Summary
我々は、CFBE41o-細胞、THP-1マクロファージ、および空気液体界面-で確立された緑膿菌を用いて、感染した気道の3次元共培養モデルのプロトコルについて説明する。このモデルは、抗生物質の有効性、上皮バリア機能、および炎症マーカーを同時にテストするための新しいプラットフォームを提供します。
Abstract
肺感染症の治療のためのfDrug研究は、高い複雑さのイン ビトロ モデルの予測に向かって進んでいます。肺モデルにおける細菌の多面的存在は上皮配列を再適応させることができ、免疫細胞は微小環境における細菌に対する炎症反応を調整する。 生体内 モデルは嚢胞性線維症の文脈で新しい抗感染薬をテストするための選択であったが、彼らはまだヒトにおけるそのような疾患の インビボ 状態および治療結果を正確に模倣していない。ヒト細胞(気管支上皮およびマクロファージ)および関連する病原体に基づく感染気道の複雑な in vitro モデルは、このギャップを埋め、新しい抗感染薬のクリニックへの翻訳を容易にする可能性がある。このような目的のために、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41oと THP-1単球由来マクロファージの共培養モデルが確立され、空気液体界面(ALI)状態における 緑化 症によるヒト気管支粘膜の感染を模倣した。このモデルは7日間で設定され、次のパラメータが同時に評価されます:上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症。本プロトコルは、新しい抗感染薬の発見と肺へのエアロゾル送達の最適化に関連する可能性のある薬物有効性および宿主応答を評価するための堅牢で再現可能なシステムを記述する。
Introduction
緑膿菌 は、肺組織障害に寄与する嚢胞性線維症(CF)に関連する病原体である。アルギン酸および他の粘液性エキソ多糖などの多糖類の生産は、粘り強い細菌の付着をもたらす疾患の進行を調整し、細菌への抗生物質の送達を制限し、宿主免疫系2に対して細菌を保護する。 P.緑素症 の段階からバイオフィルム形成への移行は、この文脈において重要な問題であり、また抗生物質耐性の発生を促進する。
CFのコンテキストでは、マウスは主にモデルとして使用されています。しかし、マウスはCF変異3の導入により、この疾患を自発的に発症しない。細菌バイオフィルムの開発および薬物感受性の研究のほとんどは、ペトリ皿などの生物的表面で行われてきた。ただし、この方法は in vivoの複雑さを表すものではありません。例えば、免疫細胞や粘膜上皮を含む重要な生物学的障壁は存在しない。P.緑素吸い道は上皮細胞に非常に有毒であるが、いくつかのグループは、ヒト気管支細胞と以前のP.緑素吸膜を共同培養することができました。これらの細胞は、CFTR突然変異を有する嚢胞性線維症患者(CFBE41o-細胞)4に由来し、抗生物質有効性5を評価するか、または感染時にCFTRタンパク質の補正を評価することを許可した6。-このようなモデルは、薬剤の有効性の予測可能性を向上させることが示されたが、薬剤開発の後の段階で失敗した薬物の問題の特徴付けを可能にすることに加えて7。
しかし、肺では、粘膜上皮が空気にさらされる。また、気道に存在する免疫細胞は、組織マクロファージのように、吸入病原体または粒子8に対して必須の役割を果たす。マクロファージは、気管支内腔に到達し、感染と戦うために異なる細胞層を介して移動します。さらに、吸入薬物はまた、肺空気・血液関門9の追加の非細胞元素としての粘液の存在に対処しなければならない。実際、インビボの関連性を高め、いくつかの複雑な3次元(3D)インビトロモデルが開発されました。共培養システムは、創薬のためのin vitroシステムの複雑さを高めるだけでなく、細胞と細胞の相互作用を研究することを可能にします。このような複雑さは、マクロファージ遊走10に関する研究において取り組み、好中球11による抗菌ペプチドの放出、感染における粘液の役割9、及び上皮細胞反応を過剰損傷12に対する。しかし、CFの遺伝子変異を特徴とする信頼性の高いCF感染型インビトロモデルは、空気にさらされ(生理学的状態が増加する)、免疫細胞を統合することは依然として欠けている。
