ساعة من العدوى، تم علاج بعض العينات مع المضادات الحيوية tobramycin (شريط أزرق)، لمدة 6 أو 20 ساعة. حافظ العلاج على سلامة الحاجز الظهاري، كما لاحظه TEER العالي. ويبين الشكل 5C النسبة المئوية لإطلاق الـ LDH كمؤشر على سمية الخلية عند العدوى وعلاج الـ tobramycin بعد 6 ساعات. ال [شارك-ا لثّنكتددّتدّرّتد هـارجتّر هـا) إطلاق عدوى الـLDH، وهو ما كان هو نفسه بالنسبة للخلايا المصابة (حوالي 20%). بعد 20 ساعة من العدوى، لا يمكن الكشف عن أي إشارة من LDH. لإثبات موثوقية LDH للعدوى على المدى الطويل ، تم احتضان PAO1-GFP في المتوسط مع وبدون LDH 1 U/mL مقارنة بالضوابط غير المصابة (الشكل التكميلي S2C). فقدت إشارة LDH بعد حضانة طويلة (20 ح) مع P. aeruginosa, مما يشير إلى أن LDH مستقرة فقط في أوقات الحضانة أقصر في الثقافات المصابة.
يوضح الشكل 6 حركيات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تم اكتشافها عبر ELISA. لوحظت ميزة الثقافة المشتركة المصابة بالخلايا CFBE41o- و THP-1 مع الإفرازات الأعلى من السيتوكينات الموالية للالتهابات. كان إفراز بعض السيتوكينات المؤيدة للالتهابات إما مشابهًا (IL-6) أو أعلى (IL-8، TNF-α، IL-1β) في الثقافة المشتركة المصابة(الشكل 6C)مما كانت عليه في الثقافات الأحادية المقابلة(الأرقام 6A-B). بشكل غير متوقع، يتم تنظيم بعض السيتوكينات في الاستزراع أحادي THP-1(الشكل 6B)في عينات مصابة (Il-8، TNFα، IL-1β).
يوضح الشكل 7 إطلاق السيتوكينات في الثقافات الأحادية والمشاركة عند العدوى والعلاج بالتوبراميسين مقاساً عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). كان إفراز السيتوكين مضادة للالتهابات IL-8(الشكل 7A)والمضادة للالتهابات السيتوكين IL-10(الشكل 7F)أعلى في الثقافات المشتركة للخلايا الظهارية والضامة، بالمقارنة مع الثقافات الأحادية. ومع ذلك، بالنسبة لجميع السيتوكينات الأخرى (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 وGM-CSF)(أرقام 7B-E),لم تكن مستويات إفراز السيتوكين أعلى في الثقافة المشتركة التي في الثقافات الأحادية ذات الصلة.
الشكل 1: المقاطع العرضية والآراء المزيّدة للثقافة المشتركة للظهارية-الضامة غير المصابة. (أ) وجهات نظر الصليب من غير المصابة 24 ح الظهارية- الضامة المشتركة الثقافة. CFBE41o- أحمر ملون، الضامة THP-1 باللون الأصفر والنوى باللون الأزرق (DAPI). (ب) آراء Apical من CFBE41o غير المصابة - أحادية الطبقات الملطخة بالمناعة لZO -1 (أحمر). DAPI: النوى. أشرطة مقياس: 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المقاطع العرضية والآراء المزيّدة للثقافة المشتركة للظهارية الضامة المصابة. (أ)وجهات نظر الصليب و (ب) عرض apical من الظهارة الضامة المشتركة الثقافة في 6 ح بعد العدوى (hpi) مع P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- ملطخة باللون الأحمر، الضامة THP-1 باللون الأصفر، والنيوية باللون الأزرق (DAPI) وP. aeruginosa PAO1-GFP باللون الأخضر. (B) آراء Apical من 6 ح المصابة CFBE41o- monolayer. أشرطة مقياس: 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حركية هجرة الضامة و امتصاص البكتيريا التي تصورها المقطع العرضي للنموذج ثلاثي الأبعاد. حركية العدوى PAO1-GFP في الاستزراع الأحادي للزكامات THP-1(A-C)أو ثقافة(D-F). تلطخ الضامة THP-1 باللون الأحمر، نواة الخلايا الظهارية باللون الأزرق (DAPI)، وP. aeruginosa باللون الأخضر (GFP). وينقسم كل شكل إلى جوانب apical والبصين، والمسافة بين يعتبر أن يكون الغشاء، وهو فارغ أو المحتلة من قبل CFBE41o- طبقة نقوش (D-F). تظهر الدرجات في الأرقام امتصاص البكتيريا بواسطة الضامة في أوقات مختلفة (A-F). أشرطة مقياس: 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف بقاء PAO1-GFP في الثنياس المعالجة co-culture. (A-D) ميكروجرافات Confocal المشتركة مع وبدون العلاج. (أ) غير المعالجة المشتركة للثقافة بعد 6 ح من العدوى. (B) المصابة شارك في الثقافة المعالجة مع tobramycin 6 ميكروغرام / مل (Tob) لمدة 6 ح (C) غير المعالجة المشتركة الثقافة 20 ح بعد العدوى ، (D) المصابة شارك في الثقافة المعالجة مع tobramycin 6 ميكروغرام / مل ل 20 ساعة. Nuclei ملطخة DAPI (الأزرق) ، الضامة (الأحمر) وP. aeruginosa GFP (الأخضر). (E) وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) من البكتيريا المتمسكة / الداخل بعد 6 و (F) 20 h مع tobramycin 6 ميكروغرام / مل العلاج. تم استخدام إدراج الغشاء الفارغ كركيزة غير أحيائية لزراعة PAO1-GFP. ANOVA في اتجاهين مع اختبار مقارنات توكي المتعددة (# لا توجد مستعمرات) تم استخدامه ، *p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001; ns: ليست كبيرة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 9-27 نسخ متماثلة من 3-9 تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النزاهة القائمة على الحواجز وتقييم جدوى الثقافة الأحادية والثقافة المشتركة. تم تقييم ظروف الاستزراع المشترك التالية: غير المصابة (الحانات الرمادية)، أو المصابة (الحانات الخضراء)، أو المصابة وعلاجها بالـ tobramycin (الحانات الزرقاء). (أ)المقاومة الكهربائية عبر الثانية بعد 6 ح و (ب) 20 ح من العدوى في الثقافات الأحادية (CFBE41o- و THP-1) و شارك في الثقافة. (C) السمية الخلوية من أحادية وشارك في الثقافة تقاس عن طريق الافراج عن LDH 6 ح بعد العدوى. تم استخدام ANOVA في اتجاهين مع اختبار المقارنات المتعددة من توكي؛ * ف < 0.05; p < 0.0001; ns: ليست كبيرة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري؛ والإشارة إلى الخطأ في شرائط الخطأ. ن = 9 نسخ متماثلة من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: حركية إطلاق السيتوكين من المُستفِدِين أحادييّة وحضارة المشاركة غير المُصابين الذين تمّ تقييمهم عبر ELISA. تم القيام به ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لعدة. (أ)CFBE41o-, (B) THP-1, و (C) شارك في الثقافة إطلاق IL-8, TNF-α, IL-1β, و IL-6. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. ن = 6 تكرارات لتجارب مستقلة 2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: النتائج الفائقة للوحة السيتوكين التي تم قياسها عن طريق FACS مع وبدون tobramycin 6 ميكروغرام/مل ل 6 ح بعد العدوى. Supernatants من أحادية و شارك في الثقافة بعد 6 ح بعد العدوى المستخدمة لتحليل السيتوكينات IL-8 (A)، IL - 1α (B) ، IL12p40 (C) ، IL -23 (D) ، GM-CSF (E)و IL-10 (F). يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 9 نسخ متماثلة من 3 تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: تجارب مراقبة للخطوات الهامة للبروتوكول. (أ، ب) micrographs من خلايا CFBE41o في 24-جيدا لوحات نمت لمدة 2 أيام في كثافة 2 × 