Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.
Abstract
מחקר fDrug לטיפול בדלקות ריאות מתקדם לקראת חיזוי במודלים מוליטרו של מורכבות גבוהה. הנוכחות הרב-גפית של חיידקים במודלים של ריאות יכולה להתאים מחדש את הסידור האפיתל, בעוד תאים חיסוניים לתאם תגובה דלקתית נגד החיידקים בסביבה מיקרו. בעוד במודלים vivo היו הבחירה לבדיקת אנטי-זיהומים חדשים בהקשר של סיסטיק פיברוזיס, הם עדיין לא לחקות במדויק את תנאי vivo של מחלות כאלה בבני אדם ואת תוצאות הטיפול. מורכבים במודלים מולכיים של דרכי הנשימה הנגועות המבוססות על תאים אנושיים (אפיתל סיפונות וקרופאגים) ופתוגנים רלוונטיים יכולים לגשר על הפער הזה ולהקל על תרגום של נוגדי זיהומים חדשים למרפאה. למטרות כאלה, מודל תרבות שיתופית של סיסטיק פיברוזיס האנושית סימפונות קו תא אפיתל CFBE41o- ו THP-1 מונוציט נגזר מקרופאגים הוקמה, מחקה זיהום של רירית הסימפונות האנושית על ידי P. aeruginosa בממשק אוויר נוזלי (ALI) תנאים. מודל זה מוגדר בשבעה ימים, ואת הפרמטרים הבאים מוערכים בו זמנית: שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג,הישרדות חיידקים, ודלקת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת חזקה ותשובת להערכת יעילות התרופה ותגובות מארחות שיכולות להיות רלוונטיות לגילוי נוגדי זיהומים חדשים ולייטוב אספקת האירוסול שלהם לריאות.
Introduction
פסאודומונס aeruginosa הוא פתוגן רלוונטי סיסטיק פיברוזיס (CF) שתורם ליקוי רקמת ריאה1. הייצור של פוליסכרידים, כגון אלגינט ואקסופוליסכרידים אחרים, מתאם את התקדמות המחלה, מה שמוביל לדבקות חיידקים עקשנית, מגביל את אספקת אנטיביוטיקה לחיידקים ומגן על החיידקים מפני המערכת החיסוניתהמארחת 2. המעבר של P. aeruginosa מהשלב פלנקטוני להיווצרות biofilm הוא נושא קריטי בהקשר זה, גם להקל על המופע של סובלנות לאנטיביוטיקה.
בהקשר של CF, העכבר שימש בעיקר כמודל. עכברים, עם זאת, לא באופן ספונטני לפתח מחלה זו עם המבוא של מוטציות CF3. רוב פיתוח הביופילם החיידקי ותרופות רגישות מחקרים בוצעו על משטחים abiotic, כגון צלי פטרי. עם זאת, גישה זו אינה מייצגת את מורכבות vivo. לדוגמה, מחסומים ביולוגיים חשובים נעדרים, כולל תאים חיסוניים, כמו גם אפיתל ריר. למרות P. aeruginosa הוא רעיל למדי לתאי אפיתל, כמה קבוצות הצליחו לטפח מוקדם P. aeruginosa biofilm עם תאים הסימונכיאליים האנושיים. תאים אלה מקורם חולי סיסטיק פיברוזיס עם מוטציה CFTR (CFBE41o- תאים)4 ומותר להעריך יעילותאנטיביוטית 5 או להעריך את התיקון של חלבון CFTR במהלךזיהום 6. מודל כזה הוצג כדי לשפר את יכולת החיזוי של יעילות התרופה, בנוסף לאפשר אפיון של בעיות עם תרופות שנכשלו בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח תרופות7.
עם זאת, בריאה, אפיתל הריר חשוף לאוויר. יתר על כן, תאים חיסוניים נוכחים בדרכי הנשימה, כמו מקרופאגים רקמה, לשחק תפקיד חיוני נגד פתוגנים בשאיפה אוחלקיקים 8. מקרופאגים נודדים דרך שכבות התא השונות כדי להגיע לומן הסיפונות ולהילחם בזיהום. יתר על כן, תרופות בשאיפה גם צריך להתמודד עם הנוכחות של ריר כמרכיב נוסף שאינו תאי של מחסום דם האווירריאתי 9. ואכן, פותחו מספר תלת מימד מורכבים (תלת מימד) בדגמי מבחנה, במטרה להגדיל את הרלוונטיות של vivo. מערכות שיתוף תרבות לא רק להגדיל את המורכבות של מערכות חוץ חוץ עבור גילוי סמים, אלא גם לאפשר ללמוד אינטראקציות תא. מורכבות כזו טופלה במחקרים על הגירהמקרופאג 10, שחרור פפטידים מיקרוביאליים על ידינויטרופילים 11, התפקיד שלריר בזיהום 9, ואת התגובה תא אפיתל לנזקמוגזם 12. עם זאת, אמין CF נגוע במודל במבחנה הכולל את המוטציה הגנטית ב CF, כי הוא חשוף לאוויר (מצב פיזיולוגי מוגבר), ומשלב תאים חיסוניים עדיין חסר.
כדי לגשר על הפער הזה, אנו מתארים פרוטוקול לתרבות תלת-מית-מית-מית-אנושית יציבה של דרכי הנשימה הנגועות. המודל מורכב של תאי אפיתל סימונכיים CF אנושיים מקרופאגים, נגוע P. aeruginosa ומסוגל לייצג מחסום דיפוזיה ואימונולוגית. במטרה לבחון נוגדי זיהומים בתפוקה גבוהה למדי, תרבות משותפת זו הוקמה על קרום מסנן חדיר של תוספות צלחת באר, באמצעות שני קווי תאים אנושיים: CFBE41o- ו מקרופאגים נגזר THP-1 מונוציט. יתר על כן, כדי ללמוד בסופו של דבר את התצהיר שלתרסיס נגד זיהומים 13, המודל הוקם בממשק האוויר נוזלי (ALI) ולא תנאים מכוסים נוזלי (LCC).
כפי שאנו מדווחים כאן, מודל זה מאפשר להעריך לא רק הישרדות חיידקים על טיפול אנטיביוטי, אלא גם ציטוקסיות תא, שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג, ותגובות דלקתיות, שהם פרמטרים חיוניים לפיתוח תרופות.