このギャップを埋めるために、我々は、感染した気道の安定したヒト3D共培養のためのプロトコルを記述する。このモデルは、ヒトCF気管支上皮細胞およびマクロファージで構成され、P.緑内膜に感染し、拡散性および免疫学的障壁の両方を表すことができる。合理的に高いスループットで抗感染薬をテストするという目標を持つこの共培養は、2つのヒト細胞株CFBE41oとTHP-1単球由来マクロファージを使用して、-ウェルプレートインサートの透過性フィルター膜に確立されました。さらに、最終的にエアロゾル化抗感染剤13の沈着を研究するために、このモデルは液体被覆条件(LCC)ではなく空気液体界面(ALI)で確立された。
ここで報告するように、このモデルは、抗生物質治療時の細菌生存期間だけでなく、細胞毒性、上皮バリア完全性、マクロファージ転移、および薬物開発に不可欠な炎症反応を評価することを可能にする。
このプロトコルは、肺気道の吸入療法のための2つの関連する細胞タイプを組み合わせた:マクロファージとCF気管支上皮。これらの細胞は、透過性支持口の反対側に播種され、空気への細胞暴露を可能にする(空気/液体界面(ALI)条件と呼ばれる)。この宿主細胞の共培養は、その後、P.緑素吸い星に感染する。両方の宿主細胞株はヒト由来である:上皮細胞は嚢胞性線維症気管支上皮を表し、CFチャネル(CFBE41o-)に変異を有-し、THP-11414細胞は、よく特徴付けられたマクロファージ様細胞株である。コンフルエント上皮層は、マクロファージ様細胞が反対側のコンパートメントに加える前に、まずウェルプレート挿入物の上側に形成される。ALIで共培養が確立されると、システムは、アプリーカル側のP.緑素吸着で接種されます。この感染した共培養システムは、例えばトブラマイシンなどの抗生物質の有効性を評価するために使用される。次のエンドポイントを分析する:経上皮電気抵抗(TEER)の点で上皮バリア完全性、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による細胞細胞および細胞細菌相互作用の可視化、コロニー形成単位(CFU)のカウントによる細菌生存、宿主細胞生存(細胞毒性)およびサイトカイン放出。
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Protocol
1. 透過性支持インサートにおける細胞の増殖と分化
- CFBE41oを栽培- 10%胎児子牛血清(FCS)、1%非必須アミノ酸および5%CO2雰囲気を有する37°Cで600mg/Lグルコースを含む最小必須培地(MEM)の13 mLを有2するT75フラスコで。2~3日ごとに新鮮な培地を細胞に加えます。
- 3 mLのトリプシン-エチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)を37°Cで15分間、フラスコで70%合流した後、細胞を取り外します。新鮮なMEMの7 mLを加え、室温(RT)で4分間300 x g で遠心分離します。上清を捨て、新しい10 mLのMEMを追加しながら、上下に軽くピペットを入れて塊を混乱させる。
- 自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターチャンバーを持つ細胞を数えます。透過性サポートを備えた12ウェルプレートの密度が2 x 105の セル/ウェルのシードセル(孔径3μm、 材料表を参照)。
注: 自動セル カウンタは、セルの数、サイズの分布、およびセルの生存率を決定します( 表を参照)。0.4 μmの孔径を有する透過性サポートを使用することができます。しかし、この状態ではマクロファージは、直接、アプリカル側に追加されるべきであり、その細胞間移動は、この場合評価されません。 - 液体液体状態(LLC)で細胞をシードし、透過性支持体の補助側に500μLの細胞懸濁液を加え、バソラテラ側に1.5mLの新鮮な培地を加えた。その後、37°Cの5%CO2下で2細胞を72時間インキュベートする。
- 空気/液体界面(ALI)培養に移行するには、播種後3日目に、まずバソラハレ側から培地を取り出し、次に、アペカル側から培地を取り出す。バソララル側に、500 μLの新鮮なMEMを加え、細胞がコンフルエント単層になるまで2日ごとに培地を交換します。
