Summary
Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.
Abstract
A pesquisa de fDrug para o tratamento de infecções pulmonares está progredindo para modelos in vitro preditivos de alta complexidade. A presença multifacetada de bactérias em modelos pulmonares pode retransformar o arranjo epitelial, enquanto as células imunes coordenam uma resposta inflamatória contra as bactérias no microambiente. Embora os modelos in vivo tenham sido a escolha para testar novos anti-infecciosos no contexto da fibrose cística, eles ainda não imitam com precisão as condições in vivo de tais doenças em humanos e os desfechos do tratamento. Modelos in vitro complexos das vias aéreas infectadas com base em células humanas (epiteliais brônquicais e macrófagos) e patógenos relevantes poderiam preencher essa lacuna e facilitar a tradução de novos anti-infecciosos para a clínica. Para tais efeitos, foi estabelecido um modelo de co-cultura da linha de células epiteliais antelásticas císticas humanas CFBE41o- e macrófagos derivados do monócito THP-1, imitando uma infecção da mucosa brônquica humana por P. aeruginosa em condições de interface ar-líquido (ALI). Este modelo é configurado em sete dias, e os seguintes parâmetros são avaliados simultaneamente: integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófago, sobrevida bacteriana e inflamação. O presente protocolo descreve um sistema robusto e reprodutível para avaliar a eficácia da droga e respostas do hospedeiro que poderiam ser relevantes para a descoberta de novos anti-infecciosos e a otimização de sua entrega de aerossol para os pulmões.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa é um patógeno relevante na fibrose cística (CF) que contribui para o comprometimento do tecido pulmonar1. A produção de polissacarídeos, como alginato e outros exopolídeos mucoides, coordena o progresso da doença, que leva à tenaz adesão bacteriana, limita a entrega de antibióticos a bactérias e protege as bactérias contra o sistema imunológico hospedeiro2. A transição da P. aeruginosa da fase planctônica para a formação de biofilmes é uma questão crítica nesse contexto, facilitando também a ocorrência de tolerância a antibióticos.
No contexto da CF, o mouse tem sido usado principalmente como modelo. Os camundongos, no entanto, não desenvolvem espontaneamente essa doença com a introdução de mutações CF3. A maioria dos estudos de desenvolvimento de biofilme bacteriano e suscetibilidade a medicamentos tem sido realizada em superfícies abióticas, como placas de Petri. No entanto, essa abordagem não representa a complexidade in vivo. Por exemplo, importantes barreiras biológicas estão ausentes, incluindo células imunes, bem como o epitélio mucosa. Embora p. aeruginosa seja bastante tóxica para células epiteliais, alguns grupos conseguiram co-cultivar um biofilme P. aeruginosa anterior com células brônquicas humanas. Essas células originaram-se de pacientes com fibrose cística com mutação CFTR (CFBE41o- células)4 e permitiram avaliar a eficácia do antibiótico5 ou avaliar a correção da proteína CFTR durante a infecção6. Tal modelo mostrou-se para melhorar a previsibilidade da eficácia da droga, além de possibilitar a caracterização de problemas com drogas que falharam em fases posteriores do desenvolvimento de medicamentos7.
No entanto, no pulmão, o epitélio mucosa é exposto ao ar. Além disso, as células imunes presentes nas vias aéreas, como macrófagos teciduais, desempenham um papel essencial contra patógenos ou partículas inaladas8. Macrófagos migram através das diferentes camadas celulares para alcançar o lúmen brônquico e combater a infecção. Além disso, as drogas inaladas também têm que lidar com a presença de muco como um elemento não celular adicional da barreira ar-sangue pulmonar9. De fato, vários modelos in vitro tridimensionais complexos (3D) foram desenvolvidos, com o objetivo de aumentar a relevância in vivo. Sistemas de co-cultura não só aumentam a complexidade de sistemas in vitro para descoberta de drogas, mas também permitem estudar interações célula-células. Tal complexidade tem sido abordada em estudos sobre a migração de macrófagos10, a liberação de peptídeos antimicrobianos por neutrófilos11, o papel do muco na infecção9, e a reação das células epiteliais ao dano excessivo12. No entanto, um modelo in vitro infectado por CF confiável que apresenta a mutação genética em CF, que é exposto ao ar (aumento da condição fisiológica), e integra as células imunes ainda está em falta.
Para preencher essa lacuna, descrevemos um protocolo para a co-cultura 3D humana estável das vias aéreas infectadas. O modelo é constituído por células epiteliais e macrófagos bronquiais humanos, infectados com P. aeruginosa e capazes de representar uma barreira difuso e imunológica. Com o objetivo de testar anti-infecciosos a uma taxa razoavelmente alta, esta co-cultura foi estabelecida na membrana de filtro permeável de pastilhas de placas de poço, utilizando duas linhas de células humanas: CFBE41o- e macrófagos derivados de monócitos THP-1. Além disso, para eventualmente estudar a deposição de anti-infecciosos aerossolizados13,o modelo foi estabelecido na interface ar-líquido (ALI) em vez de condições cobertas líquidas (LCC).
Como relatamos aqui, este modelo permite avaliar não apenas a sobrevivência bacteriana em um tratamento antibiótico, mas também citotoxicidade celular, integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos e respostas inflamatórias, que são parâmetros essenciais para o desenvolvimento de medicamentos.