פרוטוקול זה משלב שני סוגי תאים רלוונטיים לטיפול בשאיפה של דרכי הנשימה הריאתיות: מקרופאגים ואפיליום סימפונות CF. תאים אלה נזרעים משני צדי המתוספה לתמיכה חדיר, ומאפשרים חשיפה לתא לאוויר (הנקרא תנאי ממשק נוזלי אוויר (ALI). תרבות זו של תאים מארחים נגועה לאחר מכן P. aeruginosa. שני קווי התא המארחים הם ממוצא אנושי: תאי האפיתל מייצגים את האפיתל הסימפונת סיסטיק פיברוזיס, עם מוטציה בערוץ CF (CFBE41o-), ואת THP-1114 תאים הם קו תא מאופיין היטב דמוי מקרופאג. שכבת אפיתל confluent מותרת תחילה ליצור בצד העליון של מותב צלחת באר לפני תאים כמו מקרופאג מתווספים לתא הנגדי. לאחר שהתרבות ההתופת הוקמה ב-ALI, המערכת מחוסנת עם P. aeruginosa בצד apical. מערכת זו נגועה שיתוף תרבות משמש לאחר מכן כדי להעריך את היעילות של אנטיביוטיקה, למשל tobramycin. נקודות הקצה הבאות מנותחות: שלמות מחסום אפיתל במונחים של התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית (TEER), הדמיה של תא תא ותאי-חיידקים אינטראקציות על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), הישרדות חיידקים על ידי ספירה של יחידות יוצרי מושבה (CFU), הישרדות תאי מארח (cytotoxicity) ושחרור ציטוקינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה והבידול של תאים בהוספת תמיכה חדיר
- לטפח CFBE41o- בקבוקון T75 עם 13 מ"ל של מינימום חיוני בינוני (MEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS), 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו 600 מ"ג / L גלוקוז ב 37 ° C עם 5 % CO2 אטמוספרה. מוסיפים מדיום טרי לתאים כל 2-3 ימים.
- נתק את התאים לאחר שהגיע 70% confluence בקבוקון עם 3 מ"ל של טריפסין- חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 7 מ"ל של MEM טרי וצנטריפוגה התאים ב 300 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט והוספו 10 מ"ל חדשים של MEM תוך שיבוש הגושים על-ידי התפתלות בעדינות כלפי מטה.
- ספור את התאים עם מונה תא אוטומטי או תא המוציטומטר אוטומטי. תאי זרע עם צפיפות של 2 x 105 תאים / גם 12-גם לוחות עם תומך חדיר (גודל נקבוביות של 3 μm, ראה טבלת חומרים).
הערה: מונה התא האוטומטי קובע מספר תא, התפלגות גודל וכדאיות של התאים (ראה טבלת חומרים). תומך חדירות עם גודל נקבוביות של 0.4 μm יכול לשמש כאן; עם זאת, יש להוסיף את מקרופאגים, במצב זה, ישירות לצד האפאלי, וההעברה הטרנס-תאית שלהם לא תוערך במקרה זה. - תאי זרע במצב נוזלי נוזלי (LLC) על ידי הוספת 500 μL של מתלי התא בצד apical של תמיכה חדיר ו 1.5 מ"ל של מדיום טרי בצד basolateral. לאחר מכן דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2, עבור 72 שעות.
- כדי לעבור לתרבות ממשק האוויר-נוזלי (ALI), ביום השלישי לאחר זריעה, להסיר את המדיום מהצד basolateral הראשון, לאחר מכן מהצד apical. לצד הבאסולטרלי, להוסיף 500 μL של MEM טרי ולשנות את המדיום בכל יום שני עד תאים יוצרים שכבת מונו-שכבה confluent.
הערה: עבור התנאים המשמשים בפרוטוקול זה, CFBE41o- תאים בדרך כלל הם confluent לאחר 3-7 ימים בתרבות. - להעריך את מאפייני מחסום האפיתל ביום 7 על ידי דגירה CFBE41o- תאים עם 500 μL תא בינוני בצד apical ו 1.5 מ"ל בצד basolateral עבור 1 h, ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.
- למדוד את מאפייני המחסום באמצעות התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER), עם אלקטרודה צ'ופסטיק STX2 וmmeter וולט אפיתל; לאחר 7 ימים זה גבוה מ- 300 Ω×cm².
הערה: בסופו של דבר, בחלק מהתוססות קרום, התאים יש TEER נמוך. לכן לא נעשה שימוש בתוסוסים חדירים עם TEER < 300 Ω×cm².
- כדי לטפח תאי THP-1, לגדל אותם בקבוקון T75 באמצעות 13 מ"ל של רוזוול פארק ממון מכון (RPMI) 1640 בינוני בתוספת עם 10% FCS, ולדגר ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2. פיצול תאים בכל יום שני על-ידי זריעת 2 x10 6 תאים/תאי מ"ל במבחנון T75 חדש.
הערה: תאי THP-1 שאינם מובדילים גדלים כמו מונוציטים בהשעיה.- הבדיל את תאי THP-1 באופן הבא. תכולת צנטריפוגה של T75 ב- 300 x g למשך 4 דקות. השליכו את הסופרנטנט, תוסתו מחדש את הכדור במדיום טרי והכניסו T75 חדש. להוסיף 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA) אינקובטי התאים RPMI עבור 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2 אווירה 15.
הערה: לאחר ההבידול עם PMA, תאים אינם משגשגים עוד וצורף לסקבוקון. - כדי לנתק תאי THP-1 כמו מקרופאג', לשטוף פעם אחת עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) ב 37 °C דגירה עם 3 מ"ל של פתרון ניתוק תאים (למשל accutase) המכיל 0.5 mM EDTA עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לחפש ניתוק תאים. הוסף 7 מ"ל של מדיום וצנטריפוגה טריים ב-300 x g למשך 4 דקות ב-RT.
הערה: ניתן גם לנתק מקרופאגים באמצעות trypsin-EDTA, 37 °C למשך 20 דקות. עם זאת, trypsin קשה יותר מקרופאגים מאשר פתרון ניתוק התא שנבחר (ראה טבלת חומרים). - לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את תאי מקרופאג ב 3 מ"ל של THP-1 בינוני לתוך צינור חרלי 15 מ"ל, לספור את התאים כמתואר ב 1.1.2. ותדגירה לשעה אחת לכל היותר ב- 37°C מתחת ל- 5% CO2 לפני הגדרת התרבות ההתוכלתית.
הערה: תאי THP-1 בהשעיה יכולים להיות מוכתמים בצבעי קיימא כדי להמשיך ולמצוא את התרבות ההפוכת. בשלב זה, השתמש בהליך שלהלן (שלב 1.2.5). - מקרופאגים כתם עם 10 μM של צבע הכדאיות של התא (מבוסס על ההמרה של moieties אצטט על ידי אסטראזה תאית, ראה טבלת חומרים)שבו 3 μL של צבע הכדאיות של התא מוחל על מתלה התא. דגירה תאים במשך 20 דקות ב 37 ° C, 5% CO2, ולאחר מכן לשטוף 1x עם PBS 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הצבע.