105 خلايا / جيدا. (أ)خلايا CFBE41o في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة، و (ب) الخلايا المعالجة بالماء بعد 30 دقيقة بعد كشط مع ماصة. (C) صلاحية خلايا الثدييات بعد الطرد المركزي. تمت إزالة خلايا CFBE41o-من قارورة ثقافة الخلية T75 كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 و 1.1.2. تم تحليل 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا الناتجة في محلول متساوي التوتر 10 مل. واستُخدم عداد آلي للخلية لتقييم جدوى الخلايا المفردة. ثم تم طرد تعليق الخلية على حدة في 300 x ز لمدة 4 دقائق، وإعادة تعليقها والعد مرة أخرى. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 6 قارورة مختلفة من تجربتين فرديتين. (د)صلاحية PAO1-GFP بعد الطرد المركزي. تم تخفيف بكتيريا PAO1-GFP إلى OD = 0.01 في وسط الخلية. تم تقييم CFU عن طريق صف التخفيف 10 أضعاف وألواح LB المحتضنة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. وتم طرد الأنابيب البلاستيكية ذات الصلة بسرعة 250 21 x غرام لمدة 10 دقائق وأعيد تعليقها في الوسط. وبناء على ذلك، تم تقييم الاتحاد مرة أخرى. اختبار t للطالب ذو الذيلين، * p < 0.033. يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 6 من 2 تجارب. (E) صلاحية البكتيريا بعد التجميد. تم إعداد بكتيريا PAO1-GFP كما هو الحال في (D) وتم تحليل CFU ، ثم تم تجميد الأنابيب البلاستيكية ليوم واحد عند -20 درجة مئوية وذاب لتقييم CFU مرة أخرى. اختبار t للطالب ذو الذيلين، *** p < 0.001. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 6 من تجربتين. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: تجارب السيطرة على تقييم سلوك LDH وتأثير التبراميسين. (أ)تجربة مراقبة لتقييم السمية الخلوية بعد 20 ساعة من الحضانة مع 6 ميكروغرام/مل توبراميسين. وقد تم مونو و شارك في الثقافة كما هو موضح في البروتوكول، ولكن نمت الخلايا لمدة 2 أيام على لوحات 24-جيدا وخلايا THP-1 كانت بذرة. تم احتضان الخلايا التي تحتوي على 6 ميكروغرام/مل من تبراميسين أو عناصر تحكم لمدة 20 ساعة. ANOVA في اتجاه واحد ، اختبار مقارنات Multi- Tukey، *** p < 0.001. يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 6 من 2 تجارب (CFBE41o-)، n = 3 من تجربة واحدة (THP-1 و co-culture). (ب) التحكم-ELISA من المُنَتَكّبات الأحادية و الزاهرة مع/بدون تبراميسين. تم إجراء استزراع الخلايا وفقًا لـ (A) لإظهار عدم إصدار السيتوكين مقارنة بالضوابط لجميع الظروف. تم إجراء ELISA في الخطوة 7.1 و 7.2، تمت إضافة 10 ميكروغرام/مل (LPS) كتحكم، وكان إصدار IL-8 للضوابط المعالجة LPS التي تحتوي على THP-1 أعلى من يمكن اكتشافه. ANOVA في الاتجاهين ، اختبار مقارنات Multi- Tukey، ns p > 0.12؛ * ف < 0.033; p < 0.001. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 6 من تجربتين، n = 3 من تجربة واحدة (التحكم في LPS). (ج)تدهور LDH بسبب الإفراط في انتشار PAO1-GFP. وقد أضيف LDH بتركيز 1 U/mL إلى MEM Medium. أما متوسطة LDH أو وسيط التحكم استخدمت لتخفيف الخلايا إلى OD = 0.01 (يقابل 1 × 108 CFU / مل) ثم احتضان لمدة 20 ح. تم إجراء فحص LDH كما هو موضح في القسم 6. ANOVA في اتجاه واحد ، اختبار مقارنات Multi من Tukey ، ns p > 0.12 ؛ p < 0.001. يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري، n = 