Summary
Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.
Abstract
akciğer enfeksiyonlarının tedavisi için fDrug araştırma yüksek karmaşıklık tahmine dayalı in vitro modellerdoğru ilerliyor. Akciğer modellerinde bakterilerin çok yönlü varlığı epitel dizilişi yeniden adapte edebilir, bağışıklık hücreleri mikroortamda bakterilere karşı inflamatuar bir yanıt koordine ederken. In vivo modelleri kistik fibrozis bağlamında yeni anti-enfektifleri test etmek için tercih olsa da, hala doğru insanlarda bu tür hastalıkların in vivo koşulları ve tedavi sonuçları taklit etmez. İnsan hücrelerine (bronşiyal epitel ve makrofajlar) ve ilgili patojenlere dayalı enfekte hava yollarının kompleks in vitro modelleri bu boşluğu kapatabilir ve yeni anti-enfektiflerin kliniğe çevrilmesini kolaylaştırabilir. Bu amaçla, insan kistik fibrozis bronkil epitel hücre hattı CFBE41o bir co-kültür modeli- ve THP-1 monosit kaynaklı makrofajlar, hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarda P. aeruginosa tarafından insan bronşiyal mukoza bir enfeksiyon taklit kurulmuştur. Bu model yedi gün içinde ayarlanır ve aşağıdaki parametreler aynı anda değerlendirilir: epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration, bakteriyel sağkalım, ve inflamasyon. Bu protokol, yeni anti-enfektifleri keşfetmek ve akciğerlere aerosol dağıtımını optimize etmek için uygun olabilecek ilaç etkinliğini ve konak yanıtlarını değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir sistemi tanımlar.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa kistik fibrozis ilgili bir patojen (CF) akciğer dokusubozukluğukatkıda 1. Aljinat ve diğer mukoid eksopolisakkaritler gibi polisakkaritlerin üretimi, inatçı bakteriyel yapışmayol açar hastalığın ilerlemesini koordine eder, bakterilere antibiyotik teslim sınırlar ve konak bağışıklık sistemine karşı bakterileri korur2. P. aeruginosa'nın planktonik evreden biyofilm oluşumuna geçişi bu bağlamda kritik bir konudur ve antibiyotik toleransının oluşmasını da kolaylaştırmaktadır.
CF bağlamında, fare öncelikle bir model olarak kullanılmıştır. Ancak fareler CF mutasyonları3'ündevreye girmesiyle bu hastalığa kendiliğinden yakalanmazlar. Bakteriyel biyofilm gelişimi ve ilaç duyarlılık çalışmalarının çoğu Petri kapları gibi abiyotik yüzeylerde yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım in vivo karmaşıklığı temsil etmez. Örneğin, önemli biyolojik engeller, bağışıklık hücreleri yanı sıra mukozal epitel de dahil olmak üzere yoktur. P. aeruginosa epitel hücreleri için oldukça toksik olmasına rağmen, bazı gruplar insan bronşiyal hücreleri ile daha önceki bir P. aeruginosa biyofilm yetiştirmek başardık. Bu hücreler CFTR mutasyonu olan kistik fibrozis hastalarından (CFBE41o- cells)4 kökenli ve antibiyotik etkinliğini değerlendirmek için izin5 veya enfeksiyon sırasında CFTR protein düzeltme değerlendirmek için izin6. Böyle bir model uyuşturucu etkinliğinin öngörülebilirliğini artırmak için gösterilmiştir, ilaç geliştirme sonraki aşamalarında başarısız ilaçlar ile sorunların karakterizasyonu sağlayan ek olarak7.
Ancak, akciğerde, mukozal epitel havaya maruz kalır. Ayrıca, doku makrofajları gibi solunum yollarında bulunan bağışıklık hücreleri, solunan patojenler veya parçacıklara karşı önemli bir rol oynamaktadır8. Makrofajlar bronşiyal lümen ulaşmak ve enfeksiyon mücadele için farklı hücre katmanları üzerinden göç. Ayrıca, inhale ilaçlar da pulmoner hava-kan bariyeri ek bir hücresel olmayan unsur olarak mukus varlığı ile başa çıkmak zorunda9. Nitekim, birkaç karmaşık üç boyutlu (3D) in vitro modeller geliştirilmiştir, in vivo alaka artırmak amacıyla. Ortak kültür sistemleri sadece ilaç keşfi için in vitro sistemlerin karmaşıklığını artırmakla kalmıyor, aynı zamanda hücre-hücre etkileşimlerini de incelemeyi mümkün kılmasını sağlıyor. Bu tür karmaşıklık makrofaj göçü ile ilgili çalışmalarda ele alınmıştır10, nötrofiller tarafından antimikrobiyal peptidlerin serbest bırakılması11, enfeksiyonda mukus rolü9, ve aşırı hasara epitel hücre reaksiyonu12. Ancak, cf genetik mutasyon özellikleri güvenilir bir CF enfekte in vitro modeli, havaya maruz kalan (artan fizyolojik durum), ve bağışıklık hücreleri entegre hala eksik.
Bu boşluğu kapatmak için, enfekte hava yollarının istikrarlı insan 3D eş kültürü için bir protokol uyguluyoruz. Model insan CF bronşiyal epitel hücreleri ve makrofajlar oluşur, P. aeruginosa ile enfekte ve hem difüzyonel hem de immünolojik bariyer temsil yeteneğine sahip. Anti-enfektifleri makul derecede yüksek iş kaynağında test etmek amacıyla, bu ortak kültür iyi plaka kesici uçların geçirilebilir filtre zarı üzerinde iki insan hücresi hattı kullanılarak kurulmuştur: CFBE41o- ve THP-1 monosit türevi makrofajlar. Ayrıca, sonunda aerosolize anti-enfektifler birikimi çalışmaiçin 13, model hava-sıvı arayüzü (ALI) yerine sıvı kaplı koşullar (LCC) kurulmuştur.
Burada rapor olarak, Bu model sadece bir antibiyotik tedavisi üzerine bakteriyel sağkalım değil, aynı zamanda hücre sitotoksisitesi, epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration ve inflamatuar yanıtları, ilaç gelişimi için gerekli parametreler olan değerlendirme sağlar.