הערה: צנטריפוגה התאים כדי להסיר את הצבע ב 300 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הבדיל את תאי THP-1 באופן הבא. תכולת צנטריפוגה של T75 ב- 300 x g למשך 4 דקות. השליכו את הסופרנטנט, תוסתו מחדש את הכדור במדיום טרי והכניסו T75 חדש. להוסיף 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA) אינקובטי התאים RPMI עבור 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2 אווירה 15.
2. הקמת תרבות שיתוף אפיתל-מקרופאג על תמיכות חדירות
- השתמש ב- CFBE41o- שכבות מונו-שכבות ב- ALI עם TEER - 300 Ω×cm² (שלב 1.1.6). מוציאים את המדיום מהתא התחתון, הפוך בזהירות את התמיכה בתוך צלחת פטרי מזכוכית סטרילית (50 מ"מ x 200 מ"מ), והסר את התאים המגודלים דרך נקבוביות הממברנה בצד התחתון של הממברנה באמצעות מגרד תאים.
הערה: בשל גודל הנקבוביות של 3 μm, תאים אפיתל נוטים לגדול דרך הנקבוביות לכיוון הצד basolateral. לכן, יש להסיר אותם לפני הוספת מקרופאגים בצד זה. CFBE41o- תאי אפיתל ריאות ניתן להכתים בשלב זה. ניתן להשתמש בהליך בשלב 1.2.5; עם זאת, במקום מתלה תא, פתרון הצבע ב MEM מוחל (500 μL צד apical בלבד) על התאים דבקים על תמיכה חדירות. - השתמש 2 x 105 תאים / באר (ב 200 μL של RPMI) מהתלה התא של מקרופאגים THP-1 מופללים PMA ולמקם את התאים בצד basolateral של תוספות הפוכות.
- סוגרים בזהירות את מנות פטרי ומדגרים למשך 2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2.
- מניחים את התוספות בחזרה לתוך 12-באר microplates ולהוסיף 500 μL של MEM בינוני בצד basolateral של תוספת חדירות כדי לשמור על תנאי ALI. התאים מוכנים כעת לזיהום.
3. זיהום על ידי P. aeruginosa
הערה: כל השלבים הבאים מכאן חייבים להיעשות במעבדה ברמה 2 (BSL2).
- לחסן 15 מ"ל של מרק ליסוגני (LB) בתוספת 300 μg / מ"ל אמפוצילין בקבוקון Erlenmeyer (50 מ"ל) עם מושבה אחת של P. aeruginosa PAO1-GFP.
הערה: זנים אחרים של P. aeruginosa יכול לשמש גם כאן, למשל, PAO1 סוג פראי, PA14, או זנים קליניים, בעקבות פרוטוקולי טיפוח משלהם. - דגירה החיידקים במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 180 סל"ד.
- מעבירים את התוכן לאחר 18 שעה לצינור חסונים של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-3850 x g למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והוספו 10 מ"ל PBS סטרילי ב-37°C.
- למדוד צפיפות אופטית על ספקטרופוטומטר באורך גל 600 מילימטר ולהתאים את ריכוז החיידקים באמצעות תא תרבות בינונית לריכוז סופי של 2 x 105 CFU / מ"ל. זה מתאים ריבוי של זיהום (MOI) של חיידק אחד לכל תא אפיתל.
- להוסיף 100 μL של השעיה חיידקים לצד apical של תמיכה חדירות (שלב 2.4.) וגינור ב 37 °C תחת 5% CO2 עבור 1 h, כדי לאפשר חיידקים מצורף לתאים. לאחר מכן, להסיר נוזל apical בזהירות עם פיפטה כדי לשחזר את תנאי ALI. שמור כמה דגימות נגועות כפקד.
הערה: בשלב זה, החיידקים המצורפים צריך להיות מצופה LB אגר (ראה שלבים 5.4/5.5) כדי לקבוע את inoculum חיידקים ראשוניים. - דגירה התרופה של עניין לאחר הדבקה חיידקית בתאים. לניסויים בטיפול, להוסיף 500 μL של פתרון תרופה מדוללת במדיום התא (בפרוטוקול זה tobramycin 6 μg / מ"ל שימש) לצד apical. להוסיף 1,500 μL של תא בינוני ללא תרופה בצד basolateral.
הערה: במקום להחדיר את התרופות כפתרון, המודל יכול להיות מותאם גם לתצהיר אירוסול. למטרות כאלה, התאים ב ALI מוזנים מהצד basolateral עם 500 μL של תא בינוני. לאחר מכן התרופה היא ערפילית הראשונה ומותר להפקיד בתא apical על ידי מכשיר מתאים (לא מתואר כאן). ניתן לבדוק את הדגימה הנגועה והמטופלת עבור נקודות הקצה המתוארות בסעיפים 4-7. ממדרגה זו, ניתן להשתמש בתמינים חדירים כדי ליצור תמונות (סעיף 4) או כדי לקבל תוצאות של צמיחת חיידקים וכדאיות תאים יונקים, בין היתר (סעיפים 5-7).
4. הכנה לדוגמה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודאלי (CLSM)
- לאחר הקמת התרבות ההתפלה, הזיהום והטיפול התרופתי, הסר את כל המדיום מהצד האפאלי והבסולטרלי. לשטוף 1x עם PBS ב 37 ° C ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעה ב RT (300 μL על apical / 600 μL על basolateral). גרעין התא מוכתם עם 5 μg /mL של DAPI-PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
אזהרה: PFA הוא מסוכן. - חותכים את הממברנות באמצעות אזמל ומניחו אותן בין שתי שקופיות כיסוי מיקרוסקופיות של 12 מ"מ באמצעות אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים). תן לו להתייבש בתוך ספסל הזרימה במשך 30 דקות לפני האחסון ב 4 מעלות צלזיוס. דמיין על-ידי מיקרוסקופ סריקה קונפוקל.
הערה: לאחר התרבות ההתקוטטות ולפני ההרכבה, ניתן לבצע צמתים הדוקים. בשביל זה, תאים קבועים עם paraformaldehyde 3% עבור 30 דקות, נשטף שוב עם PBS, ו permeabilized עם saponin 0.05%/BSA 1% ב PBS. בפרוטוקול זה, חלבון zonula occludens (ZO-1) זוהה באמצעות נוגדן ZO-1 אנטי-אנושי של העכבר (1:400, דגירה ב 4 °C לילה). הדגימות היו אז דגירה במשך 2 שעות ב RT עם נוגדן IgG נגד עיזים אלקסה פלור 633 (1:2000 באדום). גרעין היו מוכתמים DAPI (1 μg / מ"ל) והרכוב עם הרכבה בינונית על כיסויים. - השתמש במיקרוסקופ קונפוקל להדמיית הממברנות המאוחסנות. בחר יעדים ולייזרים של 25x או 63x לטבילה במים ב- 405, 488, 505 או 633 נה"מ לזיהוי. לתמונות צריכה להיות רזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים.