Este protocolo combina dois tipos de células relevantes para a terapia de inalação das vias aéreas pulmonares: macrófagos e epitélio bronquial cf. Essas células são semeadas em lados opostos de pastilhas de suporte permeáveis, permitindo a exposição celular ao ar (chamada de interface ar-líquido (ALI). Esta co-cultura de células hospedeiras é subsequentemente infectada com P. aeruginosa. Ambas as linhas celulares hospedeiras são de origem humana: as células epiteliais representam o epitélio brônquico da fibrose cística, com uma mutação no canal CF (CFBE41o-), e as células THP-114 são uma linha celular bem caracterizada como macrófago. Uma camada epitelial confluente é permitida pela primeira vez para se formar no lado superior das pastilhas de placas de poço antes que as células semelhantes ao macrófago sejam adicionadas ao compartimento oposto. Uma vez que a co-cultura é estabelecida na ALI, o sistema é inoculado com P. aeruginosa no lado apical. Este sistema de cocultura infectado é então usado para avaliar a eficácia de um antibiótico, por exemplo, tobramicina. São analisados os seguintes pontos finais: integridade da barreira epitelial em termos de resistência elétrica transepitelial (TEER), visualização de interações célula-célula-célula-célula-bactérias por microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), sobrevivência bacteriana por contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), sobrevivência celular hospedeira (citotoxicidade) e liberação de citocinas.
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Protocol
1. Crescimento e diferenciação de células em pastilhas de suporte permeáveis
- Cultivar CFBE41o- em um frasco T75 com 13 mL de meio essencial mínimo (MEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% aminoácidos não essenciais e 600 mg/L de glicose a 37 °C com atmosfera de 5 % de CO2. Adicione meio fresco às células a cada 2 a 3 dias.
- Retire as células após atingir 70% de confluência no frasco com 3 mL de trippsina- ácido edenediaminetetraacético (EDTA) a 37°C por 15 min. Adicione 7 mL de MEM fresco e centrifugar as células a 300 x g por 4 min a temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatante e adicione novos 10 mL de MEM enquanto interrompe os aglomerados, em tubos suavemente para cima e para baixo.
- Conte as células com um contador celular automatizado ou câmara hemótmetro. Células de sementes com densidade de 2 x 105 células/poço em placas de 12 poços com suportes permeáveis (tamanho de poros de 3 μm, ver Tabela de Materiais).
NOTA: O contador automatizado de células determina número de célula, distribuição de tamanho e viabilidade das células (ver Tabela de Materiais). Suportes permeáveis com tamanho de poros de 0,4 μm poderiam ser usados aqui; no entanto, os macrófagos, nesta condição, devem ser adicionados diretamente ao lado apical, e sua migração transcelular não será avaliada neste caso. - Células de sementes em condição líquido-líquido (LLC) adicionando 500 μL da suspensão celular no lado apical do suporte permeável e 1,5 mL de meio fresco no lado basolateral. Em seguida, incubar células a 37°C abaixo de 5% de CO2, por 72 h.
- Para mudar para a cultura de interface ar-líquido (ALI), no terceiro dia após a semeadura, remova o meio do lado basolateral primeiro, depois do lado apical. Ao lado basolateral, adicione 500 μL de MEM fresco e mude o meio a cada dois dias até que as células formem uma monocamada confluente.
NOTA: Para as condições utilizadas neste protocolo, as células CFBE41o- geralmente são confluentes após 3-7 dias na cultura. - Avalie as propriedades da barreira epitelial no dia 7 incubando CFBE41o- células com 500 μL de meio celular no lado apical e 1,5 mL no lado basolateral por 1h, a 37°C abaixo de 5% de CO2.
- Medir as propriedades da barreira através da resistência elétrica transepitenelial (TEER), com um eletrodo de pauzinho STX2 e um volt-ohmmeter epitelial; depois de 7 dias este é superior a 300 Ω×cm².
NOTA: Eventualmente, em algumas pastilhas de membrana, as células têm teer baixo. Portanto, não são utilizadas pastilhas permeáveis com TEER < 300 Ω×cm².
- Para cultivar células THP-1, plante-as em um frasco T75 usando 13 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio suplementado com 10% de FCS, e incubar a 37°C abaixo de 5% de CO2. Células divididas a cada segundo dia semeando células 2 x 106 células/mL em um novo frasco T75.
NOTA: As células THP-1 não diferenciadas são cultivadas como monócitos em suspensão.- Diferencie as células THP-1 da seguinte forma. Cento destoe de um T75 a 300 x g por 4 min. Descarte o supernasce, resuspenque a pelota em meio fresco e coloque em um novo T75. Adicione 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) incubar as células em RPMI por 48 h a 37 °C e 5% de CO2 atmosfera15.
NOTA: Após a diferenciação com o PMA, as células não se proliferam mais e se prendem ao frasco. - Para desprender células semelhantes ao macrófago THP-1, lave uma vez com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a 37 °C e incubar com 3 mL de solução de descolamento celular (por exemplo, accutase) contendo 0,5 mM EDTA por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Inspecione as células sob um microscópio invertido para procurar o destacamento celular. Adicione 7 mL de meio fresco e centrífuga a 300 x g por 4 min no RT.
NOTA: Os macrófagos também podem ser destacados com trippsina-EDTA, 37 °C por 20 min. No entanto, a trippsina é mais dura aos macrófagos do que a solução de descolamento celular escolhida (ver Tabela de Materiais). - Depois de remover o supernasce, suspenda derrese as células macrófagos em 3 mL de meio THP-1 em um tubo cônico de 15 mL, conte as células conforme descrito em 1.1.2. e incubar por uma máxima de 1h a 37 °C abaixo de 5% de CO2 antes de configurar a co-cultura.