Bu protokol pulmoner hava yollarının inhalasyon tedavisi için iki ilgili hücre tipini biraraya getirir: makrofajlar ve CF bronşiyal epitel. Bu hücreler geçirilme destek uçlarının zıt taraflarında tohumlanır ve hücrenin havaya maruz kalmasına izin verir (hava-sıvı arabirimi (ALI) koşulları olarak adlandırılır. Konak hücrelerin bu co-kültür daha sonra P. aeruginosaile enfekte . Her iki konak hücre hatları insan kökenlidir: epitel hücreleri kistik fibrozis bronşiyal epitel temsil, CF kanalında bir mutasyon ile (CFBE41o-), ve THP-114 hücreleri iyi karakterize makrofaj benzeri hücre hattı vardır. Makrofaj benzeri hücreler karşı bölmeye eklenmeden önce kuyu plaka uçlarının üst tarafında bir konfluent epitel tabakasının oluşmasına izin verilir. ALI'de ortak kültür kurulduktan sonra sistem apikal tarafta P. aeruginosa ile aşılanır. Bu enfekte co-kültür sistemi daha sonra bir antibiyotik etkinliğini değerlendirmek için kullanılır, örneğin tobramisin. Aşağıdaki son noktalar analiz edilir: transepitelyal elektrikdirenci (TEER), hücre-hücre ve hücre-bakteri etkileşimlerinin konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ile görselleştirilmesi, koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayılarak bakterisel sağkalım, konak hücre sağkalım (sitotoksisite) ve sitokin salınımı açısından epitel bariyer bütünlüğü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Geçirimli destek uçlarında hücrelerin büyümesi ve farklılaşması
- CFBE41o yetiştirmek- % 10 fetal buzağı serumu (FCS), %1 esansiyel olmayan amino asitler ve %5 CO2 atmosferi ile 37 °C'de 600 mg/L glikoz içeren 13 mL minimum esansiyel ortama (MEM) sahip bir T75 şişesinde. Hücrelere her 2-3 günde bir taze ortam ekleyin.
- 3 mL tripsin- Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile şişede %70 birleştiğinde hücreleri 37°C'de 15 dakika ayırın. 7 mL taze MEM ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 4 dk (RT) için 300 x g'de santrifüj edin. Supernatant atın ve yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından kümeleri bozarak mem yeni 10 mL ekleyin.
- Hücreleri otomatik hücre sayacı veya hemositometre odasıyla sayın. Geçirgen destekli 12 kuyulu plakalarda 2 x 105 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip tohum hücreleri (gözenek boyutu 3 μm, bkz. Malzemeler Tablosu).
NOT: Otomatik hücre sayacı hücre numarasını, boyut dağılımını ve hücrelerin canlılığını belirler (bkz. Malzemeler Tablosu). Gözenek boyutu 0.4 m olan geçirimli destekler burada kullanılabilir; ancak, makrofajlar, bu durumda, doğrudan apikal tarafa eklenmelidir ve bunların hücre içi göçü bu durumda değerlendirilmeyecektir. - Geçirgen desteğin apikal tarafına hücre süspansiyonunun 500 μL'si ve bazolateral tarafta 1,5 mL taze ortam ekleyerek sıvı-sıvı durumundaki (LLC) tohum hücreleri. Daha sonra hücreleri 37°C'de %5 CO2'ninaltında 72 saat kuluçkaya yatırın.
- Hava-sıvı arabirimi (ALI) kültürüne geçiş yapmak için, tohumlamadan sonraki üçüncü gün, ortamı önce bazolateral taraftan, sonra apikal taraftan çıkarın. Bazolateral tarafa 500 μL taze MEM ekleyin ve hücreler bir eşzamanlı monolayer oluşturana kadar her iki günde bir orta yı değiştirin.
NOT: Bu protokolde kullanılan koşullar için, CFBE41o- hücreler genellikle kültür 3-7 gün sonra confluent vardır. - CFBE41o kuluçka tarafından gün 7 epitel bariyer özelliklerini değerlendirmek- apikal tarafında 500 μL hücreli orta ve 1.5 mL bazolateral tarafında 1 h, 37 ° C altında% 5 CO2.
- StX2 çubuk elektrot ve epitel volt-ohmmetre ile transepitel elektrikdirenci (TEER) ile bariyer özelliklerini ölçün; 7 gün sonra bu 300 Ω×cm²'den yüksektir.
NOT: Sonunda, bazı membran uçlarında hücrelerde düşük TEER bulunur. Bu nedenle TEER < 300 Ω×cm²'li geçirimli kesici uçlar kullanılmaz.
- THP-1 hücreleri yetiştirmek için, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta% 10 FCS ile takviye 13 mL kullanarak bir T75 şişesinde büyümek ve% 5 CO2altında 37 ° C inkübat . Yeni bir T75 şişesinde 2 x 106 hücre/mL hücre tohumlayarak hücreleri her iki günde bir bölün.
NOT: Diferansiye olmayan THP-1 hücreleri süspansiyonda monosit olarak yetiştirilir.- THP-1 hücrelerini aşağıdaki gibi ayırt edin. 4 dk için 300 x g bir T75 santrifüj içeriği. Supernatant atın, taze ortamda pelet resuspend ve yeni bir T75 koymak. 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ekle RPMI'deki hücreleri 37 °C'de 48 saat ve %5 CO2 atmosfer15'einküttür.
NOT: PMA ile farklılaşmadan sonra hücreler artık çoğalmaz ve şişeye bağlanır. - THP-1 makrofaj benzeri hücreleri ayırmak için, 37 °C'de fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0,5 mM EDTA içeren 3 mL hücre dekolmanı çözeltisi (örn. accutase) ile inkümide.
- Hücre kopmasını aramak için ters bir mikroskop altındaki hücreleri inceleyin. RT'de 4 dk için 300 x g'de 7 mL taze orta ve santrifüj ekleyin.
NOT: Makrofajlar da tripsin-EDTA, 37 °C 20 dk ile ayrılabilir. Ancak, tripsin makrofajlara seçilen hücre ayırma çözeltisinden daha serttir (bkz. Malzemeler Tablosu). - Süpernatant çıkardıktan sonra, THP-1 ortamının 3 mL'lik makrofaj hücrelerini 15 mL konik tüpe yeniden askıya alın, 1.1.2'de açıklandığı gibi hücreleri sayın. ve ortak kültürü kurmadan önce 37 °C'de %5 CO2'nin altında maksimum 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Süspansiyondaki THP-1 hücreleri, ortak kültürü daha fazla görüntülemek için canlılık boyalarıyla boyanabilir. Bu adımda, aşağıdaki yordamı kullanın (adım 1.2.5). - Hücre canlılığının 10 μM'lik tablosu (hücre içi esterazlar tarafından asetat moieties'in dönüştürülmesine göre, hücre süspansiyonuna 3 μL'lik hücre canlılık boyasının uygulandığı Malzeme Tablosu'nabakın). 37 °C'de 20 dk, %5 CO2'deinküler, boyayı çıkarmak için PBS 37°C ile 1x yıkayın.
