Summary
Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.
Abstract
f La ricerca antidroga per il trattamento delle infezioni polmonari sta progredendo verso modelli in vitro predittivi di elevata complessità. La presenza multiforme di batteri nei modelli polmonari può riapproizionare la disposizione epiteliale, mentre le cellule immunitarie coordinano una risposta infiammatoria contro i batteri nel microambiente. Mentre i modelli in vivo sono stati la scelta per testare nuovi anti-infettivi nel contesto della fibrosi cistica, non imitano ancora con precisione le condizioni in vivo di tali malattie negli esseri umani e gli esiti del trattamento. Modelli complessi in vitro delle vie aeree infette basate su cellule umane (epiteliali bronchiali e macrofagi) e agenti patogeni rilevanti potrebbero colmare questa lacuna e facilitare la traduzione di nuovi anti-infettivi nella clinica. Per tali scopi, è stato stabilito un modello di co-coltura della linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dei macrofagi derivati dai monociti THP-1, che imitano un'infezione della mucosa bronchiale umana da P. aeruginosa in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questo modello è impostato in sette giorni, e i seguenti parametri sono valutati contemporaneamente: integrità barriera epiteliale, trasmigrazione macrofagi, sopravvivenza batterica, e infiammazione. Il presente protocollo descrive un sistema robusto e riproducibile per valutare l'efficacia dei farmaci e le risposte dell'ospite che potrebbe essere rilevante per scoprire nuovi anti-infettivi e ottimizzare la loro consegna di aerosol ai polmoni.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno rilevante nella fibrosi cistica (CF) che contribuisce al danno del tessutopolmonare 1. La produzione di polisaccharides, come l'alginato e altri esopolidi mucoidi, coordina il progresso della malattia, che porta ad una tenace aderenza batterica, limita la somministrazione di antibiotici ai batteri e protegge i batteri contro il sistema immunitario dell'ospite2. La transizione di P. aeruginosa dallo stadio planctonic alla formazione di biofilm è una questione critica in questo contesto, facilitando anche l'insorgenza della tolleranza antibiotica.
Nel contesto di CF, il mouse è stato utilizzato principalmente come modello. I topi, tuttavia, non sviluppano spontaneamente questa malattia con l'introduzione di mutazioni CF3. La maggior parte dello sviluppo di biofilm batterici e studi di suscettibilità ai farmaci sono stati eseguiti su superfici abiotiche, come i piatti Petri. Tuttavia, questo approccio non rappresenta la complessità in vivo. Ad esempio, sono assenti importanti barriere biologiche, comprese le cellule immunitarie e l'epitelio mucoso. Anche se P. aeruginosa è abbastanza tossico per le cellule epiteliali, alcuni gruppi sono riusciti a co-coltivare un precedente biofilm P. aeruginosa con cellule bronchiali umane. Queste cellule hanno avuto origine da pazienti affetti da fibrosi cistica con mutazione CFTR (CFBE41o- cellule)4 e hanno permesso di valutare l'efficacia antibiotica5 o valutare la correzione della proteina CFTR durante l'infezione6. Tale modello è stato indicato per migliorare la prevedibilità dell'efficacia dei farmaci, oltre a consentire la caratterizzazione dei problemi con i farmaci che non sono riusciti nelle fasi successive dello sviluppo di farmaci7.
Tuttavia, nel polmone, l'epitelio mucoso è esposto all'aria. Inoltre, le cellule immunitarie presenti nelle vie aeree, come i macrofagi tissed, svolgono un ruolo essenziale contro gli agenti patogeni inalati o le particelle8. I macrofagi migrano attraverso i diversi strati cellulari per raggiungere il lume bronchiale e combattere l'infezione. Inoltre, i farmaci inalati devono anche far fronte alla presenza di muco come elemento aggiuntivo non cellulare della barriera polmonare aria-sangue9. Infatti, sono stati sviluppati diversi modelli complessi tridimensionali (3D) in vitro, con l'obiettivo di aumentare la rilevanza in vivo. I sistemi di co-coltura non solo aumentano la complessità dei sistemi in vitro per la scoperta di farmaci, ma consentono anche di studiare le interazioni tra cellule cellulari. Tale complessità è stata affrontata negli studi sulla migrazione dei macrofago10, il rilascio di peptidi antimicrobici da parte dei neutrofili11, il ruolo del muconell'infezione 9e la reazione cellulare epiteliale a dannieccessivi 12. Tuttavia, un modello in vitro affidabile infettato da CF che presenta la mutazione genetica in CF, che è esposto all'aria (maggiore condizione fisiologica), e integra le cellule immunitarie è ancora carente.
Per colmare questa lacuna, descriviamo un protocollo per la co-coltura 3D umana stabile delle vie aeree infette. Il modello è costituito da cellule epiteliali e macrofagi bronchiali CF umani, infettati da P. aeruginosa e in grado di rappresentare sia una barriera diffusionale che immunologica. Con l'obiettivo di testare gli anti-infettivi a un rendimento ragionevolmente elevato, questa co-coltura è stata stabilita sulla membrana filtro permeabile di inserti a piastre ben, utilizzando due linee cellulari umane: CFBE41o- e macrofagi derivati da monociti THP-1. Inoltre, per studiare alla fine la deposizione di anti-infettivi aerosolizzati13, il modello è stato stabilito all'interfaccia aria-liquido (ALI) piuttosto che alle condizioni di trattamento con liquido (LCC).
Come riferiamo qui, questo modello permette di valutare non solo la sopravvivenza batterica su un trattamento antibiotico, ma anche la citotossicità cellulare, l'integrità della barriera epiteliale, la trasmigrazione dei macrophage e le risposte infiammatorie, che sono parametri essenziali per lo sviluppo di farmaci.