NOTA: As células THP-1 em suspensão podem ser manchadas com corantes de viabilidade para a imagem da co-cultura ainda mais. Nesta etapa, utilize o procedimento abaixo (etapa 1.2.5). - Macrófagos de manchas com 10 μM de um corante de viabilidade celular (baseado na conversão de moieties de acetato por esterases intracelulares, ver Tabela de Materiais) em que 3 μL do corante de viabilidade celular é aplicado à suspensão da célula. Incubar células por 20 min a 37 °C, 5% DE CO2, depois lave 1x com PBS 37°C para remover o corante.
NOTA: Centrifugar as células para remover o corante a 300 x g por 4 min a temperatura ambiente (RT).
- Diferencie as células THP-1 da seguinte forma. Cento destoe de um T75 a 300 x g por 4 min. Descarte o supernasce, resuspenque a pelota em meio fresco e coloque em um novo T75. Adicione 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) incubar as células em RPMI por 48 h a 37 °C e 5% de CO2 atmosfera15.
2. Estabelecimento de uma co-cultura epitelial-macrófago em suportes permeáveis
- Use CFBE41o- monocamadas em ALI com TEER ≥ 300 Ω×cm² (etapa 1.1.6.). Retire o meio da câmara inferior, inverta cuidadosamente o suporte dentro de uma placa de vidro estéril de Petri (50 mm x 200 mm), e remova as células sobreessaladas através dos poros de membrana na parte inferior da membrana usando um raspador de células.
NOTA: Devido ao tamanho dos poros de 3 μm, as células epiteliais tendem a crescer através dos poros em direção ao lado basolateral. Portanto, é preciso removê-los antes de adicionar os macrófagos deste lado. CFBE41o- as células epiteliais pulmonares podem ser manchadas nesta etapa. O procedimento na etapa 1.2.5 pode ser utilizado; no entanto, em vez de uma suspensão celular, a solução de corante no MEM é aplicada (500 μL lado apical) apenas nas células aderidas no suporte permeável. - Use 2 x 105 células/poço (em 200 μL de RPMI) da suspensão celular de macrófagos THP-1 diferenciados pelo PMA e coloque as células no lado basolateral das pastilhas invertidas.
- Feche as placas de Petri cuidadosamente e incubar por 2h a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Coloque as pastilhas de volta nas microplatas de 12 poços e adicione 500 μL de meio MEM no lado basolateral da inserção permeável para manter as condições de ALI. As células estão prontas para infecção.
3. Infecção por P. aeruginosa
NOTA: Todos os passos a seguir devem ser feitos em um laboratório de biossegurança nível 2 (BSL2).
- Inoculação 15 mL de caldo de lysogeny (LB) suplementado com 300 μg/mL ampicillin em um frasco de Erlenmeyer (50 mL) com uma única colônia de P. aeruginosa PAO1-GFP.
NOTA: Outras cepas de P. aeruginosa também poderiam ser usadas aqui, por exemplo, tipo selvagem PAO1, PA14, ou cepas clínicas, seguindo seus próprios protocolos de cultivo. - Incubar a bactéria por 18 h a 37°C, tremendo a 180 rpm.
- Transfira o conteúdo após as 18h para um tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 3850 x g por 5 min. Descarte o supernaspe e adicione 10 mL de PBS estéril a 37°C.
- Meça a densidade óptica em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm e ajuste a concentração de bactérias usando o meio de cultura celular para uma concentração final de 2 x 105 UFC/mL. Isso corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) de uma bactéria por célula epitelial.
- Adicione 100 μL de suspensão bacteriana ao lado apical do suporte permeável (etapa 2.4.) e incubar a 37 °C sob 5% de CO2 por 1 h, para permitir o apego de bactérias às células. Em seguida, remova o líquido apical cuidadosamente com uma pipeta para restaurar as condições de ALI. Mantenha algumas amostras não infectadas como controle.
NOTA: Nesta fase, as bactérias anexadas devem ser emplacar em ágar LB (ver passos 5.4/5.5) para determinar o inóculo das bactérias iniciais. - Incubar a droga de interesse após a adesão bacteriana nas células. Para experimentos de tratamento, adicione 500 μL de uma solução medicamentosa diluída em meio celular (neste protocolo foi utilizada tobramycina 6 μg/mL) ao lado apical. Adicione 1.500 μL de meio celular sem droga no lado basolateral.
NOTA: Em vez de incutir as drogas como solução, o modelo também pode ser adaptado à deposição aerossol. Para tais efeitos, as células em ALI são alimentadas do lado basolateral com 500 μL de meio celular. A droga é então nebulizada e permitida a depósito no compartimento apical por um dispositivo apropriado (não descrito aqui). A amostra infectada e tratada pode ser verificada para os pontos finais descritos nas seções 4-7. A partir deste passo, suportes permeáveis podem ser usados para criar imagens (seção 4) ou para obter resultados de crescimento de bactérias e viabilidade celular de mamíferos, entre outros (seções 5-7).
4. Preparação da amostra para microscopia de varredura a laser confocal (CLSM)
- Após o estabelecimento da cocultura, infecção e tratamento medicamentoso, remova todos os meios do lado apical e basolateral. Lave 1x com PBS a 37°C e, em seguida, fixe as células com 3% de paraformaldeído (PFA) por 1 h a RT (300 μL em apical/600 μL no basolateral). Os núcleos celulares são manchados com 5 μg/mL de DAPI-PBS por 30 minutos à temperatura ambiente.
ATENÇÃO: A PFA é perigosa. - Corte as membranas usando um bisturi e coloque-as entre duas lâminas de tampa de microscopia de 12 mm usando um meio de montagem (ver Tabela de Materiais). Deixe secar dentro do banco de fluxo por 30 minutos antes de armazenar a 4 °C. Visualize por microscopia de varredura confocal.