NOT: Oda sıcaklığında (RT) 4 dk için 300 x g boya kaldırmak için hücreleri santrifüj.
- THP-1 hücrelerini aşağıdaki gibi ayırt edin. 4 dk için 300 x g bir T75 santrifüj içeriği. Supernatant atın, taze ortamda pelet resuspend ve yeni bir T75 koymak. 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ekle RPMI'deki hücreleri 37 °C'de 48 saat ve %5 CO2 atmosfer15'einküttür.
2. Geçirimli desteklerde epitel-makrofaj eş kültürünün oluşturulması
- CFBE41o kullanın- ALI'de TEER ≥ 300 Ω×cm² ile monolayers (adım 1.1.6.). Orta yı alt odadan çıkarın, steril cam Petri kabının (50 mm x 200 mm) içindeki desteği dikkatlice ters çevirin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak membranın alt tarafındaki membran gözenekleri aracılığıyla büyümüş hücreleri çıkarın.
NOT: 3 μm gözenek boyutu nedeniyle, epitel hücreleri basolateral yan doğru gözenekleri ile büyümeye eğilimindedir. Bu nedenle, bir bu tarafta makrofajlar eklemeden önce bunları kaldırmak gerekir. CFBE41o- akciğer epitel hücreleri bu adımda lekeli olabilir. Adım 1.2.5'teki yordam kullanılabilir; ancak, hücre süspansiyonu yerine MEM'deki boya çözeltisi geçirgen destek üzerine yapışan hücrelere (sadece 500°L apikal taraf) uygulanır. - PMA-diferansiye edilmiş THP-1 makrofajlarının hücre süspansiyonundan 2 x 105 hücre/kuyu (200 μL RPMI) kullanın ve hücreleri ters eklerin bazolateral tarafına yerleştirin.
- Petri yemeklerini dikkatlice kapatın ve %5 CO2'ninaltında 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Uçları 12 kuyulu mikroplakalara geri yerleştirin ve ALI koşullarını korumak için geçirgen kesici ucun basolateral tarafına 500 μL MEM ortamı ekleyin. Hücreler enfeksiyona hazır.
3. Enfeksiyon P. aeruginosa tarafından
NOT: Aşağıdaki tüm adımlar biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) laboratuvarında yapılmalıdır.
- 15 mL likolin likit suyu (LB) bir Erlenmeyer şişesinde (50 mL) p. aeruginosa PAO1-GFP kolonisi ile 300 μg/mL ampisilin ile desteklenir.
NOT: P. aeruginosa diğer suşları da burada kullanılabilir, örneğin, PAO1 yabani tip, PA14, veya klinik suşları, kendi yetiştirme protokolleri aşağıdaki. - Bakterileri 37°C'de 18 saat kuluçkaya yatırın, 180 rpm'de sallayarak.
- İçeriği 18 saat sonra 50 mL konik tüpe ve santrifüje 3850 x g'de 5 dk aktarın. Supernatant atın ve 37 ° C steril PBS 10 mL ekleyin.
- Dalga boyu 600 nm'deki bir spektrofotometredeki optik yoğunluğu ölçün ve hücre kültürü ortamını kullanarak bakterilerin konsantrasyonunu 2 x 105 CFU/mL'lik son konsantrasyona ayarlayın. Bu, epitel hücre başına bir bakterinin çokluğuna (MOI) karşılık gelir.
- Geçirgen desteğin apikal tarafına 100 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin (adım 2.4.) ve bakterilerin hücrelere bağlanmasını sağlamak için 37 °C'de %5 CO2'nin altında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, ALI koşullarını geri yüklemek için bir pipet ile dikkatle apikal sıvı çıkarın. Bazı örnekleri kontrol olarak enfekte edilmemiş tutun.
NOT: Bu aşamada, bağlı bakteriler LB agar (bkz. adım 5.4/5.5) ilk bakteri inoculum belirlemek için kaplama olmalıdır. - Hücrelerde bakteriyel yapışma sonra ilgi ilaç kuluçka. Tedavi deneyleri için, hücre ortasında seyreltilmiş bir ilaç çözeltisinin 500 μL'sini ekleyin (bu protokolde tobramisin 6 μg/mL kullanıldı) apikal tarafa. Bazolateral tarafta ilaç olmadan hücre orta 1.500 μL ekleyin.
NOT: İlaçları çözüm olarak aşılamak yerine, model aerosol birikimine de adapte edilebilir. Bu amaçla, ALI'deki hücreler bazolateral taraftan 500 μL hücre ortası ile beslenirler. İlaç daha sonra ilk nebulized ve uygun bir cihaz (burada açıklanmaz) tarafından apikal bölmede mevduat izin verilir. Enfekte ve tedavi edilen örnek, 4-7. Bu adımdan itibaren, geçirgen destekler ya görüntüleri oluşturmak için kullanılabilir (bölüm 4) ya da bakteri büyüme ve memeli hücre canlılığı sonuçları almak için, diğerleri arasında (bölüm 5-7).
4. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) için numune hazırlama
- Ortak kültür, enfeksiyon ve ilaç tedavisinin kurulmasından sonra, apikal ve bazolateral taraftan tüm ortamı çıkarın. 37°C'de PBS ile 1 x yıkayın ve hücreleri %3 paraformaldehit (PFA) ile 1 saat boyunca RT'de (bazik/600°L'de 300 μL) düzeltin. Hücre çekirdekleri oda sıcaklığında 30 dk için 5 μg/mL DAPI-PBS ile boyanır.
DİkKAT: PFA tehlikelidir. - Membranları neşter kullanarak kesin ve montaj ortamı kullanarak iki adet 12 mm'lik mikroskopi kapağı kaydırağı arasına yerleştirin (bkz. 4 °C'de saklanmadan önce 30 dk akış tezgahı içinde kurumasını bekleyin. Konfokal tarama mikroskopisi ile görselleştirin.