Questo protocollo combina due tipi di cellule rilevanti per la terapia dell'inalazione delle vie aeree polmonari: i macrofagi e l'epitelio bronchiale CF. Queste cellule sono semi su lati opposti di inserti di supporto permeabili, permettendo l'esposizione delle cellule all'aria (chiamata condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questa co-coltura delle cellule ospitante viene successivamente infettata da P. aeruginosa. Entrambe le linee cellulari ospitali sono di origine umana: le cellule epiteliali rappresentano l'epitelio bronchiale della fibrosi cistica, con una mutazione sul canale CF (CFBE41o-), e le cellule THP-114 sono una linea cellulare macrofamiga ben caratterizzata. Uno strato epiteliale confluente è prima permesso di formarsi sul lato superiore degli inserti di piastra del pozzo prima che le cellule macrofagi vengono aggiunte al vano opposto. Una volta stabilita la co-cultura in ALI, il sistema viene inoculato con P. aeruginosa sul lato apical. Questo sistema di co-coltura infetto viene quindi utilizzato per valutare l'efficacia di un antibiotico, ad esempio tobramicina. Vengono analizzati i seguenti punti finali: integrità della barriera epiteliale in termini di resistenza elettrica transepithelial (TEER), visualizzazione delle interazioni cellula-cellula-cellula-batterio mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), sopravvivenza batterica mediante conteggio di unità formanti di colonia (CFU), sopravvivenza delle cellule ospite (citotossicità) e rilascio di citochine.
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Protocol
1. Crescita e differenziazione delle cellule negli inserti di supporto permeabili
- Coltivare CFBE41o- in una fiaschetta T75 con 13 mL di mezzo minimo essenziale (MEM) contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS), 1% di amminoacidi non essenziali e glucosio 600 mg/L a 37 gradi centigradi con 5 % di atmosfera di CO2. Aggiungere mezzo fresco alle cellule ogni 2-3 giorni.
- Staccare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza nel pallone con 3 mL di trypsin- acido etilenediaminetetraacetico (EDTA) a 37oC per 15 min. Aggiungere 7 mL di MEM fresco e centrifugare le cellule a 300 x g per 4 min a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatant e aggiungere nuovi 10 mL di MEM mentre si interrompono i grumi pipettando delicatamente su e giù.
- Contare le celle con un contatore cellulare automatizzato o camera emocitometrica. Cellule di semi con una densità di 2 x10 5 celle/bene in piastre a 12 poi con supporti permeabili (dimensioni dei pori di 3 m, vedi Tabella dei materiali).
NOTA: il contatore automatico delle celle determina il numero di cella, la distribuzione delle dimensioni e la vitalità delle celle (vedere Tabella dei materiali). In questo caso potrebbero essere utilizzati supporti permeabili con una dimensione di poro di 0,4 m; tuttavia, i macrofagi, in questa condizione, dovrebbero essere aggiunti direttamente al lato apico, e la loro migrazione transcellulare non sarà valutata in questo caso. - Cellule di semi a condizione liquido-liquido (LLC) aggiungendo 500 l della sospensione cellulare sul lato arroico del supporto permeabile e 1,5 mL di mezzo fresco nel lato basolatero. Quindi incubare le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2, per 72 h.
- Per passare alla coltura aria-liquido interfaccia (ALI), il terzo giorno dopo la semina, rimuovere il mezzo dal lato basolaterale prima, poi dal lato ativo. Per il lato basolaterale, aggiungere 500 L di MEM fresco e cambiare il mezzo ogni secondo giorno fino a quando le cellule formano un monostrato confluente.
NOTA: Per le condizioni utilizzate in questo protocollo, il CFBE41o- le cellule di solito sono confluenti dopo 3-7 giorni in coltura. - Valutare le proprietà della barriera epiteliale il giorno 7 incubando CFBE41o- cellule con 500 sL media cellulare nel lato ape e 1,5 mL nel lato basolaterale per 1 h, a 37 gradi centigradi sotto il 5% DI CO2.
- Misurare le proprietà della barriera tramite resistenza elettrica transepithelial (TEER), con un elettrodo di bacchetta STX2 e un volt-ohmmetro epiteliale; dopo 7 giorni questo è superiore a 300 Ω-cm2.
NOTA: Alla fine, in alcuni inserti a membrana, le cellule hanno basso TEER. Pertanto non vengono utilizzati inserti permeabili con TEER < 300 Ω-cm2.
- Per coltivare le cellule THP-1, coltivarle in una fiaschetta T75 utilizzando 13 mL del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media integrata con 10% FCS, e incubare a 37oC sotto 5% CO2. Dividere le celle ogni secondo giorno seminando 2 x 10celle/mL in un nuovo pallone T75.
NOTA: Le cellule THP-1 non differenziate vengono coltivate come monociti in sospensione.- Differenziare le cellule THP-1 come segue. Contenuto centrifuga di un T75 a 300 x g per 4 min. Scartare il supernatant, risundere il pellet in mezzo fresco e mettere in un nuovo T75. Aggiungere 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) incubatig le cellule in RPMI per 48 h a 37 gradi centigradi e 5% DI CO2 atmosfera 15.
NOTA: Dopo la differenziazione con PMA, le cellule non proliferano più e si attaccano al pallone. - Per staccare le cellule simili a macrofagi THP-1, lavare una volta con la salina tamponata di fosfati (PBS) a 37 gradi centigradi e incubare con 3 mL di soluzione di distacco cellulare (ad esempio accutase) contenente 0,5 mM EDTA per 10 min a temperatura ambiente.
- Ispezionare le cellule al microscopio invertito per cercare il distacco delle cellule. Aggiungere 7 mL di mezzo fresco e centrifuga a 300 x g per 4 min a RT.
NOTA: I macrofagi possono anche essere staccati con trypsin-EDTA, 37 gradi centigradi per 20 min. Tuttavia, la trypsina è più dura per i macrofagi rispetto alla soluzione di distacco delle celle scelta (vedere Tabella dei materiali). - Dopo aver rimosso le celle macrofacie di 3 mL di THP-1 in un tubo conico da 15 mL, contare le celle come descritto al punto 1.1.2. e incubare per un massimo di 1 h a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 prima di creare la co-cultura.