NOTA: Após a cocultura e antes da montagem, podem ser realizadas junções apertadas de imunossuagem. Para isso, as células são fixadas com paraformaldeído 3% por 30 min, lavadas novamente com PBS, e permeabilizadas com saponia 0,05%/BSA 1% em PBS. Neste protocolo, a proteína de oclundos de zonula (ZO-1) foi detectada através de anticorpo zo-1 anti-humano de camundongos (1:400, incubação a 4 °C durante a noite). As amostras foram então incubadas por 2 h no RT com anticorpo igG anti-rato de cabra Alexa Fluor 633 (1:2000 em vermelho). Os núcleos foram manchados com DAPI (1 μg/mL) e montados com meio de montagem em tampas. - Use um microscópio confocal para fotografar as membranas armazenadas. Escolha 25x ou 63x objetivos de imersão em água e lasers em 405, 488, 505 ou 633 nm para detecção. As imagens devem ter uma resolução de 1024 x 1024 pixels.
NOTA: Os lasers são escolhidos de acordo com a mancha utilizada. - Adquira visualizações apical e seção transversal e use o modo zeta-stack (10-15 pilhas) para a construção de um modelo tridimensional usando software de imagem.
5. Medição da proliferação bacteriana através de unidades formadoras de colônias (UFC)
- Colete o meio apical e basolateral (contendo bactérias) para avaliar a UFC de bactérias não ligadas. Colete 500 μL dos lados apical e basolateral e junte-os.
NOTA: Use esta suspensão diretamente para contar bactérias (etapa 5.4) ou centrífuga a 21.250 x g por 10 minutos para avaliar lactato desidrogenase (LDH) do supernascido (seção 6) e/ou re-suspenso em PBS para contar bactérias extracelulares (passo 5.4). - Avalie a sobrevivência de bactérias presas e/ou internalizadas nas células adicionando 500 μL de água fria estéril deionizada em cada compartimento do suporte permeável. Incubar células por 30 minutos em temperatura ambiente.
NOTA: As amostras podem ser banhadas em ágar LB (ver passo 5.4) ou congelado (como placa de inserção inteira) a -20 °C para chapeamento mais tarde. - Para avaliar a UFC de bactérias aderentes/internalizadas, descongele as amostras a 37°C por 10 minutos (se congelados). Usando pontas de pipeta para cada poço, raspe a superfície da membrana e a pipeta para cima e para baixo para remover todo o conteúdo aderido.
NOTA: Nesta etapa, todas as células epiteliais são líricas e bactérias aderidas/internalizadas estão disponíveis como suspensão a ser emplacado. - Com a suspensão bacteriana de ambas as frações, realize uma diluição serial de 1/10 usando Tween-80 0,05% em PBS e emplaque as bactérias em placas de ágar LB.
NOTA: Recomenda-se diluições entre 1 a 10. As bactérias devem ser contadas na maior diluição, onde colônias únicas são identificadas pela primeira vez. - Incubar placas de ágar a 30°C por 16-72 h para contar colônias, e calcular a UFC em conformidade.
NOTA: Uma temperatura de 30°C no momento da incubação da placa é essencial para as amostras tratadas e para observar o crescimento atrasado das colônias.
6. Avaliação da citotoxicidade celular via ensaio de lactato desidrogenase
- Use o supernatante de células infectadas contendo bactérias (a partir da etapa 5.1) para avaliação de viabilidade celular para o ensaio LDH16. Centrifugar o supernante a 21.250 x g por 10 minutos para pelotar as bactérias e, eventualmente, o resto das células. Use o supernanato livre de bactérias para medir a liberação de LDH.
NOTA: O supernazio não deve ser congelado antes de medir o LDH por este ensaio. - Transfira 100 μL do supernante para uma placa de 96 poços e adicione 100 μL da solução de ensaio LDH (veja a Tabela de Materiais). Incubar à temperatura ambiente por 5 minutos no escuro, depois ler absorvente a 492 nm.
7. Avaliação da liberação de citocinas humanas
- Para quantificação de citocinas, use o imunoensaio de matriz de contas ELISA ou citométrico17(ver a Tabela de Materiais). Para isso, a centrífuga supernasal a partir da etapa 5.1 a 21.250 x g por 10 min e mede imediatamente ou armazena -80 °C por até 15 dias até a análise.
- Avalie os supernantes com um kit ELISA disponível comercialmente.
NOTA: O procedimento segue as instruções de fabricação, que incluem o revestimento das placas com o anticorpo de captura, adição das amostras (100 μL) e normas de citocina, incubação, lavagem e adição de anticorpos de detecção para fornecer uma medição colorimétrica da presença de citocinas. Alternativamente, a citometria de fluxo pode ser usada para medir citocinas através de kits disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
A Figura 1A mostra a morfologia da co-cultura resultante das células epiteliais e macrófagos brônquicos humanos depois de crescer tanto por 24 h no lado apical e basolateral de suportes permeáveis, respectivamente. A integridade da barreira epitelial é mostrada por TEER (834 Ω×cm2) e CLSM por imunostaining para a proteína de junção apertada ZO-1 (Figura 1B). Os mesmos resultados observados em termos de integridade de barreira de CFBE41o não infectado- a monocultura pôde ser vista nas co-culturas epiteliais-macrófagos não infectadas.
Para modelar uma infecção bacteriana, P. aeruginosa foi inoculada em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1:1 em células CFBE41o- - células. Seis horas após a infecção(Figura 2A),macrófagos foram observados no lado apical da co-cultura. Após a infecção, o TEER caiu de 834 para 250 Ω×cm2,indicando uma barreira epitelial comprometida, também visualizada pela coloração ZO-1(Figura 2B).