NOT: Ortak kültürden sonra ve montajdan önce sıkı kavşaklar immünboyama yapılabilir. Bunun için hücreler 30 dakika boyunca paraformaldehit %3 ile sabitlenir, PBS ile tekrar yıkanır ve PBS'de saponin %0.05/BSA %1 ile permeabilize edilir. Bu protokolde zonula oklüden proteini (ZO-1) fare anti-insan ZO-1 antikor (1:400, inkübasyon 4 °C gecede) ile tespit edilmiştir. Örnekler daha sonra keçi anti-fare IgG antikor Alexa Fluor 633 (1:2000 kırmızı) ile RT 2 saat için kuluçka yada dı. Çekirdekler DAPI (1 μg/mL) ile boyanmış ve kapaklara montaj ortamı ile monte edilmiştir. - Depolanan membranları görüntülemek için konfokal mikroskop kullanın. Algılama için 405, 488, 505 veya 633 nm'de 25x veya 63x su daldırma hedefleri ve lazerler seçin. Görüntülerde 1024 x 1024 piksel çözünürlüğe sahip olmalıdır.
NOT: Lazerler kullanılan lekeye göre seçilir. - Apikal ve kesit görünümleri edinin ve görüntüleme yazılımı kullanarak üç boyutlu bir modelin yapımı için zeta-stack modunu (10-15 yığınlar) kullanın.
5. Koloni oluşturan birimler (CFU) ile bakteri çoğalmasının ölçülmesi
- Bağlı olmayan bakterilerin CFU değerlendirmek için apikal ve bazolateral orta (bakteri içeren) toplamak. Apikal ve bazolateral kenarlardan 500 μL toplayın ve havuzlayın.
NOT: Bu süspansiyonu doğrudan bakterileri (adım 5.4) veya santrifüjü 10 dk için 21.250 x g'de saymak için kullanın ve ekstrasellüler bakterileri saymak için PBS'deki laktat dehidrogenazını (LDH) ve/veya PBS'de yeniden askıya alınmasını değerlendirin (adım 5.4). - Geçirgen desteğin her bölmesine 500 μL steril deiyonize soğuk su ekleyerek hücrelere bağlı ve/veya içselleştirilmiş bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon hücreleri.
NOT: Numuneler lb agar (bkz. adım 5.4) veya daha sonra kaplama için -20 °C'de dondurulmuş (tüm kesici plaka olarak) üzerine kaplanabilir. - Yapışık/içselleştirilmiş bakterilerin CFU'yu değerlendirmek için, 37°C'de 10 dakika (dondurulmuşsa) erime numuneleri. Her kuyu için pipet uçlarını kullanarak, bağlı tüm içeriği çıkarmak için membran yüzeyini ve pipetleri yukarı ve aşağı kazıyın.
NOT: Bu adımda tüm epitel hücreleri lysed ve yapışık / internalize bakteriler kaplamalı bir süspansiyon olarak kullanılabilir. - Her iki fraksiyonları bakteriyel süspansiyon ile, PBS Tween-80 0.05% kullanarak 1/10 seri seyreltme gerçekleştirmek ve LB agar plakaları üzerinde bakteri plaka.
NOT: 1 ile 10 arasında seyreltme önerilir. Bakteriler, tek kolonilerin ilk olarak tanımlandığı en yüksek seyreltmede sayılmalıdır. - 30°C'de 16-72 h'de kolonilere inkübedin ve CFU'yu buna göre hesaplayın.
NOT: Plaka kuluçka sırasında 30°C sıcaklık tedavi-numuneler ve kolonilerin gecikmeli büyümesini gözlemlemek için gereklidir.
6. Laktat dehidrogenaz talimi ile hücre sitotoksisitesinin değerlendirilmesi
- LDH tsay16için hücre canlılığı değerlendirmesi için bakteri içeren enfekte hücrelerin supernatant kullanın (adım 5.1). 10 dk için 21.250 x g de supernatant santrifüj bakteri pelet ve sonunda hücrelerin geri kalanı. LDH salınımını ölçmek için bakteriiçermeyen süpernatant'ı kullanın.
NOT: Supernatant bu teşbit ile LDH ölçmeden önce dondurulmuş olmamalıdır. - Supernatant'ın 100 μL'sini 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve LDH tsay çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin (Malzeme Tablosu'nabakın). Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra 492 nm emici okuyun.
7. İnsan sitokinlerinin salınımını değerlendirmek
- Sitokin nicelemi için ELISA veya sitometrik boncuk dizisi immunoassay17kullanın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Bunun için, 10 dk için 21.250 x g'de adım 5.1'den itibaren santrifüj süpernatant ve analize kadar 15 gün boyunca -80 °C'yi hemen veya saklayın.
- Supernatants'ı ticari olarak kullanılabilen bir ELISA kiti yle değerlendirin.
NOT: Prosedür, plakaların yakalama antikorile kaplanması, numunelerin (100 μL) ve sitokin standartlarının eklenmesi, inkübasyon, yıkama ve sitokin varlığının kolorimetrik ölçümünü sağlamak için algılama antikorilatını içeren üretim talimatlarını izler. Alternatif olarak, akış sitometrisi ticari olarak mevcut kitleri aracılığıyla sitokinleri ölçmek için kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A, permeable desteklerin apikal ve bazolateral tarafında 24 saat büyüdükten sonra insan bronşiyal epitel hücrelerinin ve makrofajların ortaya çıkan eş kültürünün morfolojisini göstermektedir. Epitel bariyer bütünlüğü daha yüksek TEER (834 Ω×cm2) ve CLSM ile sıkı kavşak proteini ZO-1(Şekil 1B)için immünboyama ile gösterilir. Enfekte olmayan CFBE41o bariyer bütünlüğü açısından gözlenen aynı sonuçlar- monokültür enfekte olmayan epitel-makrofaj co-kültürlerde görülebilir.
Bir bakteriyel enfeksiyon modellemek için, P. aeruginosa CFBE41o üzerinde 1:1 enfeksiyon (MOI) bir çokluğu aşılanmış oldu- hücreler. Enfeksiyondan altı saat sonra(Şekil 2A),konik kültürün apikal tarafında makrofajlar gözlendi. Enfeksiyondan sonra TEER 834'ten 250 Ω×cm2'yedüştü ve zo-1 boyama ile de görselleştirilen bir epitel bariyerini gösteriyordu (Şekil 2B).
Şekil 3, permeable membran gözenekleri ve bakteri alımını apikal taraftaki THP-1 hücreleri ile makrofaj transmigration'ı göstermektedir. Örnekler bağımsız deneylerden 1, 3 ve 6 saat sonrası kuluçka dan sabit edildi. THP-1 monokültürlerinde(Şekil 3A-C),makrofaj göçü 1 saat gibi erken saatlerde gözlenirken, eş kültürde(Şekil 3D-F),bu 3 saat enfeksiyon dan sonra görüldü. THP-1'de bakteri alımı hem monokültürde hem de ortak kültürde 3 saatlik enfeksiyon dan sonra gözlendi. CFBE41o ile bakteriyel alım görülmedi. Kesitsel görünümler, geçirgen membran desteğinin apikal ve bazolateral bölmenin ayrılması olarak ortada olduğu şekilde yerleştirildi.