8-9 من ثلاث تجارب فردية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الورقة يصف بروتوكول لثقافة 3D المشتركة من الشعب الهوائية المصابة، التي شكلتها الإنسان التليف الكيسي القصبي خط الخلايا الظهارية CFBE41o- والإنسان أحادية الخلية المشتقة خط الخلية THP-1. البروتوكول يسمح بتقييم سلامة الحاجز الظهاري, هجرة الضامة, بقاء البكتيريا, والتهاب, التي هي معايير هامة عند اختبار فعالية المخدرات والاستجابات المضيف في وقت واحد. الجدة في النموذج يكمن في دمج الخلايا الظهارية (أي خط الخلية CF الإنسان و الضامة) مع العدوى البكتيرية الحادة (أي P. aeruginosa). وقد ثبت أن العدوى الحادة في الخلايا الظهارية يمكن السيطرة عليها بواسطة مضاد حيوي (أي tobramycin). إلى جانب استخدام خط الخلية CF الإنسان، تم تعيين النموذج بأكمله حتى في شروط ALI، وهو أقرب بكثير إلى الظروف الفسيولوجية في CF. استخدام خط الخلية CF ينفذ بعض خصائص المرض في النموذج. إن طفرة منظم إجراء التليف الكيسي عبر التليف (CFTR) يرتبط مباشرة بخلل تنظيم نقل السائل الظهاري في الرئتين. وعلاوة على ذلك، الطفرات في الجينات CF، مثل ΔF508، يؤدي إلى مخاط سميك، مع التهاب وتلف شديد في الرئة عند العدوى مع P. aeruginosa4. هذه المظاهر المرضية الناجمة عن خلل CFTR يحتمل أن تنطوي على ضعف autophagy كآلية خلوية هامة المرتبطة بالأمراض من مرض الرئة CF18. ومع ذلك، CFBE41o- تفشل في المخاط السري، وهو حد من هذا الخط الخلية. إذا كان المقصود هو دراسة دور المخاط بشكل أكثر تحديدا، يمكن تكييف البروتوكول باستخدام خطوط الخلايا القصبية الأخرى (على سبيل المثال، Calu-3).
إحدى الخطوات الحاسمة لإعداد هذا البروتوكول هي الجمع بين الخلايا الظهارية والمناعة والعدوى اللاحقة مع P. aeruginosa في ALI. وقد وصفت بالفعل عدوى CFBE41o- عن طريق P. aeruginosa في المختبر، وذلك أساسا باستخدام غرفة تدفق الخلية، تستكمل مع أرجينين في وسائل الإعلام الثقافة، لتحسين بقاء الخلايا الظهارية ودعم تشكيل بيو فيلم19. ويهدف هذا البروتوكول إلى نموذج جديد باستخدام الخلايا البشرية فقط، والتي علاوة على ذلك، يمكن زراعتها في ALI على ألواح آبار قابلة للنفاذ لإدخال إنتاجية عينة أعلى. إن إدراج الضامة المتمايزة THP-1 كخط خلية خالدة بشريًا ، بدلاً من الاعتماد على الحصول على خلايا أولية قابلة للاستنساخ من المتبرعين ، هو ميزة أخرى لنموذجنا. من خلال إضافة هذه الضامة إلى الجانب القاعدي لدعم الغشاء نفاذية، لوحظ أن الضامة جاحظ وفي نهاية المطاف تتلف إلى الجانب apical من الحاجز الظهارية مرشح نمت. ويمكن أن يكون الاختلاف من هذا البروتوكول إضافة الضامة مباشرة على الجانب apical على رأس الخلايا الظهارية، كما وصفها Kletting وآخرون. 14- وقد سبق وصف الثقافة المشتركة للخلايا المناعية وغير البشرية والرئتين من قبل. دينغ وآخرون 10 تستخدم الماوس لويس سرطان الرئة الخلايا على إدخال قابل للنفاذ يدعم في تركيبة مع الضامة على الجانب القاعدي والمصابين مع S. aureus, آخر مسببات الأمراض الحرجة للعدوى المزمنة في مرضى CF. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، لم يكن هناك تركيز على التليف الكيسي أو استخدام الثقافة المشتركة كمنصة لتقييم فعالية الدواء. يمكن تكييف بروتوكول لدينا للعدوى البكتيرية الأخرى، مثل المكورات العنقودية الذهبية، الخراج الفطري ، أو بوركاوليا سيباسيا- مسببات الأمراض الهامة في الرئة CF.