הערה: הלייזרים נבחרים על פי הכתם המשמש. - רכוש תצוגות apical ורוחב חתך, והשתמש במצב זטה-מחסנית (10-15 ערימות) לבניית מודל תלת מימדי באמצעות תוכנת הדמיה.
5. מדידה של התפשטות חיידקים באמצעות יחידות יוצרי מושבה (CFU)
- לאסוף את המדיום apical ו basolateral (המכיל חיידקים) כדי להעריך CFU של חיידקים שאינם מחוברים. לאסוף 500 μL מן הצדדים apical ו basolateral והבריכה אותם.
הערה: השתמש בהשעיה זו ישירות כדי לספור חיידקים (שלב 5.4) או צנטריפוגה ב- 21,250 x g עבור 10 דקות כדי להעריך את ההירוגנאז של הקטאט (LDH) מהסופרנט (סעיף 6) ו/או מושהה מחדש ב-PBS כדי לספור חיידקים חוץ-תאיים (שלב 5.4). - להעריך את ההישרדות של חיידקים מחוברים ו / או הופנימה בתאים על ידי הוספת 500 μL של מים קרים deionized סטרילי בכל תא של התמיכה חדירות. דגירה תאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן לתגלח את הדגימות על LB agar (ראה שלב 5.4) או קפוא (כמו לוח הוספה שלם) ב-20 °C עבור ציפוי מאוחר יותר. - להערכת CFU של חיידקים דבקים /פנימיים, להפשיר דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (אם קפוא). באמצעות טיפים פיפטה עבור כל באר, לגרד את משטח קרום פיפטה למעלה ו למטה כדי להסיר את כל התוכן דבק.
הערה: בשלב זה, כל תאי האפיתל הם lysed חיידקים adherent / פנימי זמינים כמו השעיה להיות מצופה. - עם המתלים החיידקיים משני השברים, לבצע דילול סדרתי 1/10 באמצעות Tween-80 0.05% PBS וצלחת החיידקים על לוחות אגר LB.
הערה: מומלץ לדללות בין 1 ל- 10. יש לספור את החיידקים באופן הגבוה ביותר, שבו מושבות בודדות מזוהות לראשונה. - דגירה צלחות אגר ב 30 מעלות צלזיוס עבור 16-72 שעות לספור מושבות, ולחשב CFU בהתאם.
הערה: טמפרטורה של 30°C בזמן הדגירה של צלחת חיונית עבור דגימות מטופלים כדי לצפות בצמיחה מושהית של מושבות.
6. הערכה של ציטוקסיות תא באמצעות לקטאט דהירוגנאז תסיסה
- השתמש supernatant של תאים נגועים המכילים חיידקים (מ שלב 5.1) להערכת יכולת הכדאיות של התא עבור LDH assay16. צנטריפוגה supernatant ב 21,250 x g עבור 10 דקות כדי גלולות החיידקים ובסופו של דבר שאר התאים. השתמש supernatant ללא חיידקים כדי למדוד שחרור LDH.
הערה: אין להקפיא את הסופרנט לפני מדידת LDH על-ידי הודעה זו. - להעביר 100 μL של supernatant לצלחת 96-באר, ולהוסיף 100 μL של פתרון LDH אסאי (ראה את טבלת החומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך, ואז לקרוא ספיגה ב 492 nm.
7. הערכת שחרורו של ציטוקינות אנושיים
- לכמת ציטוקין, השתמשו במערך ELISA או במערך חרוזיםציטומטרי 17 (ראה טבלת החומרים). כך, supernatant צנטריפוגה מ שלב 5.1 ב 21,250 x g עבור 10 דקות למדוד באופן מיידי או לאחסן -80 °C עד 15 ימים עד הניתוח.
- הערך סופרנטנטים באמצעות ערכת ELISA הזמינה מסחרית.
הערה: ההליך עוקב אחר הוראות הייצור, הכוללות ציפוי של לוחות עם נוגדן הלכידה, תוספת של הדגימות (100 μL) ותקני ציטוקין, דגירה, כביסה, ותוספת של נוגדן זיהוי כדי לספק מדידה צבעית של נוכחות ציטוקין. לחלופין, ציטומטריית זרימה יכולה לשמש כדי למדוד ציטוקינות באמצעות ערכות זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A מראה את המורפולוגיה של התרבות ההפוכה של תאי אפיתל הסימונכיים האנושיים וקרופאגים לאחר גידול במשך 24 שעות בצד האפי והבסולטרלי של תמיכות חדירות, בהתאמה. שלמות מחסום האפיתל מוצגת על-ידי TEER גבוה יותר (834 Ω×cm2)ו- CLSM על-ידי חיסון עבור חלבון צומת הדוק ZO-1(איור 1B). אותן תוצאות שנצפו במונחים של שלמות מחסום של CFBE41o נגוע- monoculture ניתן לראות בתרבויות שיתוף אפיתל-מקרופאג נגוע.
כדי מודל זיהום חיידקי, P. aeruginosa היה מחוסן בריבוי של זיהום (MOI) של 1:1 על CFBE41o- תאים. שש שעות לאחר הזיהום (איור 2A), מקרופאגים נצפו בצד האפאלי של התרבות ההשתתפית. לאחר הזיהום, TEER ירד מ 834 כדי 250 Ω×cm2, המציין מחסום אפיתל בסכנה, כפי גם הדמיה על ידי כתמים ZO-1(איור 2B).
איור 3 מראה הגירה מקרופאג דרך נקבוביות קרום חדיר וספיגת חיידקים על ידי תאי THP-1 בצד apical. הדגימות תוקנו ב-1, 3 ו-6 שעות לאחר הדגירה מניסויים עצמאיים. במונוקולטורה THP-1 (איור 3A-C), נדידת מקרופאגים נצפתה כבר בשעה אחת, בעוד שבתרבות ההפופת(איור 3D-F),זה נראה לאחר זיהום של 3 שעות. ספיגת חיידקים ב THP-1 נצפתה לאחר 3 שעות של זיהום, הן monoculture והן תרבות שיתופית. לא ניתן היה לראות ספיגה חיידקית על ידי CFBE41o. תצוגות חוצות-חתך הונחו כך שהתמיכה הממברנה הניתנת הייתה באמצע כהפרדה של התא האפדי והבסולטרה.