Şekil 4 enfekte co-kültürlerin konfokal tarama lazer mikroskobu resimleri gösterir (CFBE41o- + THP-1) 6 saat(Şekil 4A, B)veya 20 saat(Şekil 4C,D)için tobramisin ile veya olmadan tedavi . Tedavi olmadan hem epitel hücreleri hem de makrofajlar 20 saat enfeksiyon dan sonra öldüler(Şekil 4C). Ancak, tobramisin tedavisi üzerine, konak hücreleri 20 saat sonra korunur; yine de, bazı bakteriler kültürde görülebilir. Mikroskopi resimlerinde(Şekil 4B)6 saat tedaviden sonra görülmesine rağmen, bakteriler Şekil 4E'dekiCFU tahlillerinde gözlendiği gibi çoğalmamaktadır. Bununla birlikte, 20 saat tedaviden sonra, bakteriler CFU tsömleğinde ki koloniler tarafından görüldüğü gibi proliferasyon yeteneğini geri kazanmıştı (Şekil 4F). Soğuk su ve kazıma ile hücre lisis protokolü bağlı ve muhtemelen hücrelerde içselleştirilmiş bakterileri serbest bırakabilirsiniz. Aynı zamanda, hücreler yok edilir(Ek Şekil S1A, B). Epitel hücreleri (300 x g)veya bakteriler (21.250 x g)için bu yazıda kullanılan santrifüj adımları her ikisinin de canlılığını engellemedi (Tamamlayıcı Rakamlar S1C, D). Tüm CFU tahlilleri -20°C'de numunelerin dondurulması, ardından çözülmesi ve kaplama ile gerçekleştirilmiştir. Bu işlem, taze numunelere göre bakteri sayısını 2'ye kadar azalttı(Ek Şekil S1E). Bu işlem farklı zaman noktalarındatüm deney grupları için (tedavi edilen ve tedavi edilmeyen) aynı anda yapıldığından, bu azalma nihai sonuçlara dahil edilecektir(Ek Şekil S1E). Ayrıca, burada kullanılan tobramisin konsantrasyonu enfekte olmayan hücreler için toksisite gösterdi (Tamamlayıcı Şekil S2A) ve ayrıca daha fazla inflamatuar yanıt (Tamamlayıcı Şekil S2B). Ancak, P. aeruginosaöldürmek için minimum inhibitör konsantrasyon aralığında oldu.
Şekil 5 transepitel elektrikdirencini (TEER) ve hücre canlılığını gösterir. Şekil 5A-B, monokültürlerin ve ortak kültürlerin TEER'ini göstermektedir. CFBE41o ortak kültür- THP-1 ile hücreler monokültür (kırmızı çubuklar) ile karşılaştırıldığında epitel bariyer bütünlüğü herhangi bir değişiklik neden vermedi. Enfeksiyon üzerine, TEER değeri düştü (yeşil çubuk). Enfeksiyon 1 saat sonra, bazı örnekler antibiyotik tobramisin ile tedavi edildi (mavi çubuk), için 6 veya 20 saat. Tedavi, yüksek TEER tarafından gözlemlendiği gibi epitel bariyer bütünlüğünü korumuştur. Şekil 5C, LDH salınımını enfeksiyon ve tobramisin tedavisi nin 6 saat sonra hücre toksisitesi endikasyonu olarak göstermektedir. Co-kültür kendisi LDH bir salınımı indüklenen, enfekte hücreler için aynıydı (yaklaşık 20%). 20 saat enfeksiyon dan sonra LDH sinyali saptanamadı. Uzun süreli enfeksiyon için LDH güvenilirliğini kanıtlamak için, PAO1-GFP, enfekte olmayan kontrollere göre LDH 1 U/mL ile orta ve enfekte olmayan bir ortamda kuluçkaya yatırıldı(Ek Şekil S2C). LDH sinyali p. aeruginosaile uzun süreli kuluçka (20 saat) sonra kaybedildi , LDH enfekte kültürlerde kısa kuluçka süreleri sadece istikrarlı olduğunu gösteren.
Şekil 6, ELISA ile saptanan pro-inflamatuar sitokinlerin kinetiklerini göstermektedir. CFBE41o ve THP-1 hücrelerinin enfekte ortak kültürünün avantajı pro-inflamatuar sitokinlerin yüksek salgıları ilegözlendi. Bazı pro-inflamatuar sitokinlerin salgıları enfekte ortak kültürde(Şekil 6C)benzer (IL-6) veya daha yüksekti (Şekil 6C) karşılık gelen monokültürlerden(Şekil 6A-B). Beklenmedik bir şekilde, THP-1 monokültürlerinde(Şekil 6B)bazı sitokinler enfekte örneklerde (Il-8, TNFα, IL-1β) indirgenmiştir.
Şekil 7, floresan aktif hücre sıralaması (FACS) ile ölçülen tobramisin ile enfeksiyon ve tedavi üzerine mono ve ko-kültürlerde sitokin salınımını göstermektedir. Pro-inflamatuar sitokin IL-8(Şekil 7A)ve anti-inflamatuar sitokin IL-10(Şekil 7F)salgıları epitel hücreleri ve makrofajların ortak kültürlerinde monokültürlere göre daha yüksekti. Ancak, diğer tüm sitokinler için (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 ve GM-CSF)(Şekil 7B-E),sitokin salgılanma düzeyleri ilgili monokültürde ortak kültürde daha yüksek değildi.