A Figura 3 mostra a transmigração de macrófago através dos poros de membrana permeável e da absorção de bactérias por células THP-1 no lado apical. As amostras foram fixadas em 1, 3 e 6 h pós-incubação de experimentos independentes. Nas monoculturas THP-1 (Figura 3A-C),a migração de macrófagos foi observada já em 1h, enquanto na co-cultura (Figura 3D-F), isso foi observado após a infecção de 3h. A absorção de bactérias no THP-1 foi observada após 3h de infecção, tanto na monocultura quanto na cocultura. Nenhuma captação bacteriana pelo CFBE41o- foi vista. Foram colocadas visões transversais de tal forma que o suporte de membrana permeável estava no meio como uma separação do compartimento apical e basolateral.
A Figura 4 mostra imagens de microscopia a laser de coculturas infectadas (CFBE41o- + THP-1) tratadas com ou sem tobramicina por 6 h (Figura 4A, B) ou 20 h(Figura 4C,D). Sem tratamento, tanto as células epiteliais quanto os macrófagos morreram após 20h de infecção(Figura 4C). No entanto, após o tratamento da tobramicina, as células hospedeiras são preservadas após 20 h; ainda assim, algumas bactérias podem ser observadas na cultura. Apesar de ter sido observada após 6h de tratamento nas imagens de microscopia(Figura 4B),a bactéria não se proliferou como observado nos ensaios da UFC na Figura 4E. No entanto, após o tratamento de 20h, a bactéria recuperou a capacidade de proliferação, como visto pelas colônias no ensaio da UFC (Figura 4F). O protocolo de lise celular com água fria e raspagem pode liberar bactérias presas e possivelmente internalizadas nas células. Ao mesmo tempo, as células são destruídas(Figura Suplementar S1A, B). As etapas de centrifugação utilizadas neste artigo para células epiteliais (300 x g) ou bactérias (21.250 x g) não dificultaram a viabilidade de ambas(Figuras Suplementares S1C, D). Todos os ensaios da UFC foram realizados congelando as amostras a -20°C, seguidos de descongelamento e revestimento. Este procedimento reduziu o número de bactérias em 2 toras, em comparação com amostras frescas(Figura Suplementar S1E). Como esse procedimento é feito simultaneamente para todos os grupos experimentais (tratados e não tratados) em diferentes momentos, essa redução será incorporada nos resultados finais (Figura Suplementar S1E). Além disso, a concentração de tobramicina utilizada aqui não mostrou toxicidade para as células não infectadas (Figura Suplementar S2A) e também nenhuma resposta inflamatória adicional(Figura Suplementar S2B). No entanto, estava dentro do intervalo da concentração inibitória mínima para matar P. aeruginosa.
A Figura 5 mostra a resistência elétrica transeptelial (TEER) e a viabilidade celular. A Figura 5A-B ilustra o TEER das monoculturas e co-culturas. A co-cultura do CFBE41o- células com THP-1 não induziu qualquer alteração na integridade da barreira epitelial em comparação com a monocultura (barras vermelhas). Após a infecção, o valor do TEER caiu (barra verde). Após 1h de infecção, algumas amostras foram tratadas com tobramicina antibiótico (barra azul), por 6 ou 20 h. O tratamento preservou a integridade da barreira epitelial, como observado pelo TEER superior. A Figura 5C mostra a porcentagem de liberação de LDH como indicação de toxicidade celular após infecção e tratamento de tobramicina após 6h. A própria cocultura induziu a liberação do LDH, que foi o mesmo para as células infectadas (cerca de 20%). Após 20h de infecção, nenhum sinal de LDH foi detectado. Para comprovar a confiabilidade do LDH para infecção a longo prazo, o PAO1-GFP foi incubado em média com e sem LDH 1 U/mL em comparação com os respectivos controles não infectados(Figura Suplementar S2C). O sinal LDH foi perdido após incubação prolongada (20 h) com P. aeruginosa,indicando que o LDH só é estável em tempos de incubação mais curtos em culturas infectadas.
A Figura 6 mostra a cinética das citocinas pró-inflamatórias detectadas via ELISA. A vantagem de uma cocultura infectada das células CFBE41o e THP-1 foi observada com as maiores. secreções de citocinas pró-inflamatórias. A secreção de algumas citocinas pró-inflamatórias foi semelhante (IL-6) ou superior (IL-8, TNF-α, IL-1β) na cocultura infectada(Figura 6C) do que nas monoculturas correspondentes(Figuras 6A-B). Inesperadamente, algumas citocinas em monoculturas THP-1 (Figura 6B) são reguladas em amostras infectadas (Il-8, TNFα, IL-1β).
A Figura 7 demonstra a liberação de citocinas em mono-e co-culturas após infecção e tratamento com tobramicina medida via fluorescência ativada de classificação celular (FACS). A secreção da citocina pró-inflamatória IL-8 (Figura 7A) e da citocina anti-inflamatória IL-10 (Figura 7F) foi maior nas co-culturas de células epiteliais e macrófagos, em comparação com as monoculturas. No entanto, para todas as outras citocinas (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 e GM-CSF) (Figuras 7B-E), os níveis de secreção de citocina não foram maiores na co-cultura que nas respectivas monoculturas.