خطوة أخرى هامة هي إضافة الضامة THP-1 إلى الخلايا عن طريق التقليب إدراج نفاذي رأسا على عقب (القسم 2). وهذا أمر بالغ الأهمية لتقييم الهجرة العابرة للغامة من خلال البئر إلى جانب العدوى. ويمكن إجراء عملية التصوير في وقت لاحق من النماذج 3D مع مداخن ض، وعرض المقطع، لمراقبة داخل الضامة والكشف عن امتصاص البكتيريا (الشكل 3). في 1 حصاني، البكتيريا المطبقة على الجانب apical يهاجر من خلال الغشاء، في حين أن الهجرة الضامة وامتصاص فقط في 3 إتش بي. لذلك بعد 1 ح من العدوى، كان من المناسب بدء العلاج مع tobramycin ولها إمكانية معالجة كل من البقاء على قيد الحياة الخلية المضيفة والبكتيريا لفترة طويلة (20 ساعة). وفي سياق البروتوكول، يعد الحفاظ على العقم مسألة حرجة بسبب كثرة الخطوات التي تحمل كل منها خطر التلوث. ومع ذلك، سيتمكن العاملون ذوي الخبرة في مجال ثقافة الخلايا من اتباع هذا البروتوكول بعد الإعداد والتدريب المناسبين. وينبغي فحص متوسط الخلية بانتظام للتلوث، ويفضل بعد كل الخطوات الحرجة.
وكما هو الحال مع أي نموذج، فإن الثقافة المشتركة المصابة لها أيضا بعض القيود؛ على سبيل المثال، تكامل الخلايا الشبيهة بالكاملاف. هنا ، كان من المهم أن يكون الضامة على الجانب القاعدي ؛ ومع ذلك، قد يكون التلاعب في إدراج مع طبقة ظهارية نمت سابقا قد وفرت الضرر المبكر والاضطرابات إلى ثقافة المشتركة. على الرغم من أن نموذج الدعم نفاذية قدمت خصائص عالية الإنتاجية، والتي لم يلاحظ في الثقافات المشتركة السابقة من الرئة المصابة CF20،21. مع ذلك، تحتاج تجارب أخرى لتقييم القيود المفروضة على استخدام THP-1 كبديل الضامة. في حين أن هذا الخط الخلية يستخدم على نطاق واسع، فهو أقل استجابة لـ LPS22 ويفتقر إلى التنشيط الكامل والسكان بأكملهم لا يتم تمييزها من monocytes إلى الخلايا التي تشبه الضامة23. وثمة قيد آخر هو عدم وجود عناصر رئيسية أخرى في عدوى الـCF وتسليم الأدوية. وCFBE41o- خط الخلية لا تمتلك أهداب ولا تنتج المخاط، الذي يحدث عادة 20-30 يوما من ثقافة الخلية في ALI. لأن هذا لم يكن الحال بالنسبة لCFBE41o- خط الخلية، استخدمنا الخلايا بعد سبعة أيام عندما تم تشكيل حاجز ظهاري ضيق. إزالة المخاطية يغير شروط الإقامة للميكروبات إما24 أو جزيئات المخدرات9,,25 والنماذج في المختبر تقييم ترسب الرئة ينبغي أن تأخذ هذا في الاعتبار. بشكل مختلف عما لاحظته الخلايا الأخرى، والأنسجة ثقافة إدراج طلاء مع مادة مصفوفة خارج الخلية (مثل الليفية أو الكولاجين أنا) لا تظهر فرقا كبيرا لCFBE41o-، على سبيل المثال في TEER26. لذلك، لم يتم المغلفة عوامل التصفية نفاذية مع مادة مصفوفة خارج الخلية في هذا البروتوكول.