NOTA: le celle THP-1 in sospensione possono essere macchiate con coloranti vivibilità per immaginiare ulteriormente la co-coltura. In questo passaggio, utilizzare la procedura seguente (passaggio 1.2.5). - Macrofagi di macchie con 10 M di un colorante di vitalità cellulare (basato sulla conversione di moieties di acetato da parte di esterases intracellulari, vedi Tabella dei materiali) in cui viene applicato 3 ìL del colorante di vitalità cellulare alla sospensione cellulare. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 gradi centigradi, 5% CO2,quindi lavare 1x con PBS 37oC per rimuovere il colorante.
NOTA: Centrifugare le cellule per rimuovere il colorante a 300 x g per 4 min a temperatura ambiente (RT).
- Differenziare le cellule THP-1 come segue. Contenuto centrifuga di un T75 a 300 x g per 4 min. Scartare il supernatant, risundere il pellet in mezzo fresco e mettere in un nuovo T75. Aggiungere 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) incubatig le cellule in RPMI per 48 h a 37 gradi centigradi e 5% DI CO2 atmosfera 15.
2. Creazione di una co-cultura epiteliale-macrofamiù su supporti permeabili
- Utilizzare CFBE41o- monostrati in ALI con TEER 300 Ω-cm2 (passaggio 1.1.6.). Rimuovere il mezzo dalla camera inferiore, invertire con attenzione il supporto all'interno di un piatto Petri vetro sterile (50 mm x 200 mm) e rimuovere le cellule ricoperte attraverso i pori di membrana sul lato inferiore della membrana utilizzando un raschietto cellulare.
NOTA: A causa delle dimensioni dei pori di 3 m, le cellule epiteliali tendono a crescere attraverso i pori verso il lato basolatero. Pertanto, è necessario rimuoverli prima di aggiungere i macrofagi su questo lato. CFBE41o- Le cellule epiteliali polmonari possono essere macchiate in questa fase. La procedura di cui al punto 1.2.5 può essere utilizzata; tuttavia, invece di una sospensione cellulare, viene applicata la soluzione di colorante in MEM (solo lato ape 500 L) sulle cellule aderenti sul supporto permeabile. - Utilizzare 2 x 105 celle/pozzo (in 200 L di RPMI) dalla sospensione cellulare dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e posizionare le celle sul lato basolaterale degli inserti invertiti.
- Chiudere con cura i piatti Petri e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
- Rimimolate gli inserti nelle microplacchi da 12 pozzetti e aggiungete 500 L di mezzo MEM nel lato basolaterale dell'inserto permeabile per mantenere le condizioni DI ALI. Le cellule sono ora pronte per l'infezione.
3. Infezione da P. aeruginosa
NOTA: Tutti i seguenti passaggi da qui devono essere eseguiti in un laboratorio di biosafetà di livello 2 (BSL2).
- Inoculare 15 mL di brodo di lniogene (LB) integrato con ampicillina da 300 g/mL in una fiaschetta di Erlenmeyer (50 mL) con una singola colonia di P. aeruginosa PAO1-GFP.
NOTA: Altri ceppi di P. aeruginosa potrebbero essere utilizzati anche qui, ad esempio, paO1 wild type, PA14, o ceppi clinici, seguendo i propri protocolli di coltivazione. - Incubare i batteri per 18 h a 37 gradi centigradi, agitando a 180 giri/min.
- Trasferire il contenuto dopo il tubo conico da 18 h in un tubo conico da 50 mL e la centrifuga a 3850 x g per 5 min. Scartare il supernatant e aggiungere 10 mL di PBS sterile a 37 gradi centigradi.
- Misurare la densità ottica su uno spettrofotometro a lunghezza d'onda 600 nm e regolare la concentrazione dei batteri utilizzando il mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale di 2 x 105 CFU/mL. Ciò corrisponde a una molteplicità di infezione (MOI) di un batterio per cellula epiteliale.
- Aggiungere 100 L di sospensione batterica al lato aparico del supporto permeabile (passo 2.4.) e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 1 h, per consentire l'attaccamento dei batteri alle cellule. Quindi, rimuovere il liquido a caldo con attenzione con una pipetta per ripristinare le condizioni ALI. Mantenere alcuni campioni non infetti come controllo.
NOTA: In questa fase, i batteri attaccati devono essere placcati in Agar LB (vedi punti 5.4/5.5) per determinare l'inoculo iniziale dei batteri. - Incubare il farmaco di interesse dopo l'adesione batterica nelle cellule. Per gli esperimenti di trattamento, aggiungere 500 L di una soluzione farmacologica diluita nel mezzo cellulare (in questo protocollo è stato utilizzato il 6 g/mL) al lato apico. Aggiungere 1.500 L di mezzo cellulare senza farmaco sul lato basolatero.
NOTA: Invece di instillare i farmaci come soluzione, il modello può anche essere adattato alla deposizione di aerosol. Per tali scopi, le cellule di ALI sono alimentate dal lato basolaterale con 500 L di mezzo cellulare. Il farmaco viene quindi prima nebulizzato e permesso di depositarsi nel compartimento ape da un dispositivo appropriato (non descritto qui). Il campione infetto e trattato può essere controllato per gli endpoint descritti nelle sezioni 4-7. Da questo passaggio in poi, i supporti permeabili possono essere utilizzati per creare immagini (sezione 4) o per ottenere risultati di crescita batterica e vitalità cellulare dei mammiferi, tra gli altri (sezioni 5–7).
4. Preparazione del campione per la microscopia a scansione laser confocale (CLSM)
- Dopo l'istituzione della co-cultura, infezione e trattamento farmacologico, rimuovere tutti i mezzi dal lato apico e basolaterale. Lavare 1x con PBS a 37 gradi centigradi e quindi fissare le cellule con 3% di paraformaldeide (PFA) per 1 h a RT (300 l su apical/600 l su basolateral). I nuclei cellulari sono macchiati con 5 g/mL di DAPI-PBS per 30 min a temperatura ambiente.
CAUTION: PFA è pericoloso. - Tagliare le membrane utilizzando un bisturi e posizionarle tra due vetrini di copertura in microscopia da 12 mm utilizzando un mezzo di montaggio (vedi Tabella dei materiali). Lasciare asciugare all'interno del banco di flusso per 30 minuti prima dello stoccaggio a 4 gradi centigradi. Visualizza mediante microscopia a scansione confocale.