Figura 1: Seções transversais e visões apical da co-cultura epitelial-macrófago não infectada. (A) Vistas cruzadas da co-cultura epitelial-macofagida não infectada 24 h. CFBE41o- vermelho manchado, macrófagos THP-1 em amarelo e núcleos em azul (DAPI). (B) Visões apical das imuno-camadas CFBE41o não infectadas para ZO-1 (vermelho). Núcleos. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Seções transversais e visões apical da co-cultura epitelial-macrófago infectada. (A) Vistas cruzadas e (B) visão apical da cocultura epitelial-macrófago a 6h pós-infecção (hpi) com P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- manchado em vermelho, macrófagos THP-1 em amarelo, núcleos em azul (DAPI) e P. aeruginosa PAO1-GFP em verde. (B) Visões apical da 6 h infectada CFBE41o-monocamada. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cinética da transmigração de macrófago e captação de bactérias visualizadas por seção transversal do modelo 3D. Cinética de infecção PAO1-GFP em monoculturas de macrófagos THP-1 (A-C) ou co-cultura(D-F). Os macrófagos THP-1 estão manchados em vermelho, núcleos de células epiteliais em azul (DAPI), e P. aeruginosa em verde (GFP). Cada figura é dividida em lados apical e basolateral, o espaço entre eles é considerado como a membrana, que é vazia ou ocupada pela cfbe41o- camada confluente (D-F). As inserções nas figuras mostram a absorção de bactérias por macrófagos em diferentes momentos (A-F). Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização da sobrevivência pao1-GFP em co-cultur tratado com tobramicinae. (A-D) microculturas confocal com e sem tratamento. (A) Co-cultura não tratada após 6h de infecção. (B) Cocultura infectada tratada com tobramicina 6 μg/mL (Tob) por 6 h. (C) Co-cultura não tratada 20 h pós-infecção, (D) co-cultura infectada tratada com tobramicina 6 μg/mL por 20 h. Núcleos manchados com DAPI (azul), macrófagos (vermelho) e P. aeruginosa GFP (verde). (E) Unidades formadoras de colônias (UFC) de bactérias aderentes/internalizadas após 6 e (F)20 h com tratamento de tobramicina 6 μg/mL. A pastilha de membrana vazia foi usada como substrato abiótico para cultivar PAO1-GFP. Foi utilizado O ANOVA bidirecional com o teste de comparações múltiplas de Tukey (# sem colônias), *p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001; ns: não significativo. As barras de erro indicam desvio padrão, n = 9-27 réplicas de 3-9 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Integridade da barreira e avaliação da viabilidade da monocultura e cocultura. Foram avaliadas as seguintes condições de cocultura: não infectadas (barras cinzas), infectadas (barras verdes) ou infectadas e tratadas com tobramicina (barras azuis). (A) Resistência elétrica transeptelial após 6h e (B) 20 h de infecção em monoculturas (CFBE41o- e THP-1) e co-cultura. (C) Citotoxicidade da monocultura e cocultura medida via liberação LDH 6 h pós-infecção. Foi utilizado o teste de comparações múltiplas da ANOVA com o teste de comparações múltiplas da Tukey; *p < 0,05; p < 0,0001; ns: não significativo. As barras de erro indicam desvio padrão; n = 9 réplicas de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Cinética da liberação de citocinas de supernantes mono-e-cultura não infectados e infectados avaliados via ELISA. A ELISA foi feita de acordo com o protocolo do fabricante do kit. (A) CFBE41o-, (B) THP-1, e (C) co-cultura lançando IL-8, TNF-α, IL-1β e IL-6. As barras de erro indicam desvio padrão. n = 6 réplicas de 2 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Resultados supernacantes do painel citocina medido via FACS com e sem tobramicina 6 μg/mL para 6 h pós-infecção. Supernatantes de mono-e co-cultura após 6 h pós-infecção utilizados para analisar as respectivas citocinas IL-8 (A),IL-1α(B),IL12p40(C),IL-23(D),GM-CSF(E) e IL-10(F). A barra de erro indica desvio padrão, n = 9 réplicas de 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Controle experimentos para etapas críticas do protocolo. (A, B) Micrografos de células CFBE41o em placas de 24 poços cultivados por 2 dias em densidade de 2 x 105 células/poço. (A) CÉLULAS CFBE41o-células em PBS por 30 min, e (B) células tratadas com água após 30 minutos após raspar com uma pipeta. (C) Viabilidade das células mamíferas após a centrifugação. As células CFBE41o-cell foram removidas do frasco de cultura celular T75, conforme descrito na etapa 1.1.1 e 1.1.2. 100 μL de suspensão celular resultante foi analisado em solução isotônica de 10 mL. Um contador automatizado de células foi usado para avaliar a viabilidade de células únicas. Em seguida, as respectivas suspensões celulares foram centrifugadas a 300 x g por 4 min, re-suspensas e contadas novamente. As barras de erro indicam desvio padrão, n = 6 frascos diferentes de 2 experimentos individuais. (D) Viabilidade de PAO1-GFP após centrifugação. As bactérias PAO1-GFP foram diluídas para OD = 0,01 no meio celular. A UFC foi avaliada por meio de uma linha de diluição de 10 vezes e placas LB incubadas durante a noite a 30 °C. Os respectivos tubos plásticos foram centrifugados a 21.250 x g por 10 min e reinseridos em médio. A UFC foi avaliada em conformidade novamente. Teste t de aluno de duas caudas, * p < 0,033. A barra de erro indica desvio padrão, n = 6 de 2 experimentos. (E) Viabilidade de bactérias após o congelamento. As bactérias PAO1-GFP foram preparadas como em (D) e a UFC foi analisada, em seguida, os tubos plásticos foram congelados por um dia a -20 °C e descongelados para avaliar a UFC