مع البروتوكول الموصوف هنا، أحادية وثقافات المشتركة بعد 6 ح العدوى توفير ما يكفي من إطلاق السيتوكين لاستخدامها كمقياس في اختبار المخدرات في المستقبل. الثقافة المشتركة يجلب ميزة التعاون الخليوي في النمذجة الاستجابة المناعية. وكان من المتوقع عدم إتقان tobramycin في الحد من الالتهاب منذ لم يتم القضاء على جميع البكتيريا أثناء العلاج (الشكل 4E, F). ومع ذلك, نمدا الاستجابة للتوساميسين في نموذج CF أمر بالغ الأهمية, كما tobramycin (في تركيزات أعلى) يمكن أن تكون فعالة في تثبيط P. aeruginosa, حتى على بيو فيلم19,27. أحد الاحتمالات لاستخدام هذا البروتوكول هو دمج الأدوية المضادة للالتهابات في العلاج. التوصية العامة بشأن الاستجابات الالتهابية هي استخدام العلاج قصير المدة (6 ساعات) ، والذي لا يزال لديه الخلية المضيفة والبكتيريا الموجودة. بعد هذه النقطة الزمنية، يتم تدمير الخلايا المضيفة في عينات غير المعالجة. ويمكن استخدام كل من ELISA وFACS لقياس إطلاق السيتوكينات. وأخيراً، إذا تم تخزين العينات لفترة أطول من 15 يوماً عند -80 درجة مئوية، فمن المستحسن التحقق من موثوقية السيتوكينات باستخدام، على سبيل المثال، التحكم الإيجابي في العينات الطازجة (مثل الخلايا التي تحفزها LPS).
بعض تعديلات البروتوكول ممكنة. على سبيل المثال، يمكن توسيع نطاق البروتوكول الحالي ليشمل استخدام الأدوية المُبخوسة (الخطوة 3-6). وهذا ضروري لنموذج تسليم الأدوية الرئوية عن طريق استنشاق الفم. إن البخاخات من الأدوية القابلة للذوبان في الماء، مثل التبراميسين، أو ناقلات النانو منها، مثل الكليستين الليبوسومية، هي نسبية إلى الأمام عن طريق الأجهزة المتاحة تجارياً التي تستخدم بشكل روتيني في العيادة. وهناك أيضاً عدة أجهزة متاحة تجارياً لإيداع الهباء الجوي في إدراجات لثقافة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، كما يستند النموذج الموصوف هنا على غشاء دعامات نفاذية، فإنه يمكن أيضا أن تعتمد لبعض microfluidic المعاصرة (مثل "الرئة على رقاقة") الأجهزة، على سبيل المثال، لدراسة تأثير التنفس والتمدد الميكانيكية ذات الصلة والتغيرات في تدفق الهواء. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول بإضافة المخاط أو استبداله بخلايا أولية حسب المسألة العلمية التي سيتم تناولها. آخر خطوة تالية سيكون اختبار النانو الطب, خصوصا وأن تكنولوجيا النانو تحرز تقدما في تطوير رواية مضادة للعدوى28,CF المصححين29 و المشتركة في تقديم المضادات الحيوية و pathoblockers30. بشكل عام، يمكن أن ينظر إلى البروتوكول الحالي على أنه مفيد في تقييم البقاء على قيد الحياة البكتيرية عند العلاج بالمضادات الحيوية في نظام معقد، جنبا إلى جنب مع بعض قراءات ذات الصلة المضيف: سمية الخلايا الخلوية، سلامة الحاجز الظهاري، هجرة الضامة والاستجابة الالتهابية. وهذه بارامترات أساسية لتطوير المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تلقى هذا العمل تمويلاً من برنامج آفاق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتطوير التكنولوجي والبيان العملي بموجب اتفاقية منحة رقم 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - تصميم وتطوير التقانات النانوية المتقدمة للتغلب على الحواجز البيولوجية ومعالجة الأمراض الشديدة. نشكر الدكتورة آنا كوستا والدكتورة جيني جونتك على الدعم الكبير في تطوير الثقافة المشتركة، أولغا هارتفيغ، للتوضيح العلمي، أنيا هونكر، لـ ELISA، بترا كونيغ، جانا ويستهويس والدكتورة كيارا دي روسي على الدعم على ثقافة الخلية، والتحليلات، والمجهر. كما نشكر تشيلسي ثورن على تدقيق مخطوطتنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L.
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