איור 4 מציג תמונות מיקרוסקופיות סריקה קונפוקלית של תרבויות מופדקות נגועות (CFBE41o- + THP-1) שטופלו עם או בלי tobramycin במשך 6 שעות (איור 4A, B) או 20 שעות(איור 4C,D). ללא טיפול, הן תאי האפיתל והן מקרופאגים מתו לאחר 20 שעות של זיהום (איור 4C). עם זאת, על טיפול tobramycin, התאים המארחים נשמרים לאחר 20 שעות; עדיין, חיידקים מסוימים ניתן לצפות בתרבות. למרות שנראה לאחר 6 שעות של טיפול בתמונותמיקרוסקופיה (איור 4B),החיידקים לא להתרבות כפי שנצפה ב- CFU פעמים ב איור 4E. אף על פי כן, לאחר טיפול 20 שעות, החיידקים התאוששו יכולת ההתפשטות, כפי שניתן לראות על ידי המושבות ב- CFU assay(איור 4F). פרוטוקול הליזה של התא עם מים קרים ותגרדות יכול לשחרר חיידקים המחוברים ואולי מופנים בתאים. במקביל, התאים נהרסים (איורמשלים S1A, ב). שלבי הצנטריפוגציה המשמשים בנייר זה עבור תאי אפיתל (300 x g)או חיידקים (21,250 x g)לא פגעו בכדאיות של שניהם(דמויות משלימות S1C, D). כל ההתפלה של CFU בוצעו על ידי הקפאת הדגימות ב-20 מעלות צלזיוס, ולאחרמכן הפשרה וציפוי. הליך זה הפחית את מספר החיידקים על ידי 2-יומנים, לעומת דגימות טריות(איור משלים S1E). מכיוון שהליך זה נעשה בו זמנית עבור כל הקבוצות הניסיוניות (מטופלות ולא מטופלות) בנקודות זמן שונות, הפחתה זו תשולב בתוצאות הסופיות(איור משלים S1E). יתר על כן, הריכוז של tobramycin בשימוש כאן לא הראה רעילות עבור תאים נגועים(דמות משלימה S2A)וגם אין תגובה דלקתית נוספת(דמות משלימה S2B). עם זאת, זה היה בטווח של הריכוז המעכב המינימלי להרוג P. aeruginosa.
איור 5 מציג את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית (TEER) ואת יכולת הכדאיות של התא. איור 5A-B ממחיש את ה-TEER של מונוקולטורה ותרבויות מפעולה. התרבות ההפופת של CFBE41o- תאים עם THP-1 לא לגרום כל שינוי שלמות מחסום האפיתל בהשוואה monoculture (פסים אדומים). עם הזיהום, ערך TEER ירד (בר ירוק). לאחר 1 שעה של זיהום, כמה דגימות טופלו עם tobramycin אנטיביוטיקה (בר כחול), עבור 6 או 20 שעות. הטיפול שמר על שלמות מחסום האפיתל, כפי שנצפה על ידי TEER גבוה יותר. איור 5C מציג את אחוז שחרור LDH כאינדיקציה של רעילות תאים על זיהום וטיפול tobramycin לאחר 6 שעות. התרבות ההופעולה עצמה גרמה לשחרור של LDH, שהיה זהה לתאים הנגועים (כ-20%). לאחר 20 שעות של זיהום, לא ניתן היה לזהות אות של LDH. כדי להוכיח אמינות LDH לזיהום לטווח ארוך, PAO1-GFP היה דגירה בינוני עם ובלי LDH 1 U/mL בהשוואה לפקדים נגועים בהתאמה(דמות משלימה S2C). אות LDH אבד לאחר דגירה ממושכת (20 ש' ) עם P. aeruginosa, המציין כי LDH יציב רק בזמנים דגירה קצרים יותר בתרבויות נגועות.
איור 6 מראה את הקינטיים של ציטוקינות פרו דלקתיות שזוהו באמצעות ELISA. היתרון של תרבות שיתופית נגועה של CFBE41o- ו THP-1 תאים נצפתה עם הפרשות גבוהות יותר של ציטוקינות פרו דלקתיות. הפרשתם של ציטוקינים פרו דלקתיים הייתה דומה (IL-6) ומעלה (IL-8, TNF-α, IL-1β) בתרבות הנגועה(איור 6C)מאשר במונוקולטורה המתאימה(איור 6A-B). באופן בלתי צפוי, כמה ציטוקינות במונוקולטורה THP-1(איור 6B)הם בפחות מוסדר בדגימות נגועות (Il-8, TNFα, IL-1β).
איור 7 מדגים את שחרורו של ציטוקינות במונו- ותרבויות מופיינות על זיהום וטיפול עם tobramycin נמדד באמצעות פלואורסצנציה מופעל מיון תאים (FACS). הפרשת ציטוקין הפרו דלקתי IL-8(איור 7A)והציטוקין האנטי דלקתי IL-10(איור 7F)היו גבוהים יותר בתרבויות הותבות של תאים אפיתלים וקרופאגים, בהשוואה למונוקולטורה. עם זאת, עבור כל ציטוקינות אחרות (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 ו- GM-CSF) (דמויות 7B-E),רמות הפרשת ציטוקין לא היו גבוהות יותר בתרבות ההפופת כי במונוקולטורה המתאימה.