novamente. Teste t de dois caudas do aluno, *** p < 0,001. As barras de erro indicam desvio padrão, n = 6 de dois experimentos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Experimentos de controle para avaliar o comportamento LDH e influência da tobramicina. (A) Experimento de controle para avaliar a citotoxicidade após 20 h de incubação com tobramicina de 6 μg/mL. Mono-e co-cultura foi feita como descrito no protocolo, mas as células foram cultivadas por 2 dias em placas de 24 poços e as células THP-1 foram semeadas apicamente. Células com tobrammicina de 6 μg/mL ou controles foram incubadas por 20 h. One-Way ANOVA, teste de múltiplas comparações de Tukey, *** p < 0,001. A barra de erro indica desvio padrão, n = 6 de 2 experimentos (CFBE41o-), n = 3 de um experimento (THP-1 e co-cultura). (B) Controle-ELISA de supernaciantes de mono-e co-cultura com/sem tobramicina. A cultura celular foi feita de acordo com (A) para não mostrar nenhuma liberação de citocina em comparação com os controles para todas as condições. ELISA foi feita nas etapas 7.1 e 7.2, 10 μg/mL (LPS) foi adicionada como controle, a liberação il-8 para controles tratados com LPS contendo THP-1 foi maior do que detectável. ANOVA bidirecional, teste de múltiplas comparações da Tukey, ns p > 0,12; * p < 0,033; p < 0,001. As barras de erro indicam desvio padrão, n = 6 de dois experimentos, n = 3 de um experimento (controle LPS). (C) degradação do LDH devido à proliferação excessiva de PAO1-GFP. LDH foi adicionado na concentração de 1 U/mL ao MEM Medium. Ou o meio LDH ou o meio de controle foram utilizados para diluir células para OD = 0,01 (corresponde a 1 x 108 CFU/mL) e, em seguida, incubado por 20 h. O ensaio LDH foi feito conforme descrito na seção 6. One-Way ANOVA, teste de múltiplas comparações da Tukey, ns p > 0,12; p < 0,001. A barra de erro indica desvio padrão, n = 8-9 de três experimentos individuais. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este artigo descreve um protocolo para uma cocultura 3D das vias aéreas infectadas, constituída pela linha de células epiteliais anfíquiis císticas humanas CFBE41o- e a linha de células macrófagos derivadas do monocito humano THP-1. O protocolo permite a avaliação da integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos, sobrevivência de bactérias e inflamação, que são parâmetros importantes ao testar a eficácia da droga e as respostas do hospedeiro simultaneamente. A novidade no modelo está na incorporação de células epiteliais (ou seja, linha celular e macrófagos humanos) com infecção bacteriana aguda (ou seja, P. aeruginosa). A infecção aguda nas células epiteliais é demonstrada como controlada por um antibiótico (ou seja, tobramicina). Além do uso de uma linha celular CF humana, todo o modelo é configurado em condições ALI, o que é consideravelmente mais próximo das condições fisiológicas em CF. O uso de uma linha celular CF implementa algumas das características da doença no modelo. A mutação do regulador de condutância de fibrose cística transmembrana (CFTR) está diretamente relacionada à desregulação do transporte de fluidos epiteliais nos pulmões. Além disso, mutações no gene CF, como o ΔF508, resultam em muco espesso, com inflamação e danos pulmonares graves após infecção com P. aeruginosa4. Essas manifestações patológicas causadas pelo CFTR disfuncional potencialmente envolvem o comprometimento da autofagia como importante mecanismo celular associado à patogênese da doença pulmonar CF18. No entanto, o CFBE41o- não consegue segregar o muco, que é uma limitação desta linha celular. Se pretende estudar o papel do muco mais especificamente, o protocolo pode ser adaptado usando outras linhas de células brônquicais (por exemplo, Calu-3).
Um passo crítico para configurar este protocolo é a combinação de células epiteliais e imunes e a infecção subsequente com P. aeruginosa na ALI. A infecção de CFBE41o- por P. aeruginosa in vitro já foi descrita, principalmente usando uma câmara de célula de fluxo, suplementada com arginina na mídia cultural, para melhorar a sobrevivência das células epiteliais e apoiar a formação de biofilme19. O presente protocolo visava um novo modelo utilizando apenas células humanas, que, além disso, poderiam ser cultivadas em ALI em pastilhas de bem permeáveis para maior rendimento amostral. A inclusão de macrófagos diferenciados THP-1 como linha celular imortalizada humana, em vez de depender da obtenção de células primárias reprodutíveis de doadores, é outra vantagem do nosso modelo. Adicionando esses macrófagos ao lado basolateral do suporte de membrana permeável, observou-se que macrófagos se projetavam e eventualmente transmigravam para o lado apical da barreira epitelial cultivada pelo filtro. Uma variação deste protocolo pode ser a adição de macrófagos diretamente no lado apical em cima das células epiteliais, como descrito por Kletting et al. 14. A co-cultura de células imunes e pulmonares não humanas já foi descrita antes. Ding et al. 10 células de carcinoma pulmonar usados de Lewis em suportes de inserção permeável em combinação com macrófagos no lado basolateral e infectados com S. aureus, outro patógeno crítico de infecção crônica em pacientes cf. No entanto, neste estudo, não houve foco na fibrose cística ou no uso da cocultura como plataforma para avaliação da eficácia da droga. Nosso protocolo pode ser adaptado para outras infecções bacterianas, como Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, ou Burkholderia cepacia— patógenos importantes no pulmão CF.