NOTA: Dopo la co-coltura e prima del montaggio, è possibile eseguire l'immunosostenimento delle giunzioni strette. Per questo, le cellule sono fissate con paraformaldeide 3% per 30 min, lavate di nuovo con PBS, e permeabili con saponin 0.05%/BSA 1% in PBS. In questo protocollo, la proteina zonula occludens (O-1) è stata rilevata tramite anticorpo anti-umano del topo (1:400, incubazione a 4 gradi centigradi durante la notte). I campioni sono stati poi incubati per 2 h a RT con anti-topo capra IgG anticorpo Alexa Fluor 633 (1:2000 in rosso). I nuclei sono stati macchiati con DAPI (1 g/mL) e montati con mezzo di montaggio su coperture. - Utilizzare un microscopio confocale per l'imaging delle membrane immagazzinate. Scegliere obiettivi di immersione in acqua 25x o 63x e laser a 405, 488, 505 o 633 nm per il rilevamento. Le immagini devono avere una risoluzione di 1024 x 1024 pixel.
NOTA: I laser vengono scelti in base alla macchia utilizzata. - Acquisire viste apical e trasversali e utilizzare la modalità zeta-stack (10-15 pile) per la costruzione di un modello tridimensionale utilizzando un software di imaging.
5. Misurazione della proliferazione batterica tramite unità di formazione colonia (CFU)
- Raccogliere il mezzo aturico e basolaterale (contenente batteri) per valutare la CFU dei batteri non attaccati. Raccogliere 500 L dai lati atici e basolateral e metterli in comune.
NOTA: Utilizzare questa sospensione direttamente per contare i batteri (passaggio 5.4) o centrifuga a 21.250 x g per 10 min per valutare la diidrogenasi latta (LDH) dal supernatante (sezione 6) e/o ri-sospesa in PBS per contare i batteri extracellulari (passaggio 5.4). - Valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati e/o internalizzati nelle cellule aggiungendo 500 L di acqua fredda sterile deionizzata in ogni compartimento del supporto permeabile. Incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: I campioni possono essere placcati su Agar LB (c'è il punto 5.4) o congelati (come piastra di inserto intero) a -20 gradi centigradi per placcatura in seguito. - Per valutare il CFU dei batteri aderenti/internalizzati, scongelare i campioni a 37oC per 10 min (se congelati). Utilizzando le punte di pipetta per ogni pozzo, raschiare la superficie della membrana e pipetta su e giù per rimuovere tutto il contenuto aderente.
NOTA: In questa fase, tutte le cellule epiteliali sono lizzate e i batteri aderenti/internalizzati sono disponibili come sospensione da placcare. - Con le sospensioni batteriche di entrambe le frazioni, eseguire una diluizione seriale 1/10 utilizzando Tween-80 0,05% in PBS e placcare i batteri sulle piastre di agar LB.
NOTA: Si consiglia di diluizioni tra 1 e 10. I batteri devono essere conteggiati nella diluizione più alta, dove le singole colonie vengono identificate per la prima volta. - Incubare le piastre di agar a 30oC per 16-72 h per contare le colonie, e calcolare CFU di conseguenza.
NOTA: Una temperatura di 30oC al momento dell'incubazione delle placche è essenziale per i campioni trattati e per osservare la crescita ritardata delle colonie.
6. Valutazione della citotossicità cellulare tramite analisi disidrogenasi del lattato
- Utilizzare il supernatant di cellule infette contenenti batteri (dal punto 5.1) per la valutazione della vitalità cellulare per il saggio LDH16. Centrifugare il supernatant a 21.250 x g per 10 min per pellet i batteri e, infine, il resto delle cellule. Utilizzare il supernatant senza batteri per misurare il rilascio di LDH.
NOTA: Il supernatanto non deve essere congelato prima di misurare LDH con questo saggio. - Trasferire 100 L del supernante in una piastra da 96 potes gradi e aggiungere 100 L della soluzione di saggio LDH (vedere la Tabella dei Materiali). Incubare a temperatura ambiente per 5 min al buio, quindi leggere l'assorbimento a 492 nm.
7. Valutazione del rilascio di citochine umane
- Per la quantificazione delle citochine, utilizzare ELISA o la matrice di perline citometriche immunoassay17(vedere la Tabella dei Materiali). Per questo, centrifugare supernatant dal passo 5.1 a 21.250 x g per 10 min e misurare immediatamente o conservare -80 gradi centigradi per un massimo di 15 giorni fino all'analisi.
- Valuta i supernatanti con un kit ELISA disponibile in modo commerciale.
NOTA: La procedura segue le istruzioni di fabbricazione, che includono il rivestimento di piastre con l'anticorpo di cattura, l'aggiunta dei campioni (100 L) e gli standard di citochina, l'incubazione, il lavaggio e l'aggiunta di anticorpi di rilevamento per fornire una misurazione colorimetrica della presenza di citochine. In alternativa, la citometria di flusso può essere utilizzata per misurare le citochine tramite kit disponibili in mercato (vedi Tabella dei materiali).
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Representative Results
La figura 1A mostra la morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi dopo essere cresciuta sia per 24 h sul lato apicale che basolaterale dei supporti permeabili, rispettivamente. L'integrità della barriera epiteliale è dimostrata da TEER più alto (834 Ω-cm2) e CLSM da immunostaining per la proteina di giunzione stretta O-1 (Figura 1B). Gli stessi risultati osservati in termini di integrità barriera di CFBE41o non infetta- monocultura potrebbe essere visto nelle co-culture epiteliali-macrofagine non infetto.
Per modellare un'infezione batterica, P. aeruginosa è stato inoculato ad una molteplicità di infezione (MOI) di 1:1 su CFBE41o- cellule. Sei ore dopo l'infezione (Figura 2A), i macrofagi sono stati osservati sul lato apico della co-coltura. Dopo l'infezione, il TEER è sceso da 834 a 250 Ω-cm2, indicando una barriera epiteliale compromessa, come anche visualizzato dalla colorazione di O-1 (Figura 2B).