注:このプロトコルで使用される条件については、CFBE41o- 細胞は通常、培養中の3〜7日後にコンフルエントです。 - CFBE41o-アペカル側に500μLの細胞培地、バソラテラ側に1.5mLの細胞を1時間、37°Cで5%CO2の下でインキュベートすることにより、7日目の上皮バリア2特性を評価する。
- STX2箸電極と上皮ボルトオームメーターを用いた経上皮電気抵抗(TEER)を介してバリア特性を測定する。7日後、これは300 Ω×cm²より高くなります。
注:最終的には、いくつかの膜挿入物では、細胞は低いTEERを有する。そのため、TEER < 300 Ω×cm² の透過性インサートは使用されません。
- THP-1細胞を培養するには、10%のFCSを添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地の13mLを使用してT75フラスコで増殖させ、5%CO2の下で37°Cでインキュベートする。2新しいT75フラスコに2 x 106細胞/mL細胞を播種して、2日ごとに細胞を分割します。
注:非分化THP-1細胞は、懸濁液中に単球として増殖する。- THP-1細胞を以下のように分化する。300 x gで T75 の遠心分離機内容を 4 分間使用します。上清を捨て、新鮮な培地でペレットを再中断し、新しいT75に入れます。10 ng/mLのフォルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA)を加えて、37°Cおよび5%CO2雰囲気15で48時間2RPMI中の細胞をインキュベートする。
注:PMAで分化した後、細胞は増殖しなくなり、フラスコに付着します。 - THP-1マクロファージ様細胞を剥離するには、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cで1回洗浄し、室温で10分間0.5mMEDTAを含む3mLの細胞剥離液(例えばアキュターゼ)でインキュベートする。
- 反転顕微鏡下で細胞を検査し、細胞剥離を探します。RTで4分間300 x g で新鮮な培地と遠心分離機の7 mLを追加します。
注:マクロファージはトリプシンEDTA、37°Cで20分間取り外すこともできます。しかし、トリプシンは、選択した細胞剥離溶液よりもマクロファージに対してより厳しい( 材料表を参照)。 - 上清を除去した後、THP-1培地の3mLのマクロファージ細胞を15mL円錐管に再懸濁し、1.1.2に記載されているように細胞を数える。共培養を設定する前に、37°CのCO2 の下で最大1時間インキュベートします。
注:THP-1細胞を懸濁液中に、生存性染料で染色して、さらに共培養を画像化することができる。このステップでは、以下の手順を実行します(ステップ 1.2.5)。 - 細胞生存率染料の10μMを含むマクロファージの染色(細胞内エステラーゼによるアセテート部分の変換に基づく、材料表を参照)、細胞生存性色素の3μLが細胞懸濁液に適用される。細胞を37°C、5%CO2で20分間インキュベー2トし、PBS 37°Cで1回洗浄して色素を除去します。
注:細胞を遠心分離し、室温(RT)で4分間300 x g で色素を除去します。
- THP-1細胞を以下のように分化する。300 x gで T75 の遠心分離機内容を 4 分間使用します。上清を捨て、新鮮な培地でペレットを再中断し、新しいT75に入れます。10 ng/mLのフォルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA)を加えて、37°Cおよび5%CO2雰囲気15で48時間2RPMI中の細胞をインキュベートする。
2. 透過性支持体上における上皮マクロファージ共文化の確立
- CFBE41o- TEER ≥ 300 Ω×cm² (ステップ 1.1.6.下の部屋から培地を取り出し、滅菌ガラスペトリ皿(50mm x 200mm)内の支持体を慎重に反転させ、細胞スクレーパーを使用して膜底面の膜孔を介して生い茂った細胞を取り除きます。