Şekil 1: Enfekte olmayan epitel-makrofaj eş kültürünün kesitleri ve apikal görüşleri. (A) Enfekte olmayan 24 h epitel-makrofaj co-kültür çapraz görünümleri. CFBE41o- lekeli kırmızı, THP-1 makrofajlar sarı ve çekirdekleri mavi (DAPI). (B) ZO-1 (kırmızı) için enfekte olmayan CFBE41o- monolayer immüno-lekeli apikal görünümleri. DAPI: çekirdek. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enfekte epitel-makrofaj eş kültürünün kesitleri ve apikal görüşleri. (A) Çapraz görünümler ve (B) Epitelyal-makrofaj co-kültür apikal görünümü 6 saat post-enfeksiyon (hpi) P. aeruginosa PAO1-GFP ile. CFBE41o- kırmızı, THP-1 makrofajlar sarı, çekirdekleri mavi (DAPI) ve P. aeruginosa PAO1-GFP yeşil lekeli. (B) 6 saat enfekte CFBE41o-monolayer apikal görünümleri. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Makrofaj transmigration ve bakteri alımı kinetiği 3D modelin kesiti ile görselleştirilmiş. THP-1 makrofajlarının monokültürlerinde PAO1-GFP enfeksiyonu kinetik(A-C)veya co-culture(D-F). THP-1 makrofajlar kırmızı, epitel hücrelerinin çekirdekleri mavi (DAPI) ve P. aeruginosa yeşil (GFP) ile boyanmıştır. Her şekil apikal ve bazolateral kenarlara ayrılır, aradaki boşluk boş veya CFBE41o tarafından işgal membran olarak kabul edilir- konfluent tabaka (D-F). Rakamlardaki ekler, farklı zamanlarda makrofajlar tarafından bakteri alımını göstermektedir (A-F). Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PaO1-GFP sağkalımını tobramisin tedavisi ko-culture. (A-D) Konfokal mikrograflarda, tedavi li ve tedavisiz olarak karakterize eder. (A) 6 saat enfeksiyon dan sonra tedavi edilmemiş eş kültür. (B) Enfekte co-kültür tobramisin 6 μg/mL (Tob) ile tedavi 6 h. (C) Tedavi edilmemiş co-kültür 20 h post-enfeksiyon, (D) enfekte co-kültür tobramisin 6 μg/mL ile tedavi 20 saat. Dapi (mavi), makrofajlar (kırmızı) ve P. aeruginosa GFP (yeşil) ile boyanmış çekirdekler. (E) 6 ve(F)tobramisin 6 μg/mL tedavisi ile 20 saat sonra yapışık/internalize bakterilerin koloni oluşturan birimleri (CFU). Boş membran eklemek PAO1-GFP büyümek için bir abiyotik substrat olarak kullanılmıştır. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi (# no kolonisi) ile iki yönlü ANOVA kullanıldı, *p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001; ns: önemli değil. Hata çubukları standart sapmayı gösterir, n = 9-27 3-9 bağımsız deneylerin kopyalarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bariyer bütünlüğü ve mono-ve co-kültürün canlılığının değerlendirilmesi. Aşağıdaki eş-kültür koşulları değerlendirildi: enfekte olmayan (gri çubuklar), enfekte (yeşil çubuklar), veya enfekte ve tobramisin (mavi çubuklar) ile tedavi edildi. (A) Transepitelyal elektrikdirenci sonra 6 saat ve (B) 20 saat mono-kültürlerde enfeksiyon h (CFBE41o- ve THP-1) ve ortak kültür. (C) LDH ile ölçülen mono ve co-kültür sitotoksisitesi 6 saat sonrası enfeksiyon salınımı. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA kullanılmıştır; *p < 0.05; p < 0.0001; ns: önemli değil. Hata çubukları standart sapmayı gösterir; n = 9 üç bağımsız deney kopyaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ELISA ile değerlendirilen enfekte olmayan ve enfekte olmuş mono-ve co-kültür supernatants sitokin salınımının kinetik. ELISA kit üreticisinin protokolüne göre yapıldı. (A) CFBE41o-, (B) THP-1 ve (C) il-8, TNF-α, IL-1β ve IL-6'yı serbest bırakan ortak kültür. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. n = 2 bağımsız deney 6 kopyaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: 6 saat sonrası enfeksiyon için tobramisin 6 μg/mL ile ve tobramisin olmadan FACS ile ölçülen sitokin panelin süpernatant sonuçları. İlgili sitokinlerin IL-8(A),IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) ve IL-10(F)analiz etmek için kullanılan 6 saat sonrası enfeksiyon sonrası mono ve co-kültür supernatants. Hata çubuğu standart sapmayı gösterir, n = 9 3 bağımsız deney kopyaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Protokolün kritik adımları için kontrol deneyleri. (A, B) CFBE41o-24-iyi plakalar 2 x 105 hücre/iyi yoğunlukta 2 gün boyunca yetiştirilen hücrelerin mikrograflar. (A) CFBE41o- 30 dakika PBS hücreleri ve (B) bir pipet ile kazındıktan sonra 30 dk sonra su ile tedavi hücreleri. (C) Santrifüj sonrası memeli hücrelerinin canlılığı. CFBE41o- hücreler adım 1.1.1 ve 1.1.2'de açıklandığı gibi T75 hücre kültürü şişesinden çıkarıldı. 10 mL'lik isotonik çözeltide 100 μL'lik hücre süspansiyonu analiz edildi. Tek hücrelerin canlılığını değerlendirmek için otomatik bir hücre sayacı kullanıldı. Daha sonra, ilgili hücre süspansiyonları 4 dk için 300 x g santrifüj edildi, yeniden askıya alındı ve tekrar sayılır. Hata çubukları standart sapmayı gösterir, n = 6 farklı şişe 2 ayrı deney. (D) Santrifüj sonrası PAO1-GFP'nin uygulanabilirliği. PAO1-GFP bakterileri hücre ortasında OD = 0.01'e seyreltildi. CFU 10 kat seyreltme sırası ile değerlendirildi ve LB plakaları bir gecede 30 °C'de kuluçkaya yatırıldı. İlgili plastik tüpler 10 dk için 21.250 x g santrifüj edildi ve orta yeniden askıya alındı. CFU yine buna göre değerlendirildi. İki kuyruklu öğrencinin t-testi, * p < 0.033. Hata çubuğu standart sapmayı gösterir, n = 6 2 deney. (E) Dondurulduktan sonra bakterilerin canlılığı. PAO1-GFP bakterileri (D) ve CFU'da olduğu gibi hazırlandı, daha sonra plastik tüpler -20 °C'de bir gün donduruldu ve CFU'yu tekrar değerlendirmek için çözüldü. İki kuyruklu öğrencinin t-testi, *** p < 0.001. Hata çubukları standart sapmayı, iki denemenin n = 6'sının olduğunu gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil S2: LDH davranışını ve tobramisin etkisini değerlendirmek için kontrol deneyleri. (A) 6 μg/mL tobramisin ile 20 saat kuluçka dan sonra sitotoksisiteyi değerlendirmek için kontrol deneyi. Protokolde açıklandığı gibi mono ve ortak kültür yapıldı, ancak hücreler 24 kuyulu tabaklarda 2 gün boyunca yetiştirildi ve THP-1 hücreleri apikal olarak tohumlandı. 