La figura 3 mostra la trasmigrazione dei macrofago attraverso i pori e i batteri permeabili della membrana da parte delle cellule THP-1 sul lato apico. I campioni sono stati fissati a 1, 3 e 6 h dopo l'incubazione da esperimenti indipendenti. Nelle monoculture THP-1 (Figura 3A–C), la migrazione dei macrofagi è stata osservata già 1 h, mentre nella co-cultura (Figura 3D–F), questo è stato visto dopo 3 h infezione. L'assorbimento di batteri in THP-1 è stato osservato dopo 3 h di infezione, sia nella monocultura che nella co-coltura. Non si poteva vedere alcun assorbimento batterico da parte di CFBE41o- Le viste trasversali sono state posizionate in modo tale che il supporto permeabile della membrana fosse al centro come una separazione del compartimento apico e basolaterale.
La figura 4 mostra le immagini di microscopia laser a scansione confocale di co-colture infette (CFBE41o- THP-1) trattate con o senza tobramicina per 6 h (Figura 4A, B) o 20 h ( Figura4C,D). Senza trattamento, sia le cellule epiteliali che i macrofagi sono morti dopo 20 h di infezione(Figura 4C). Tuttavia, dopo il trattamento con tobramicina, le cellule ospitanti vengono conservate dopo 20 h; ancora, alcuni batteri possono essere osservati nella coltura. Nonostante siano stati osservati dopo 6 h di trattamento nelle immagini di microscopia (Figura 4B), i batteri non proliferano come osservato nei saggi CFU in Figura 4E. Tuttavia, dopo il trattamento di 20 h, i batteri hanno recuperato la capacità di proliferazione, come visto dalle colonie nel saggio CFU (Figura 4F). Il protocollo di lisis cellulare con acqua fredda e raschiare può rilasciare batteri attaccati ed eventualmente internalizzati nelle cellule. Allo stesso tempo, le celle vengono distrutte (Figura supplementare S1A, B). Le fasi di centrifugazione utilizzate in questo documento per le cellule epiteliali (300 x g) o batteri (21.250 x g) non hanno ostacolato la vitalità di entrambi (Supplementary Figures S1C, D). Tutti i test della CFU sono stati eseguiti congelando i campioni a -20oC, seguiti da scongelamento e placcatura. Questa procedura ha ridotto il numero di batteri di 2-log, rispetto ai campioni freschi (Figura supplementare S1E). Poiché questa procedura viene eseguita simultaneamente per tutti i gruppi sperimentali (trattati e non trattati) in punti di tempo diversi, tale riduzione sarà incorporata nei risultati finali (Figura supplementare S1E). Inoltre, la concentrazione di tobramicina qui utilizzata non ha mostrato tossicità per le cellule non infettate (Figura supplementare S2A) e anche nessuna ulteriore risposta infiammatoria (Figura supplementare S2B). Tuttavia, era all'interno della gamma della concentrazione inibitoria minima per uccidere P. aeruginosa.
La figura 5 mostra la resistenza elettrica transepithelial (TEER) e la vitalità cellulare. La figura 5A–B illustra il TEER delle monoculture e delle co-culture. La co-coltura di CFBE41o- cellule con THP-1 non ha indotto alcun cambiamento nell'integrità della barriera epiteliale rispetto alla monocoltura (barre rosse). Al momento dell'infezione, il valore TEER è sceso (barra verde). Dopo 1 h di infezione, alcuni campioni sono stati trattati con l'antibiotico tobramicina (barra blu), per 6 o 20 h. Il trattamento ha preservato l'integrità della barriera epiteliale, come osservato dal TEER superiore. La figura 5C mostra la percentuale di rilascio di LDH come indicazione della tossicità cellulare dopo l'infezione e il trattamento della tobramicina dopo 6 h. La co-coltura stessa ha indotto un rilascio di LDH, che era lo stesso per le cellule infette (circa il 20%). Dopo 20 h di infezione, non è stato possibile rilevare alcun segnale di LDH. Per dimostrare l'affidabilità LDH per l'infezione a lungo termine, PAO1-GFP è stato incubato in media con e senza LDH 1 U/mL rispetto ai rispettivi controlli non infetti (Figura supplementare S2C). Il segnale LDH è stato perso dopo un'incubazione prolungata (20 h) con P. aeruginosa, indicando che LDH è stabile solo in tempi di incubazione più brevi nelle colture infette.
La figura 6 mostra la cinetica delle citochine pro-infiammatorie rilevate tramite ELISA. Il vantaggio di una co-coltura infetta di cellule CFBE41o e THP-1 è stato osservato con le secrezioni superiori di citochine pro-infiammatorie. La secrezione di alcune citochine pro-infiammatorie era simile (IL-6) o superiore (IL-8, TNF- , IL-1β) nella co-coltura infetta (Figura 6C) che nelle corrispondenti monoculture (Figura 6A-B). Inaspettatamente, alcune citochine nelle monocolture THP-1 (Figura 6B) sono downregulated in campioni infetti (Il-8, TNF, IL-1β).
La figura 7 mostra il rilascio di citochine in mono e co-culture dopo l'infezione e il trattamento con tobramicina misurata tramite la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). La secrezione della citochina pro-infiammatoria IL-8 (Figura 7A) e della citochina antinfiammatoria IL-10 (Figura 7F) era più alta nelle co-culture delle cellule epiteliali e dei macrofagi, rispetto alle monocolture. Tuttavia, per tutte le altre citochine (IL-1, IL-12p40, IL-23 e GM-CSF)(figure 7B-E),i livelli di secrezione di citochina non erano più alti nella co-cultura che nelle rispettive monoculture.