注:3μmの細孔サイズのため、上皮細胞は毛穴を通ってバソアテラザル側に向かって成長する傾向があります。したがって、この側にマクロファージを追加する前にそれらを削除する必要があります。CFBE41o-肺上皮細胞はこの工程で染色することができる。-ステップ 1.2.5 の手順を使用できます。しかし、細胞懸濁液の代わりに、MEMの色素溶液は、透過性支持体上の接着された細胞に(500 μLの素端側のみ)適用されます。 - PMA分化THP-1マクロファージの細胞懸濁液から2 x 105 細胞/ウェル(RPMIの200 μL)を使用し、細胞を反転インサートのバソラテラ側側に配置します。
- ペトリ料理を慎重に閉じ、5%CO2の下で37°Cで2時間2インキュベートします。
- インサートを12ウェルマイクロプレートに戻し、透過性インサートのバソラテラレ側にMEM培地500 μLを加えてALI条件を維持します。細胞は今感染の準備ができています。
3. P. 緑素症による感染
注:ここからのすべての次の手順は、バイオセーフティレベル2(BSL2)の研究室で行う必要があります。
- 15 mL のリゾゲニーブロス(LB)を、エルレンマイヤーフラスコ(50 mL)に300 μg/mL アンピシリンを補充し 、P. 緑化素吸 葉PAO1-GFPの単一コロニーを有する。
注 :P.緑素吸いの 他の株は、例えば、PAO1野生型、PA14、または臨床株、独自の栽培プロトコルに従って、ここでも使用することができます。 - 37°Cで18時間培養し、180rpmで振る。
- 18時間後に50mLの円錐管と遠心分離機を3850 x g で5分間移動します。上清を捨て、37°Cで10mLの無菌PBSを加えます。
- 波長600nmの分光光度計で光学濃度を測定し、細胞培養培地を用いて細菌の濃度を2 x 105 CFU/mLの最終濃度に調整します。これは、上皮細胞1個につき1つの細菌の多重性感染(MOI)に相当する。
- 透過性支持体の頂部側に100μLの細菌懸濁液を加え(ステップ2.4)、37°Cで5%CO2下で21時間インキュベートし、細胞に細菌が付着できるようにします。その後、アリの状態を復元するためにピペットで慎重にアプリカル液体を除去します。いくつかのサンプルをコントロールとして感染させないようにします。
注:この段階では、取り付けられた細菌はLB寒天(ステップ5.4/5.5を参照)でメッキして、初期細菌接種を決定する必要があります。 - 細胞内の細菌接着後に目的の薬物をインキュベートする。治療実験では、500μLの薬物溶液を細胞培地で希釈し(このプロトコルではトブラマイシン6μg/mLを使用)をアプリカル側に加えます。バソラテラ側に薬物を含まない1,500μLの細胞培地を加えます。
注:溶液として薬物を植え付ける代わりに、モデルはまた、エアロゾル堆積に適応させることができます。このような目的のために、ALIの細胞は500μLの細胞培地をバソラテラ側から供給される。次いで、薬剤はまず噴霧され、適切な装置によって尖体コンパートメントに沈着する(ここでは説明しない)。感染したサンプルおよび処理されたサンプルは、セクション 4 ~ 7 で概説されているエンドポイントを確認できます。このステップから、透過性支持体は、画像(セクション4)を作成したり、細菌の増殖や哺乳動物細胞の生存率の結果を得るために使用することができます(セクション5-7)。
4. 共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)のサンプル調製
- 共培養、感染症および薬物治療の確立後、全ての培地を補助側およびバソラショナル側から除去する。37°CでPBSで1xを洗浄し、RT(バヒラテラ上の300 μLで300 μL)で1時間、3%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。細胞核は、室温で30分間、DAPI-PBSの5μg/mLで染色されます。
注意: PFA は危険です。 - メスを使用して膜を切り取り、取り付け媒体を使用して2つの12 mm顕微鏡カバースライドの間に配置します( 材料表を参照)。フローベンチ内で30分間乾燥させてから、4°Cで保管します。 共焦点走査顕微鏡で可視化。