Outro passo crítico é a adição de macrófagos THP-1 às células, invertendo as pastilhas permeáveis de cabeça para baixo (seção 2). Isso é crucial para avaliar a transmigração de macrófago através do poço para o lado da infecção. O processo de imagem posterior dos modelos 3D com pilhas z e visão transversal pode ser realizado para observar o interior dos macrófagos e detectar a absorção de bactérias(Figura 3). A 1 hpi, as bactérias aplicadas no lado apical migram através da membrana, enquanto a migração e absorção de macrófagos só ocorrem a 3 hpi. Portanto, após 1h de infecção, foi apropriado iniciar o tratamento com tobramicina e ter a possibilidade de abordar a sobrevivência de células hospedeiras e bactérias por um longo período (20 h). No curso do protocolo, manter a esterilidade é uma questão crítica devido à multiplicidade de etapas que cada um carrega o risco de contaminação. No entanto, o pessoal experiente da cultura celular poderá seguir este protocolo após a preparação e treinamento adequados. O meio celular deve ser verificado regularmente para contaminação, de preferência após todas as etapas críticas.
Como em qualquer modelo, a cocultura infectada também tem algumas limitações; por exemplo, a integração das células semelhantes ao macrófago. Aqui, era importante ter macrófagos no lado basolateral; no entanto, a manipulação da inserção com uma camada epitelial previamente cultivada pode ter proporcionado danos precoces e distúrbios à co-cultura. Embora, o modelo de suporte permeável forneceu características de alto rendimento, o que não foi observado em co-culturas anteriores do pulmão infectado cf20,21. Com isso, outros experimentos precisam avaliar as limitações do uso do THP-1 como substituto do macrófago. Embora esta linha celular seja amplamente utilizada, ela é menos responsiva ao LPS22 e não tem ativação total e toda a população não é diferenciada de monócitos para células macrófagos23. Outra limitação é a falta de outros componentes-chave na infecção por CF e na entrega de medicamentos. A linha cfbe41o- celular não possui cílios nem produz muco, o que geralmente acontece de 20 a 30 dias de cultura celular na ALI. Como este não era o caso para CFBE41o- linha celular, usamos as células após sete dias quando uma barreira epitelial apertada foi formada. O desembaraço mucociliary altera as condições de residência para micróbios24 ou partículas de drogas9,,25 e modelos in vitro que avaliam a deposição pulmonar devem levar isso em conta. Diferentemente do observado por outras células, a cultura tecidual insere revestimento com um material de matriz extracelular (como fibronectina ou colágeno I) não mostram diferença significativa para CFBE41o-, por exemplo, no TEER26. Portanto, os filtros permeáveis não foram revestidos com um material de matriz extracelular neste protocolo.
Com o protocolo descrito aqui, mono e co-culturas após a infecção de 6 h fornecem liberação suficiente de citocina para ser usado como medida em futuros testes de drogas. A co-cultura traz uma vantagem da cooperação celular na modelagem da resposta imune. A ineficácia da tobramicina na redução da inflamação era esperada, uma vez que nem todas as bactérias foram eliminadas durante o tratamento (Figura 4E, F). No entanto, modelar a resposta à tofiliccina em um modelo CF é crucial, pois a tobramicina (em concentrações mais elevadas) pode ser eficaz na inibição de P. aeruginosa, mesmo no biofilme19,27. Uma possibilidade de uso adicional deste protocolo é integrar medicamentos anti-inflamatórios no tratamento. A recomendação geral em relação às respostas inflamatórias seria o uso do tratamento de curta duração (6h), que ainda tem a célula hospedeira e as bactérias presentes. Após esse ponto de tempo, as células hospedeiras são destruídas em amostras não tratadas. Tanto ELISA quanto FACS poderiam ser usados para medir a liberação de citocinas. Finalmente, se as amostras forem armazenadas por mais de 15 dias a -80 °C, recomenda-se verificar a confiabilidade das citocinas usando, por exemplo, controle positivo de amostras frescas (por exemplo, células estimuladas com LPS).
Algumas modificações do protocolo são possíveis. Por exemplo, o protocolo atual pode ser expandido para a aplicação de medicamentos nebulizados (etapa 3.6). Isso é necessário para modelar o fornecimento de drogas pulmonares através da inalação oral. A nebulização de medicamentos solúveis em água, como a tobramicina, ou nano-portadores, como a colistina liposômica, é relativamente direta por dispositivos comercialmente disponíveis rotineiramente usados na clínica. Além disso, existem vários dispositivos disponíveis comercialmente para depositar aerossóis em inserções de cultura celular. Além disso, como o modelo aqui descrito é baseado em suportes de membrana permeáveis, também poderia ser adotado em alguns dispositivos microfluidos contemporâneos (por exemplo, "pulmão em um chip"), por exemplo, para estudar a influência da respiração e o alongamento mecânico relacionado e alterações no fluxo de ar. Além disso, este protocolo poderia ser modificado pela adição de muco ou substituição por células primárias, dependendo da questão científica a ser abordada. Outro passo interessante seria o teste de nanomedicinas, especialmente porque a nanotecnologia está progredindo no desenvolvimento de novos anti-infecciosos28, corretivos CF29 e co-entrega de antibióticos e pathoblockers30. No geral, o protocolo atual pode ser percebido como útil na avaliação da sobrevivência bacteriana após o tratamento com antibióticos em um sistema complexo, juntamente com algumas leituras relacionadas ao hospedeiro: citotoxicidade celular, integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos e resposta inflamatória. Estes são parâmetros essenciais para o desenvolvimento de medicamentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho recebeu financiamento do Programa HORIZON 2020 da União Europeia para pesquisa, desenvolvimento tecnológico e demonstração sob o acordo de subvenção nº 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Design e Desenvolvimento de Nanomedicinas avançadas para superar barreiras biológicas e tratar doenças graves. Agradecemos à Dra Ana Costa e à Dra. Agradecemos também a Chelsea Thorn por revisar nosso manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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