Figura 1: sezioni trasversali e viste apiche della co-cultura epiteliale-macrofago non infetta. (A) Viste incrociate di co-cultura epiteliale-macrofagio non infetta. CFBE41o- rosso macchiato, macrofagi THP-1 in giallo e nuclei in blu (DAPI). (B) Viste apiche del CFBE41o non infetto- monostrato immuno-macchiato per zo-1 (rosso). DAPI: nuclei. Barre di scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sezioni trasversali e viste apiche della co-cultura epiteliale-macrofago infetta. (A) Viste incrociate e (B) vista apicale della co-coltura epiteliale-macrofago a 6 h post-infezione (hpi) con P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- macchiato di rosso, macrofagi THP-1 in giallo, nuclei in blu (DAPI) e P. aeruginosa PAO1-GFP in verde. (B) Viste apiche del 6 h infetto CFBE41o- monostrato. Barre di scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cinetica della trasmigrazione dei macrofai e dell'assorbimento dei batteri visualizzata dalla sezione trasversale del modello 3D. Cinetica dell'infezione PAO1-GFP nelle monoculture dei macrofagi THP-1 (A-C) o co-cultura (D-F). I macrofagi THP-1 sono macchiati di rosso, nuclei di cellule epiteliali in blu (DAPI) e P. aeruginosa in verde (GFP). Ogni figura è divisa in lati apici e basolaterali, lo spazio in mezzo è considerato la membrana, che è vuotao occupata dallo strato confluente CFBE41o (D-F). Gli inserti nelle figure mostrano l'assorbimento dei batteri da parte dei macrofagi in momenti diversi (A-F). Barre di scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione della sopravvivenza PAO1-GFP in micrografieconfocali trattate con tobramycin e. (A-D) co-culture con e senza trattamento. (A) Co-coltura non trattata dopo 6 h di infezione. (B) Co-coltura infetta trattata con tobramicina 6 g/mL (Tob) per 6 h. (C) co-cultura non trattata 20 h dopo l'infezione, (D) con coltura infetta trattata con tobramicina 6 g/mL per 20 h. Nuclei macchiati con DAPI (blu), macrofagi (rosso) e P. aeruginosa GFP (verde). (E) Unità di formazione della colonia (CFU) di batteri aderenti/internalizzati dopo 6 e (F) 20 h con trattamento tobramicina 6 g/mL. L'inserto a membrana vuoto è stato utilizzato come substrato abiotico per far crescere PAO1-GFP. È stata utilizzata ANOVA a due metodi con il test di confronto multiplo di Tukey (nessuna colonie), è stato utilizzato il valore di "p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001; ns: non significativo. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n - 9–27 replica di 3-9 esperimenti indipendenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Integrità e valutazione delle barriere della fattibilità della monocultura e della co-cultura. Sono state valutate le seguenti condizioni di co-coltura: non infetta (barre grigie), infetta (barre verdi) o infettata e trattata con tobramicina (barre blu). (A) Resistenza elettrica transepithelial dopo 6 h e (B) 20 h di infezione in mono-culture (CFBE41o- e THP-1) e co-cultura. (C) Citotossicità di mono- e co-coltura misurata tramite LDH rilascio 6 h post-infezione. È stato utilizzato ANOVA a due metodi con il test di confronto multiplo di Tukey; < 0,05; p < 0.0001; ns: non significativo. Le barre di errore indicano la deviazione standard; n - 9 repliche di tre esperimenti indipendenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cinetica del rilascio di citochine di supernatanti mono e co-coltura non infetti e infetti valutati tramite ELISA. ELISA è stato fatto secondo il protocollo del produttore del kit. (A) CFBE41o-, (B) THP-1 e (C) co-impostazioni cultura rilasciando IL-8, TNF-z, IL-1β e IL-6. Le barre di errore indicano la deviazione standard. n - 6 repliche di 2 esperimenti indipendenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risultati supernatant del pannello di citochine misurato tramite FACS con e senza tobramicina 6 g/mL per 6 h post-infezione. Supernatanti di mono-coltura e co-coltura dopo 6 h post-infezione utilizzati per analizzare le rispettive citochine IL-8 (A), IL-1 (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) e IL-10 (F). La barra di errore indica la deviazione standard, n - 9 repliche di 3 esperimenti indipendenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: esperimenti di controllo per i passaggi critici del protocollo. (A, B) Micrografie di cellule CFBE41o in piastre a 24-pozzo coltivate per 2 giorni a densità di 2 x 105 cellule/pozzo. (A) CFBE41o- cellule in PBS per 30 min, e (B) cellule trattate con acqua dopo 30 min dopo la raschiazione con una pipetta. (C) Vitalità delle cellule dei mammiferi dopo la centrifugazione. Le cellule CFBE41o sono state rimosse dal fiaschetto di coltura cellulare T75 come descritto nei punti 1.1.1 e 1.1.2. In una soluzione isotonica da 10 mL è stato analizzato 10 L di sospensione cellulare. Per valutare la fattibilità di singole celle è stato utilizzato un contatore automatico delle cellule. Poi, le rispettive sospensioni cellulari sono state centrifugate a 300 x g per 4 min, ri-sospese e contate di nuovo. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n - 6 diversi flaconi di 2 singoli esperimenti. (D) Vitalità di PAO1-GFP dopo la centrifugazione. I batteri PAO1-GFP sono stati diluiti in OD - 0,01 nel mezzo cellulare. La CFU è stata valutata attraverso una fila di diluizione di 10 volte e le piastre LB incubate durante la notte a 30 gradi centigradi. I rispettivi tubi di plastica sono stati centrifugati a 21.250 x g per 10 min e ri-sospesi in media. La CFU è stata nuovamente valutata di conseguenza. Test t dello studente a due code, p < 0.033. La barra di errore indica la deviazione standard, n - 6 di 2 esperimenti. (E) Vitalità dei batteri dopo il congelamento. I batteri PAO1-GFP sono stati preparati come in (D) e CFU è stato analizzato, poi i tubi di plastica sono stati congelati per un giorno a -20 gradi centigradi e scongelati per valutare nuovamente CFU. Test t dello studente a due code, p < 0.001. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n - 6 di due esperimenti. Si prega di fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Esperimenti di controllo per valutare il comportamento E l'influenza di LDH di tobramicina. (A) Esperimento di controllo per valutare la citotossicità dopo 20 h di incubazione con 6 tobramicina da 2 g/mL. Il mono e la co-coltura sono stati fatti come descritto nel protocollo, ma le cellule sono state coltivate per 2 giorni su piastre di 24 po 'e le cellule THP-1 sono state semitecamente. Le cellule con 6 tobramicina o controlli sono state incubate per 20 h. ANOVA unisci unite, test di confronto multipli di Tukey, p < 0.001. La barra di errore indica la deviazione standard, n - 6 di 2 esperimenti (CFBE41o-), n - 3 di un esperimento (THP-1 e co-cultura). (B) Controllo-ELISA di supernatanti di mono-coltura e co-cultura con/senza tobramicina. La coltura cellulare è stata fatta secondo (A) per non mostrare alcun rilascio di citochine rispetto ai controlli per tutte le condizioni. ELISA è stato fatto nei punti 7.1 e 7.2, 10 g/mL (LPS) è stato aggiunto come controllo, il rilascio IL-8 per i controlli trattati con LPS contenente THP-1 era superiore a quello rilevabile. ANOVA a due modi, test di confronto multiplo di Tukey, ns p > 0.12; p < 0.033; p < 0.001. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n - 6 di due esperimenti, n e 3 di un esperimento (controllo LPS). (C) Degradazione LDH a causa di un'eccessiva proliferazione PAO1-GFP. LDH è stato aggiunto alla concentrazione di 1 U/mL al media MEM. Il mezzo LDH o il supporto di controllo è stato utilizzato per diluire le cellule in OD - 0,01 (corrisponde a 1 x10 8 CFU/mL) e poi incubato per 20 h. LDH è stato fatto come descritto nella sezione 6. ANOVA unisci unizioni, test di confronto multipli di Tukey, ns p > 0.12; p < 0.001. La barra di errore indica la deviazione standard, n - 8-9 di tre singoli esperimenti. Si prega di fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo documento descrive un protocollo per una co-coltura 3D delle vie aeree infette, costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dalla linea cellulare macrofamizza derivata dal monocito umano THP-1. Il protocollo consente la valutazione dell'integrità della barriera epiteliale, della trasmigrazione dei macrofagio, della sopravvivenza dei batteri e dell'infiammazione, che sono parametri importanti quando si testano l'efficacia dei farmaci e le risposte dell'ospite contemporaneamente. La novità nel modello risiede nell'incorporazione di cellule epiteliali (cioè linea cellulare CF umana e macrofagi) con infezione batterica acuta (cioè P. aeruginosa). L'infezione acuta nelle cellule epiteliali è dimostrata essere controllata da un antibiotico (cioè tobramicina). Oltre all'uso di una linea cellulare CF umana, l'intero modello è impostato in condizioni ALI, che è notevolmente più vicino alle condizioni fisiologiche in CF. L'uso di una linea cellulare CF implementa alcune delle caratteristiche della malattia nel modello. La mutazione del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) è direttamente correlata alla disregolazione del trasporto di fluidi epiteliali nei polmoni. Inoltre, le mutazioni nel gene CF, come il F508, provocano muco denso, con infiammazione e gravi danni polmonari dopo l'infezione con P. aeruginosa4. Queste manifestazioni patologiche causate da CFTR disfunzionale comportano potenzialmente la compromissione dell'autofagia come un importante meccanismo cellulare associato alla patogenesi della malattia polmonare CF18. Tuttavia, il CFBE41o- non riescono a muco segreto, che è una limitazione di questa linea cellulare. Se è destinato a studiare il ruolo del muco più specificamente, il protocollo può essere adattato utilizzando altre linee cellulari bronchiali (ad esempio, Calu-3).
Un passo fondamentale per impostare questo protocollo è la combinazione di cellule epiteliali e immunitarie e la successiva infezione da P. aeruginosa all'ALI. L'infezione di CFBE41o- da P. aeruginosa in vitro è già stata descritta, principalmente utilizzando una camera a cellule di flusso, integrata con arginina nei media di coltura, per migliorare la sopravvivenza delle cellule epiteliali e sostenere la formazione di biofilm19. L'attuale protocollo mirava a un nuovo modello che utilizzava solo cellule umane, che inoltre potevano essere coltivate ad ALI su inserti permeabili per una maggiore produttività del campione. L'inclusione di macrofagi differenziati THP-1 come linea cellulare immortalata umana, invece di dipendere dall'ottenimento di cellule primarie riproducibili dai donatori, è un altro vantaggio del nostro modello. Aggiungendo questi macrofagi al lato basolatero del supporto della membrana permeabile, è stato osservato che i macrofagi sporgevano e infine tramavano al lato apico della barriera epiteliale coltivata a filtro. Una variazione di questo protocollo potrebbe essere l'aggiunta di macrofagi direttamente sul lato apical sulla parte superiore delle cellule epiteliali, come descritto da Kletting et al. 14. La co-coltura delle cellule immunitarie e polmonari non umane è già stata descritta in precedenza. Ding et al. 10 cellule di carcinoma polmonare di topo Lewis usato su supporti di inserto permeabili in combinazione con macrofagi sul lato basolatero e infettati da S. aureus, un altro patogeno critico di infezione cronica nei pazienti affetti da CF. Tuttavia, in questo studio, non c'era alcuna attenzione sulla fibrosi cistica o di utilizzare la co-coltura come piattaforma per la valutazione dell'efficacia del farmaco. Il nostro protocollo può essere adattato per altre infezioni batteriche, come Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, o Burkholderia cepacia- importanti patogeni nel polmone CF.
Un altro passo critico è l'aggiunta di macrofagi THP-1 alle celle capovolgendo gli inserti permeabili capovolti (sezione 2). Questo è fondamentale per valutare la trasmigrazione del macrofagio attraverso il pozzo al lato dell'infezione. Il processo di imaging successivo dai modelli 3D con stack z e vista in sezione trasversale può essere eseguito per osservare l'interno dei macrofagi e rilevare l'assorbimento dei batteri (Figura 3). A 1 hpi, i batteri applicati sul lato apoco migrano attraverso la membrana, mentre la migrazione e l'assorbimento dei macrofago avviene solo a 3 hpi. Pertanto, dopo 1 h di infezione, è stato opportuno iniziare il trattamento con tobramicina e avere la possibilità di affrontare sia la sopravvivenza delle cellule ospitanti che dei batteri per un lungo periodo (20 h). Nel corso del protocollo, il mantenimento della sterilità è un problema critico a causa della moltitudine di passi che ciascuno porta il rischio di contaminazione. Tuttavia, personale esperto di coltura cellulare sarà in grado di seguire questo protocollo dopo un'adeguata preparazione e formazione. Il mezzo cellulare deve essere regolarmente controllato per la contaminazione, preferibilmente dopo tutte le fasi critiche.