注:共培養後および取り付け前に、緊密な接合部の免疫染色を行うことができます。そのために、細胞は30分間パラホルムアルデヒド3%で固定され、PBSで再び洗浄され、PBSでサポニン0.05%/BSA1%で透過化される。このプロトコルでは、ゾヌラオクルデンタンパク質(ZO-1)をマウス抗ヒトZO-1抗体(1:400、一晩4°Cでインキュベーション)を介して検出した。その後、サンプルをヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor 633(赤で1:2000)でRTで2時間インキュベートした。核はDAPI(1 μg/mL)で染色され、カバースリップに取り付け媒体で取り付けられました。 - 保存された膜を画像化するために共焦点顕微鏡を使用してください。検出のために405、488、505または633 nmの25xまたは63x水浸しの目標およびレーザーを選び、画像の解像度は 1024 x 1024 ピクセルでなければなりません。
注:レーザーは使用する汚れに応じて選択されます。 - アペリアビューと断面ビューを取得し、イメージングソフトウェアを使用した3次元モデルの構築にゼータスタックモード(10~15スタック)を使用します。
コロニー形成ユニット(CFU)による細菌増殖の測定
- 非付着菌のCFUを評価するために、補助およびバソラショナル培地(細菌を含む)を収集します。補助側とバソラテラの側面から500 μLを集めて、それらをプールします。
注:この懸濁液を直接使用して、細菌(ステップ5.4)または遠心分離機を21,250 x gで10分間カウントして、上清(セクション6)から乳酸脱水素酵素(LDH)を評価したり、PBSで再懸濁して細胞外細菌を数えたりします(ステップ5.4)。 - 透過性支持体の各区画に500 μLの無菌脱イオン冷水を添加することにより、細胞内に付着および/または内在化された細菌の生存を評価します。室温で30分間細胞をインキュベートする。
注:サンプルは、LB寒天(ステップ5.4を参照)または後でめっきするために-20°Cで凍結(全体の挿入プレート)にメッキすることができます。 - 接着/内在細菌のCFUを評価するために、37°Cでサンプルを10分間解凍します(凍結した場合)。各ウェルのピペットチップを使用して、膜表面とピペットを上下に削り取り、すべての付着した内容を除去します。
注:このステップでは、すべての上皮細胞が分解され、接着/内在細菌がメッキされる懸濁液として利用可能です。 - 両方の分画から細菌懸濁液を使用して、PBSでTween-80 0.05%を使用して1/10連続希釈を行い、LB寒天プレートに細菌をプレートします。
注: 1 ~ 10 の希釈が推奨されます。細菌は、単一のコロニーが最初に同定される最も高い希釈で数えられるべきである。 - 郡のコロニーに対して16~72時間30°Cの寒天プレートをインキュベートし、それに応じてCFUを計算します。
注:プレートインキュベーション時の温度は、処理サンプルに不可欠であり、コロニーの遅延成長を観察するために必要です。
6. 乳酸デヒドロゲナーゼアッセイによる細胞細胞毒性の評価
- LDHアッセイ16の細胞生存率評価には、細菌を含む感染細胞の上清(ステップ5.1から)を使用する。21,250 x g で上清を10分間遠心分離し、細菌をペレットし、最終的に残りの細胞をペレット化する。LDH放出を測定するために細菌を含まない上清を使用してください。
注:上清は、このアッセイでLDHを測定する前に凍結してはなりません。 - 上清100μLを96ウェルプレートに移し、LDHアッセイ溶液を100μL加えます( 材料表参照)。暗い所で室温で5分間インキュベートし、492nmで吸光度を読み取る。
7. ヒトサイトカインの放出の評価
- サイトカイン定量の場合、ELISAまたはサイトメトリックビーズアレイイムノアッセイ17を使用します( 材料表を参照)。このために、ステップ5.1から遠心分離機上清は21,250 x g で10分間、分析まで15日間まですぐに測定するか、-80°Cを保存します。
- 市販のELISAキットで上清を評価します。
注:この手順は、捕獲抗体によるプレートのコーティング、サンプル(100 μL)およびサイトカイン標準の追加、インキュベーション、洗浄、および検出抗体の追加を含む製造手順に従い、サイトカイン存在の着色測定を提供します。あるいは、フローサイトメトリーは、市販のキットを介してサイトカインを測定するために使用することができます( 材料表を参照)。
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Representative Results