6 μg/mL tobramisin veya kontrolleri olan hücreler 20 saat süreyle kuluçkaya yatırıldı. Tek Yönlü ANOVA, Tukey çoklu karşılaştırma testi, *** p < 0.001. Hata çubuğu standart sapmayı gösterir, n = 6 2 deney (CFBE41o-), n = 3 bir deney (THP-1 ve ortak kültür). (B) Tobramisin ile/tobramisin siz de olmayan mono ve co-kültür süpernatlarının kontrol-ELISA. Hücre kültürü (A)'ya göre tüm koşullar için kontrollere kıyasla sitokin salınımı göstermek için yapılmıştır. ELISA 7.1 ve 7.2 adımlarında yapıldı, kontrol olarak 10 g/mL (LPS) eklendi, THP-1 içeren LPS ile tedavi edilen kontroller için IL-8 salınımı saptanabilebilirden daha yüksekti. İki Yönlü ANOVA, Tukey çoklu karşılaştırma testi, ns p > 0.12; * p < 0.033; p < 0.001. Hata çubukları standart sapmayı gösterir, n = 6 iki deney, n = 3 bir deneme (LPS kontrolü). (C) Aşırı PAO1-GFP proliferasyonuna bağlı LDH bozulması. LDH, MEM Medium'a 1 U/mL konsantrasyonunda eklendi. Hücreleri OD = 0,01 'e seyreltmek için LDH orta veya kontrol ortamı kullanılmıştır (1 x 108 CFU/mL'ye karşılık gelir) ve daha sonra 20 saat ldh teşbiti bölüm 6'da açıklandığı şekilde inkübe edilmiştir. Tek Yönlü ANOVA, Tukey çoklu karşılaştırma testi, ns p > 0.12; p < 0.001. Hata çubuğu standart sapmayı gösterir, n = 8-9 üç ayrı deney. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda enfekte hava yollarının 3Boyutlu ortak kültür için bir protokol açıklar, insan kistik fibrozis bronşiyal epitel hücre hattı CFBE41o tarafından oluşturulan- ve insan monosit kaynaklı makrofaj hücre hattı THP-1. Protokol, aynı anda ilaç etkinliği ve konak yanıtları test ederken önemli parametreler olan epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration, bakteri sağkalım ve inflamasyon, değerlendirilmesi sağlar. Modeldeki yenilik, akut bakteriyel enfeksiyon (yani P. aeruginosa)ile epitel hücrelerinin (yani insan CF hücre hattı ve makrofajlar) birleştirilmesi nde yatmaktadır. Epitel hücrelerindeki akut enfeksiyonun bir antibiyotik (yani tobramisin) ile kontrol altına alınabildiğim gösterilmiştir. Bir insan CF hücre hattı kullanımının yanı sıra, tüm model CF'deki fizyolojik koşullara çok daha yakın olan ALI koşullarında kurulur. Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatörünün (CFTR) mutasyonu akciğerlerde epitel sıvı taşımadisyonu ile doğrudan ilişkilidir. Ayrıca, CF genindeki mutasyonlar, ΔF508 gibi, kalın mukus ile sonuçlanır, P. aeruginosaenfeksiyonu üzerine inflamasyon ve ciddi akciğer hasarıile 4. Disfonksiyonel CFTR'nin neden olduğu bu patolojik bulgular, CF akciğer hastalığının patogenezi ile ilişkili önemli bir hücresel mekanizma olarak otofaji bozukluğunu potansiyel olarak içerir18. Ancak, CFBE41o- bu hücre hattının bir sınırlama gizli mukus, başarısız. Mukus rolünü daha spesifik olarak incelemek için yapılmışsa, protokol diğer bronşiyal hücre çizgileri kullanılarak uyarlanabilir (örneğin, Calu-3).
Bu protokolü kurmak için kritik bir adım epitel ve bağışıklık hücreleri ve ALI De P. aeruginosa ile sonraki enfeksiyon kombinasyonudur. CFBE41o enfeksiyonu- P. aeruginosa in vitro tarafından zaten tarif edilmiştir, esas olarak bir akış hücresi odası kullanarak, kültür medyasında arginin ile desteklenen, epitel hücre sağkalımını artırmak ve biyofilm oluşumunu desteklemekiçin 19. Mevcut protokol, sadece insan hücrelerini kullanarak yeni bir model için hedeflenen, dahası, daha yüksek numune elde etmek için geçirilebilir kuyu plaka ekler ali yetiştirilen olabilir. THP-1'in farklılaştırılmış makrofajların insan ölümsüzleştirilmiş hücre hattı olarak dahil edilmesi, donörlerden tekrarlanabilir birincil hücreler elde edilmesine bağımlı olmak yerine, modelimizin bir diğer avantajıdır. Bu makrofajlar geçirgen membran desteğinin bazolateral tarafına eklenerek makrofajların çıkıntıyaptığı ve sonunda filtre ile yetiştirilen epitel bariyerin apikal tarafına göç ettiği gözlenmiştir. Bu protokolün bir varyasyonu, Kletting ve ark.tarafından açıklandığı gibi, epitel hücrelerinin üstündeki apikal tarafta doğrudan makrofajların eklenmesi olabilir. 14. İnsan olmayan bağışıklık ve akciğer hücrelerinin ortak kültürü daha önce de tanımlanmıştır. Ding ve ark. Geçirgen insert üzerinde 10 kullanılan fare Lewis akciğer karsinom hücreleri basolateral tarafında makrofajlar ile birlikte destekler ve S. aureusile enfekte , CF hastalarında kronik enfeksiyonun bir başka kritik patojen. Ancak bu çalışmada kistik fibrozis veya ortak kültürün ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için bir platform olarak kullanılmasına odaklanılmadı. Protokolümüz Staphylococcus aureus, Mycobacterium apse veya Burkholderia cepaciagibi diğer bakteriyel enfeksiyonlar için uyarlanabilir — CF akciğerinde önemli patojenler.
Bir diğer kritik adım da, geçirperatif uçları ters çevirerek THP-1 makrofajlarının hücrelere eklenmesidir (bölüm 2). Bu enfeksiyon tarafına kuyu üzerinden makrofaj transmigration değerlendirmek için çok önemlidir. Z-yığınları ve kesit görünümü ile 3D modellerden daha sonra görüntüleme işlemi makrofajların içini gözlemlemek ve bakteri alımını saptamak için gerçekleştirilebilir(Şekil 3). 1 hpi'de apikal tarafta uygulanan bakteriler membrandan geçirirken, makrofaj göçü ve alımı sadece 3 hpi'de gerçekleşir. Bu nedenle 1 saat enfeksiyon dan sonra tobramisin ile tedaviye başlayıp hem konak hücre hem de bakteri sağkalımını uzun süre (20 saat) ele almak uygun oldu. Protokol süresince, sterilitenin korunması, her birinin kontaminasyon riski taşıyan çok sayıda adım dan dolayı kritik bir konudur. Bununla birlikte, deneyimli hücre kültürü personeli uygun hazırlık ve eğitimden sonra bu protokolü takip edebilecektir. Hücre ortamı düzenli olarak kontaminasyon için kontrol edilmelidir, tercihen tüm kritik adımlardan sonra.