Come con qualsiasi modello, la co-coltura infetta ha anche alcune limitazioni; ad esempio, l'integrazione delle cellule simili a macrofaie. Qui, era importante avere macrofagi sul lato basolatero; tuttavia, la manipolazione dell'inserto con uno strato epiteliale precedentemente coltivato può aver fornito danni precocosi e disturbi alla co-coltura. Anche se, il modello di supporto permeabile ha fornito caratteristiche ad alta velocità di trasmissione, che non è stato osservato nelle precedenti co-culture del polmone infetto CF20,21. Con questo, ulteriori esperimenti devono valutare i limiti dell'utilizzo di THP-1 come sostituto del macrofamo. Mentre questa linea cellulare è ampiamente utilizzata, è meno reattiva a LPS22 e manca di attivazione completa e l'intera popolazione non è differenziata dai monociti alle celle simili a macrofachi23. Un'altra limitazione è la mancanza di altri componenti chiave nell'infezione da CF e nella consegna di farmaci. La linea cfBE41o- cellulare non possiede ciglia né produce muco, che di solito accade 20-30 giorni di coltura cellulare all'ALI. Poiché questo non era il caso di CFBE41o- linea cellulare, abbiamo usato le cellule dopo sette giorni quando si è formata una stretta barriera epiteliale. Lo sdoganamento mucociliario altera le condizioni di residenza per i microbi24 o le particelle di droga9,25 e i modelli in vitro che valutano la deposizione polmonare dovrebbero tenere conto di questo. A differenza di quanto osservato da altre cellule, la coltura tissunte inserisce il rivestimento con un materiale a matrice extracellulare (come fibronectina o collagene I) non mostrano una differenza significativa per CFBE41o-, ad esempio in TEER26. Pertanto, i filtri permeabili non sono stati rivestiti con un materiale a matrice extracellulare in questo protocollo.
Con il protocollo qui descritto, mono e co-culture dopo 6 h infezione forniscono sufficiente rilascio di citochina da utilizzare come misura in futuri test farmacologici. La co-cultura porta un vantaggio della cooperazione cellulare nella modellazione della risposta immunitaria. L'inefficacia della tobramicina nel ridurre l'infiammazione era prevista poiché non tutti i batteri sono stati eliminati durante il trattamento (Figura 4E, F). Tuttavia, modellare la risposta alla tobramicina in un modello CF è fondamentale, in quanto la tobramicina (in concentrazioni più elevate) può essere efficace in inibizione P. aeruginosa, anche su biofilm19,27. Una possibilità per un ulteriore uso di questo protocollo è quello di integrare farmaci antinfiammatori nel trattamento. La raccomandazione generale per quanto riguarda le risposte infiammatorie sarebbe di utilizzare il trattamento di breve durata (6 h), che ha ancora la cellula ospite e batteri presenti. Dopo questo punto di tempo, le cellule host vengono distrutte in campioni non trattati. Sia ELISA che FACS potrebbero essere utilizzati per misurare il rilascio di citochine. Infine, se i campioni vengono conservati più di 15 giorni a -80 gradi centigradi, si raccomanda di verificare l'affidabilità delle citochine utilizzando, ad esempio, il controllo positivo di campioni freschi (ad esempio le cellule stimolate con LPS).
Alcune modifiche del protocollo sono possibili. Ad esempio, il protocollo corrente può essere esteso all'applicazione di farmaci nebulizzati (passaggio 3.6). Ciò è necessario per modellare la consegna di farmaci polmonari tramite inalazione orale. La nebulizzazione di farmaci solubili in acqua, come la tobramicina, o i suoi nano-portatori, come la colistina liposomica, è relativamente semplice da dispositivi disponibili in commercio regolarmente utilizzati nella clinica. Inoltre, ci sono diversi dispositivi disponibili in mercato per depositare aerosol su inserti di coltura cellulare. Inoltre, poiché il modello qui descritto si basa su supporti per membrana permeabili, potrebbe anche essere adottato per alcuni dispositivi microfluidici contemporanei (ad esempio "polmone su un chip", ad esempio, per studiare l'influenza della respirazione e il relativo stiramento meccanico e i cambiamenti nel flusso d'aria. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere modificato mediante l'aggiunta di muco o la sostituzione da parte di cellule primarie a seconda della questione scientifica da affrontare. Un altro passo successivo interessante sarebbe il test delle nanomedicine, soprattutto perché la nanotecnologia sta facendo progressi nello sviluppo di nuovi anti-infettivi28, i correttori CF29 e la co-consegna di antibiotici e pathoblocker30. Nel complesso, l'attuale protocollo può essere percepito come utile per valutare la sopravvivenza batterica dopo il trattamento antibiotico in un sistema complesso, insieme ad alcune leggi relative all'ospite: citotossicità cellulare, integrità della barriera epiteliale, trasmigrazione macrofago e risposta infiammatoria. Questi sono parametri essenziali per lo sviluppo di farmaci.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal programma HORI-2020 dell'Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Progettazione e sviluppo di nanomedicine avanzate per superare le barriere biologiche e per il trattamento di gravi malattie. Ringraziamo la Dott.ssa Ana Costa e la Dott.ssa Jenny Juntke per il grande sostegno allo sviluppo della co-cultura, Olga Hartwig, per l'illustrazione scientifica, Anja Honecker, per i saggi ELISA, Petra Kànig, Jana Westhues e la dott.ssa Chiara De Rossi per il supporto alla cultura cellulare, all'analisi e alla microscopia. Ringraziamo anche Chelsea Thorn per aver letto il nostro manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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