איור 1: חתך רוחב ותצוגות אפיות של התרבות ההתפתל-מקרופאג' הלא נגועה. (א)תצוגות צולבות של תרבות שיתוף אפיתל-מקרופאג 24 שעות לא נגועות. CFBE41o- אדום מוכתם, מקרופאגים THP-1 בצהוב ובגרעין בכחול (DAPI). (ב)השקפות אפיות של CFBE41o הלא נגוע- מונו-שכבתי מוכתמים ב-ZO-1 (אדום). גרעין. הסורגים בקנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: חתך רוחב ותצוגות אפיות של התרבות הנגועה של תרבות שיתוף אפיתל-מקרופאג'. (א)תצוגות צולבות ו -(ב)תצוגה apical של תרבות שיתוף אפיתל-מקרופאג ב 6 שעות לאחר זיהום (hpi) עם P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- מוכתם באדום, מקרופאגים THP-1 בצהוב, גרעין בכחול (DAPI) ו P. aeruginosa PAO1-GFP בירוק. (ב)תצוגות אפיות של 6 h נגוע CFBE41o- מונו-שכבתית. הסורגים בקנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: קינטיקה של טרנסמיג מקרופאג וספיגת חיידקים חזותית על-ידי חתך רוחב של דגם תלת-מיוד. PAO1-GFP קינטיקה זיהום במונוקולטורה של מקרופאגים THP-1 (A-C) או שיתוף תרבות(D-F). מקרופאגים THP-1 מוכתמים באדום, גרעין של תאי אפיתל בכחול (DAPI), ו P. aeruginosa בירוק (GFP). כל דמות מחולקת לצדדים אפיים ובסולטרליים, החלל שביניהם נחשב לממברנה, הריקה או הכבושה על ידי CFBE41o- שכבת קונפלנטית (D-F). תוספות בנתונים מראות ספיגת חיידקים על ידי מקרופאגים בזמנים שונים (A-F). הסורגים בקנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפיון של הישרדות PAO1-GFP ב-co-cultur e.(A-D) מיקרוגרפים קונפוקאליים שיתוף תרבויות עם ובלי טיפול. (א)תרבות שיתופית לא מטופלת לאחר 6 שעות של זיהום. (ב)תרבות שיתופית נגועה שטופלה בטוברמיצין 6 μg/mL (טוב) במשך 6 שעות(ג)תרבות שיתופית לא מטופלת 20 שעות לאחר הזיהום,(D)נגועה בתרבות ההדבקה שטופלה בטוברמיצין 6 μg/mL במשך 20 שעות. גרעין מוכתם DAPI (כחול), מקרופאגים (אדום) ו P. aeruginosa GFP (ירוק). (ה)יחידות יוצרי מושבה (CFU) של חיידקים דבקים / פנימיים לאחר 6 ו - (F) 20 שעות עם tobramycin 6 μg / mL טיפול. הוספת קרום ריק שימש כצע abiotic לגדול PAO1-GFP. נעשה שימוש ב-ANOVA דו-דרךית עם מבחן ההשוואות המרובות של טוקי (# אין מושבות), *p < 0.05; ב-2015, לאחר ש-1000 מיליון דולר, ת"א 35, ב-2015, לאחר ש-1000 מיליון דולר, התו לא, ns: לא משמעותי. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן, n = 9-27 שכפולים של ניסויים עצמאיים 3-9. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: שלמות מחסום והערכה של הכדאיות של מונו-תרבות שיתופית. התנאים הבאים של תרבות המשנה הוערכו: לא נגועים (פסים אפורים), נגועים (ברים ירוקים), או נגועים ומטופלים עם tobramycin (פסים כחולים). (A)התנגדות חשמלית Transepithelial לאחר 6 שעות ו - (B) 20 שעות של זיהום בתרבויות מונו (CFBE41o- ו THP-1) ותרבות שיתופית. (ג)Cytotoxicity של מונו- ותרבות שיתופית נמדד באמצעות שחרור LDH 6 שעות לאחר זיהום. נעשה שימוש ב-ANOVA דו-מדרכה עם בדיקת השוואות מרובות של Tukey; *p;0.05; ב-2015, לאחר ש-1000 מיליון דולר, התו לא, ns: לא משמעותי. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן; n = 9 שכפולים של שלושה ניסויים עצמאיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: קינטיקה של שחרור ציטוקין של supernatants מונו נגוע ונגוע- ותרבות שיתופית מוערך באמצעות ELISA. אליסה נעשתה על פי פרוטוקול יצרן הערכה. (A) CFBE41o-, (B) THP-1, ו - (ג)שיתוף תרבות שחרור IL-8, TNF-α, IL-1β, ו- IL-6. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. n = 6 שכפולים של 2 ניסויים עצמאיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: תוצאות Supernatant של לוח ציטוקין נמדד באמצעות FACS עם ובלי tobramycin 6 μg / מ"ל עבור 6 שעות לאחר זיהום. סופרנטנטים של מונו- ותרבות שיתופית לאחר 6 שעות לאחר הזיהום שימשו לניתוח ציטוקינות בהתאמה IL-8 (A), IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) ו IL-10 (F). סרגל השגיאה מציין סטיית תקן, n = 9 שכפולים של 3 ניסויים עצמאיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים S1: ניסויים בקרה עבור שלבים קריטיים של הפרוטוקול. (A, B) מיקרוגרפים של CFBE41o- תאים ב 24-well צלחות גדל במשך 2 ימים בצפיפות של 2 x 105 תאים / גם. (A) CFBE41o- תאים PBS במשך 30 דקות, ו - (ב)תאים שטופלו במים לאחר 30 דקות לאחר גירוד עם פיפטה. (ג)הכדאיות של תאי היונקים לאחר צנטריפוגה. CFBE41o- תאים הוסרו מבקבוק תרבות תא T75 כמתואר בשלב 1.1.1 ו 1.1.2. 100 μL של מתלה התא וכתוצאה מכך נותח בפתרון isotonic 10 מ"ל. מונה תא אוטומטי שימש להערכת הכדאיות של תאים בודדים. לאחר מכן, מתלי התא בהתאמה היו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 4 דקות, מחדש הושעה ונספר שוב. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן, n = 6 מבחנות שונות של 2 ניסויים בודדים. (ד)כדאיות של PAO1-GFP לאחר צנטריפוגה. PAO1-GFP חיידקים היו מדוללים OD = 0.01 במדיום התא. CFU הוערך באמצעות שורת דילול פי 10 וצלחות LB דגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס. צינורות פלסטיק בהתאמה היו צנטריפוגות ב 21,250 x g עבור 10 דקות והושהו מחדש בינוני. CFU הוערך בהתאם שוב. מבחן T של תלמיד דו-זנב, * p < 0.033. סרגל השגיאה מציין סטיית תקן, n = 6 מתוך 2 ניסויים. (ה)ישנות של חיידקים לאחר הקפאה. PAO1-GFP חיידקים הוכנו כמו (D) ו CFU נותח, אז צינורות פלסטיק הוקפאו ליום אחד ב -20 מעלות צלזיוס והופשרה להעריך CFU שוב. מבחן T של תלמיד דו-זנב, *** p < 0.001. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן, n = 6 מתוך שני ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: ניסויי בקרה כדי להעריך התנהגות LDH והשפעה של tobramycin. (A)ניסוי בקרה להערכת cytotoxicity לאחר 20 שעות של דגירה עם 6 μg / מ"ל tobramycin. מונו- ותרבות שיתופית נעשתה כמתואר בפרוטוקול, אבל תאים גדלו במשך 2 ימים על 24-well צלחות ותאי THP-1 נזרעו באופן אפיל. תאים עם 6 μg / מ"ל tobramycin או פקדים היו דגירה במשך 20 שעות. ANOVA חד-כיוון, מבחן ההשוואות המרובות של Tukey, *** p < 0.001. שורת השגיאה מציינת סטיית תקן, n = 6 מתוך 2 ניסויים (CFBE41o-), n = 3 של ניסוי אחד (THP-1 ותרבות שיתופית). (ב)שליטה-ELISA של supernatants של מונו- ותרבות פעולה עם / בלי tobramycin. תרבות התא נעשתה על פי (א) כדי להראות שום שחרור ציטוקין לעומת פקדים עבור כל התנאים. ELISA נעשה בשלב 7.1 ו 7.2, 10 μg/mL (LPS) נוספה כפקד, IL-8 שחרור עבור פקדים שטופלו LPS המכיל THP-1 היה גבוה יותר ניתן לזיהוי. ANOVA דו-מדרכה, מבחן ההשוואות המרובות של טוקי, ns p > 0.12; * p < 0.033; p < 0.001. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן, n = 6 מתוך שני ניסויים, n = 3 של ניסוי אחד (בקרת LPS). (ג)השפלה LDH עקב התפשטות מוגזמת PAO1-GFP. LDH נוספה בריכוז של 1 U/mL ל-MEM Medium. LDH בינוני או אמצעי בקרה שימש לדלל תאים OD = 0.01 (מתאים 1 x 108 CFU / מ"ל) ולאחר מכן דגירה עבור 20 ש. LDH assay נעשה כמתואר בסעיף 6. ANOVA חד-כיוון, מבחן ההשוואות המרובות של Tukey, ns p > 0.12; p < 0.001. שורת השגיאה מציינת סטיית תקן, n = 8-9 מתוך שלושה ניסויים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור תרבית 3D של דרכי הנשימה הנגועות, המהווה על ידי סיסטיק פיברוזיס הסימפונת הסימפונת קו תא CFBE41o- ואת קו תא מקרופאג מונוציט אנושי נגזר THP-1. הפרוטוקול מאפשר הערכה של שלמות מחסום אפיתל, תרדת מקרופאג, הישרדות חיידקים, ודלקת, שהם פרמטרים חשובים בעת בדיקת יעילות התרופה ותגובות מארח בו זמנית. החידוש במודל טמון בהתאגדות של תאי אפיתל (כלומר קו תא CF אנושי מקרופאגים) עם זיהום חיידקי חריף (כלומר P. aeruginosa). הזיהום החריף בתאי האפיתל הוכח להיות נשלט על ידי אנטיביוטיקה (כלומר tobramycin). מלבד השימוש בקו תא CF אנושי, המודל כולו מוגדר בתנאי ALI, אשר קרוב באופן משמעותי לתנאים הפיזיולוגיים ב CF. השימוש בקו תא CF מיישם חלק ממאפייני המחלה במודל. המוטציה של רגולטור מוליכות טרנסמברנה סיסטיק פיברוזיס (CFTR) קשורה ישירות לדה-רגולציה של הובלת נוזל אפיתל בריאות. יתר על כן, מוטציות בגן CF, כגון 7F508, לגרום ריר עבה, עם דלקת ונזק ריאות חמור על זיהום עם P. aeruginosa4. ביטויים פתולוגיים אלה הנגרמת על ידי CFTR תפקודי עלול להיות כרוך ליקוי autophagy כמנגנון תאי חשוב הקשורים פתוגנזה של מחלת ריאותCF 18. עם זאת, CFBE41o- להיכשל ריר סודי, שהוא מגבלה של קו תא זה. אם הוא נועד ללמוד את התפקיד של ריר באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול יכול להיות מותאם באמצעות קווי תא סיפונות אחרים (למשל, Calu-3).
אחד הצעדים הקריטיים כדי להגדיר פרוטוקול זה הוא השילוב של תאים אפיתל ומערכת החיסון ואת הזיהום הבא עם P. aeruginosa ב עלי. הזיהום של CFBE41o- על ידי P. aeruginosa במבחנה כבר תואר, בעיקר באמצעות תא זרימה תא, בתוספת ארגינין בתקשורת התרבות, כדי לשפר את הישרדות תאים אפיתל ולתמוך היווצרות biofilm19. הפרוטוקול הנוכחי מכוון מודל חדש באמצעות תאים אנושיים בלבד, אשר יתר על כן, ניתן לגדול על ALI על תוספות צלחת באר חרושת עבור תפוקת מדגם גבוה יותר. הכללת מקרופאגים מוגדלים THP-1 כקו תא מונצח אנושי, במקום להיות תלוי בהשגת תאים ראשיים לשחזור מתורמים, הוא יתרון נוסף של המודל שלנו. על ידי הוספת מקרופאגים אלה לצד הבאסולטרלי של תמיכה קרום חדיר, נצפתה כי מקרופאגים בולטים ובסופו של דבר היגרו לצד האפי של מחסום האפיתל גדל מסנן. וריאציה של פרוטוקול זה יכולה להיות תוספת של מקרופאגים ישירות בצד האפי על גבי תאי האפיתל, כפי שתואר על ידי Kletting ואח . 14. דינג ואח'. 10 עכבר בשימוש לואיס תאי קרצינומה ריאות על להוסיף תומך חדיר בשילוב עם מקרופאגים בצד basolateral נגוע S. aureus, פתוגן קריטי נוסף של זיהום כרוני בחולים CF. עם זאת, במחקר זה, לא היה דגש על סיסטיק פיברוזיס או להשתמש בתרבות ההשתפת כפלטפורמה להערכת יעילות התרופה. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לזיהומים חיידקיים אחרים, כגון Staphylococcus aureus, מורסה Mycobacterium, או Burkholderia cepacia- פתוגנים חשובים בריאה CF.
שלב קריטי נוסף הוא הוספת מקרופאגים THP-1 לתאים על-ידי הפיכת התוספות הניתנות הפוכות (סעיף 2). זה חיוני כדי להעריך את הטרנס-הגירה מקרופאג דרך הבאר לצד של זיהום. תהליך ההדמיה מאוחר יותר מדגמי תלת-ממדיים עם ערימות z, ותצוגת חתך רוחב, ניתן לבצע כדי לצפות בתוך מקרופאגים ולזהות ספיגת חיידקים(איור 3). ב 1 hpi, חיידקים מוחלים בצד apical לנדוד דרך הממברנה, בעוד נדידת מקרופאג וספיגה מתרחשים רק ב 3 hpi. לכן לאחר 1 שעה של זיהום, זה היה מתאים להתחיל את הטיפול עם tobramycin ויש לי את האפשרות לטפל הן תא מארח והן הישרדות חיידקים לתקופה ארוכה (20 שעות). במהלך הפרוטוקול, שמירה על עקירות היא בעיה קריטית בשל ריבוי הצעדים שכל אחד מהם נושא את הסיכון לזיהום. אף על פי כן, אנשי תרבות תא מנוסים יוכלו לעקוב אחר פרוטוקול זה לאחר הכנה והכשרה מתאימה. יש לבדוק באופן קבוע אם יש לבדוק אם יש זיהום בתא, רצוי לאחר כל הצעדים הקריטיים.