Herhangi bir model olduğu gibi, enfekte co-kültür de bazı sınırlamalar vardır; örneğin, makrofaj benzeri hücrelerin entegrasyonu. Burada, bazolateral tarafta makrofajlar olması önemliydi; ancak, daha önce büyümüş bir epitel tabakası ile kesici uç manipülasyonu co-kültür erken hasar ve rahatsızlıklar sağlamış olabilir. Rağmen, geçirimli destek modeli cf enfekte akciğer önceki co-kültürlerde gözlenmemiştir yüksek iş lenme özellikleri sağlanan20,21. Bununla birlikte, daha fazla deney makrofaj yerine THP-1 kullanarak sınırlamaları değerlendirmek gerekir. Bu hücre hattı yaygın olarak kullanılırken, LPS22'ye daha az yanıt verir ve tam aktivasyondan yoksundur ve tüm popülasyon monositlerden makrofaj benzeri hücrelere ayrıştırılamamış sidralar23. Başka bir sınırlama CF enfeksiyonu ve ilaç teslim diğer önemli bileşenlerin eksikliğidir. CFBE41o- hücre hattı cilia sahip değildir ne de genellikle ALI hücre kültürünün 20-30 gün olur mukus, üretir. Bu CFBE41o için durum böyle olmadığı gibi- hücre hattı, biz sıkı bir epitel bariyer oluşturulduğunda yedi gün sonra hücreleri kullanılır. Mucociliary açıklık ya mikroplar için ikamet koşullarını değiştirir24 veya ilaç parçacıkları9,25 ve in vitro modelleri akciğer birikimini değerlendiren dikkate almalıdır. Diğer hücreler tarafından gözlenenlerden farklı olarak, doku kültürü hücre dışı bir matris materyali (fibronektin veya kollajen I gibi) ile kaplama ekler CFBE41o için önemli bir fark göstermez-, örneğin TEER26. Bu nedenle, geçirimli filtreler bu protokolde hücre dışı bir matris malzemesi ile kaplanmadı.
Burada açıklanan protokol ile, 6 saat enfeksiyon sonrası mono ve co-kültürler gelecekteki uyuşturucu testlerinde bir ölçüm olarak kullanılmak üzere yeterli sitokin salınımını sağlar. Ortak kültür bağışıklık yanıtı modelleme hücre işbirliği bir avantaj getiriyor. Tedavi sırasında tüm bakterilerin ortadan kaldırılmamasıyla iltihabı azaltmada tobramisinin verimsizliği beklenmektedir(Şekil 4E, F). Yine de, bir CF modelinde tobramisin yanıtı modelleme çok önemlidir, tobramisin olarak (yüksek konsantrasyonlarda) P. aeruginosa inhibisyonu etkili olabilir, biyofilm bile19,27. Bu protokolün daha fazla kullanılmasının bir olasılığı da anti-inflamatuar ilaçların tedaviye entegre edilebistir. Inflamatuar yanıtlar ile ilgili genel tavsiye kısa süreli tedavi kullanmak olacaktır (6 saat), hala konak hücre ve bakteri mevcut olan. Bu zaman noktasından sonra, ana bilgisayar hücreleri işlenmemiş örneklerde yok edilir. Hem ELISA hem de FACS sitokin salınımını ölçmek için kullanılabilir. Son olarak, numuneler -80 °C'de 15 günden daha uzun süre saklanırsa, örneğin yeni numunelerin (örneğin LPS ile uyarılmış hücreler) pozitif kontrolü kullanılarak sitokinlerin güvenilirliğinin kontrol altına alınır.
Protokolde bazı değişiklikler mümkündür. Örneğin, mevcut protokol nebülize ilaçların uygulanmasına genişletilebilir (adım 3.6). Bu oral inhalasyon yoluyla pulmoner ilaç teslimi modellemek için gereklidir. Suda çözünen ilaçların nebülizasyonu, tobramisin gibi, ya da nano-taşıyıcılar, lipozomal kolistin gibi, rutin klinikte kullanılan ticari cihazlar tarafından nispeten düz ileri. Ayrıca, hücre kültürü ekler üzerine aerosoller yatırmak için çeşitli ticari cihazlar vardır. Buna ek olarak, burada açıklanan model geçirbilebilir membran desteklerine dayandığından, örneğin, solunumun etkisini ve buna bağlı mekanik germe ve hava akımındaki değişiklikleri incelemek için bazı çağdaş mikroakışkan (örneğin "çipteki akciğer") cihazlara da kabul edilebilir. Ayrıca, bu protokol ele alınacak bilimsel soruya bağlı olarak mukus eklenmesi veya birincil hücreler tarafından değiştirilmesi ile değiştirilebilir. Başka ilginç bir sonraki adım nanomedicines test olacaktır, özellikle nanoteknoloji yeni anti-enfektiflerin gelişiminde ilerleme yapıyor28, CF düzelticiler29 ve antibiyotik ve patoblocker30co-teslim . Hücre sitotoksisitesi, epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration ve inflamatuar yanıt: Genel olarak, mevcut protokol karmaşık bir sistemde antibiyotik tedavisi üzerine bakteriyel sağkalım değerlendirilmesinde yararlı olarak algılanabilir. Bunlar ilaç gelişimi için gerekli parametrelerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Tasarım ve Gelişmiş Nanoilaçların Geliştirilmesi ve Biyolojik Engelleri aşmak ve ağır hastalıkların tedavisi için hibe anlaşması kapsamında araştırma, teknolojik geliştirme ve gösteri için Avrupa Birliği'nin HORIZON 2020 Programı'ndan fon almıştır. Biz ortak kültür, Olga Hartwig, bilimsel illüstrasyon, Anja Honecker, ELISA tahliller için, Petra König, Jana Westhues ve Dr Chiara De Rossi hücre kültürü, analitik ve mikroscopy desteği için gelişimi büyük destek için Dr Ana Costa ve Dr Jenny Juntke teşekkür ederiz. Ayrıca chelsea Thorn'a makalemizi okuduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L.
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