כמו בכל מודל, לתרבות הנגועה יש גם כמה מגבלות; לדוגמה, השילוב של התאים הדומה למקרו-מסאז'. כאן, היה חשוב יהיו מקרופאגים בצד הבאסולטרלי; עם זאת, המניפולציה של המוסף עם שכבת אפיתל שגודלה בעבר אולי סיפקה נזק מוקדם והפרעות לתרבות ההפעולה. למרות, מודל התמיכה חדירות סיפק מאפייני תפוקה גבוהה, אשר לא נצפתה בתרבויות מפעולה קודמות של ריאות נגועותCF 20,21. עם זאת, ניסויים נוספים צריכים להעריך את המגבלות של שימוש THP-1 כתחליף מקרופאג." בעוד קו תא זה נמצא בשימוש נרחב, הוא מגיב פחות LPS22 והוא חסר הפעלה מלאה ואת האוכלוסייה כולה אינה מובדילה ממונוציטים לתאים כמומקרופאג 23. מגבלה נוספת היא היעדר רכיבים מרכזיים אחרים בזיהום CF ואספקת תרופות. CFBE41o- קו התא אינו מחזיק cilia וגם לא לייצר ריר, אשר קורה בדרך כלל 20-30 ימים של תרבות התא ב עלי. כפי שזה לא היה המקרה עבור CFBE41o- קו תא, השתמשנו בתאים לאחר שבעה ימים כאשר נוצר מחסום אפיתל הדוק. פינוי Mucociliary משנה את תנאי המגורים עבורחיידקים 24 או חלקיקיסמים 9,25 במודלים חוץית הערכת תצהיר ריאות צריך לקחת את זה בחשבון. שונה ממה שנצפה על ידי תאים אחרים, תרבות הרקמה מוסיפה ציפוי עם חומר מטריצה חוץ תאית (כמו פיברונקטין או קולגן I) אינם מראים הבדל משמעותי עבור CFBE41o- למשלב TEER26. לכן, המסננים הניתרים לא היו מצופים בחומר מטריצה חוץ-תאי בפרוטוקול זה.
עם הפרוטוקול המתואר כאן, מונו ותרבויות מפעולה לאחר 6 h זיהום לספק שחרור ציטוקין מספיק כדי לשמש כמדידה בבדיקות סמים עתידיות. התרבות השיתופת מביאה יתרון של שיתוף פעולה סלולרי במודל תגובה חיסונית. חוסר היעילות של tobramycin בהפחתת דלקת היה צפוי מאז לא כל החיידקים בוטלו במהלך הטיפול(איור 4E, F). אף על פי כן, מידול התגובה tobramycin במודל CF הוא קריטי, כמו tobramycin (בריכוזים גבוהים יותר) יכול להיות יעיל ב P. aeruginosa עיכוב, אפילו על biofilm19,27. אפשרות אחת לשימוש נוסף בפרוטוקול זה היא לשלב תרופות אנטי דלקתיות בטיפול. ההמלצה הכוללת לגבי תגובות דלקתיות תהיה להשתמש בטיפול משך זמן קצר (6 שעות), אשר עדיין יש את התא המארח וחיידקים נוכחים. לאחר נקודת זמן זו, התאים המארחים מושמדים בדגימות לא מטופלות. הן ELISA והן FACS יכול לשמש כדי למדוד את שחרורו של ציטוקינות. לבסוף, אם הדגימות מאוחסנות יותר מ-15 ימים ב--80°C, מומלץ לבדוק את אמינות הציטוקינות באמצעות, למשל, שליטה חיובית בדגימות טריות (למשל תאים מגורה עם LPS).
שינויים מסוימים בפרוטוקול אפשריים. לדוגמה, ניתן להרחיב את הפרוטוקול הנוכחי ליישום של תרופות ערפיליות (שלב 3.6). זה הכרחי כדי מודל משלוח תרופות ריאות באמצעות שאיפת אוראלי. ערפילית של תרופות מסיסות במים, כמו tobramycin, או ננו נשאים שלהם, כגון קוליסטין liposomal, הוא יחסית ישר קדימה על ידי מכשירים זמינים באופן מסחרי בשימוש שגרתי במרפאה. כמו כן, ישנם מספר מכשירים זמינים מבחינה מסחרית להפקדת תרסיסים על תוספות תרבות התא. בנוסף, כפי שהמודל המתואר כאן מבוסס על תמיכות קרום חדיר, זה יכול להיות מאומץ גם כמה מיקרופלואיד עכשווי (למשל "ריאה על שבב") התקנים, למשל, כדי ללמוד את ההשפעה של נשימה ואת המתיחה מכנית הקשורים ושינויים בזרימת האוויר. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות שונה על ידי תוספת של ריר או החלפה על ידי תאים ראשיים בהתאם לשאלה המדעית שיש לטפל. צעד מעניין נוסף הבא יהיה בדיקות של ננו-תרופות, במיוחד כמו ננוטכנולוגיה הוא התקדמות בפיתוח של רומן נגדזיהומים 28, CFמתקנים 29 ומשלוח שותף של אנטיביוטיקה ופתובלוקים30. בסך הכל, הפרוטוקול הנוכחי עשוי להיתפס כמועיל בהערכת הישרדות חיידקים על טיפול אנטיביוטי במערכת מורכבת, יחד עם כמה קראות הקשורות למארח: ציטוקסיות תא, שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג ותגובה דלקתית. אלה הם פרמטרים חיוניים לפיתוח תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו קיבלה מימון מתכנית HORIZON 2020 של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, והדגמה תחת הסכם מענק מס ' 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - עיצוב, ופיתוח של ננו-תרופות מתקדמות כדי להתגבר על מחסומים ביולוגיים ולטייסת במחלות קשות. אנו מודים לד"ר אנה קוסטה וד"ר ג'ני Juntke על התמיכה הגדולה על הפיתוח של התרבות ההפוכת, אולגה הרטוויג, על האיור המדעי, אניה Honecker, עבור ELISA assays, פטרה König, יאנה Westhues וד"ר קיארה דה רוסי על התמיכה בתרבות התא, ניתוח, ומיקרוסקופיה. אנחנו גם מודים לצ'לסי ת'ורן על הגהה של כתב היד שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L.
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