図1A は、それぞれ、透過性支持体の頂部側およびバソラショナル側で24時間成長した後のヒト気管支上皮細胞とマクロファージの共培養の形態を示す。上皮バリア完全性は、より高いTEER(834Ω×cm2)およびCLSMにより、密接結合タンパク質ZO-1に対する免疫染色によって示される(図1B)。感染していないCFBE41oのバリア完全性の観点から観察された同じ結果は 、感染していない上皮マクロファージ共培養で単一培養が見られた。
細菌感染をモデル化するために、P.緑素吸皮症はCFBE41o細胞上で1:1の多重感染(MOI)で接種された。感染から6時間後(図2A)、共培養の頭側にマクロファージが認められた。感染後、TEERは834から250Ω×cm2に低下2し、ZO-1染色によっても可視化されるように、侵害された上皮障壁を示す(図2B)。
図3は、アピカル側のTHP-1細胞による透過性膜細孔および細菌取り込みを介したマクロファージの移行を示す。このサンプルは、独立実験から1、3、および6時間のインキュベーション後に固定した。THP-1単一培養(図3A-C)では、マクロファージの移動が早ければ1時間に観察され、共培養(図3D-F)D–Fでは3時間感染した後に見られた。THP-1における細菌取り込みは、単一培養および共培養の両方で、感染の3時間後に観察された。CFBE41o-による細菌の取り込みは見られなかった。透過性膜支持体が、円錐体とバソラテラコンの分離として真ん中にあったように、断面図を配置した。
図4は、トブラマイシンを用いてまたは未治療の感染した共培養物(CFBE41o-+THP-1)の共焦点走査レーザー顕微鏡写真を示す(図4A,B)または20時間(-図4C,D)。治療を行わない場合、上皮細胞とマクロファージの両方が20時間の感染後に死亡した(図4C)。しかし、トブラマイシン治療の際、宿主細胞は20時間後に保存される。それでも、いくつかの細菌は、培養中に観察することができます。顕微鏡写真(図4B)で6時間の治療後に見られたにもかかわらず、細菌は図4EのCFUアッセイで観察されるように増殖しなかった。それにもかかわらず、20時間処理した後、細菌はCFUアッセイにおけるコロニーに見られるように増殖能力を回収した(図4F)。冷たい水と掻き取り付けと細胞のライシスプロトコルは、取り付けられた細菌を放出し、おそらく細胞内に内在化することができます。同時に、細胞が破壊される(補助図S1A、B)。上皮細胞(300 x g)または細菌(21,250 x g)に対して本論文で用いられている遠心分離ステップは、両方の生存率を妨げなかった(補足図S1C,D)。すべてのCFUアッセイは、サンプルを-20°Cで凍結し、続いて解凍およびめっきすることによって行われた。この手順では、新鮮なサンプル(補助図S1E)と比較して、細菌の数を2ログ減少させた。この手順は、異なる時点ですべての実験群(処理および未治療)に対して同時に行われるため、この削減は最終結果(補足図S1E)に組み込まれます。また、ここで用いられるトブラマイシンの濃度は、未感染細胞(補助図S2A)に対する毒性を示さなかった(補助図S2A)また、更なる炎症反応はなかった(補助図S2B)。しかし、P.緑分症を殺す最小阻害濃度の範囲内であった。
図5は、経上皮電気抵抗(TEER)および細胞生存率を示す。図 5A-Bは、単一文化と共培養の TEER を示しています。CFBE41oの共培養-THP-1を有する細胞は、単培養(赤棒)と比較して上皮バリア完全性の変化を誘発しなかった。-感染時に、TEER値が低下した(緑色のバー)。1時間の感染後、いくつかのサンプルを、6または20時間、抗生物質トブラマイシン(青棒)で治療した。治療は、より高いTEERによって観察されるように、上皮バリアの完全性を維持した。図5Cは、6時間後の感染およびトブラマイシン治療時の細胞毒性の指標としてのLDH放出の割合を示す。共培養自体は、感染細胞(約20%)に対して同じLDHの放出を誘発した。感染の20時間後、LDHの信号は検出されなかった。長期感染に対するLDH信頼性を証明するために、PAO1-GFPは、それぞれの未感染コントロールと比較して、LDH 1 U/mLの有無にかかわらず培地でインキュベートされた(補助図S2C)。LDHシグナルは、P.緑素吸皮症で長時間培養(20時間)を経て失われ、LDHは感染培養において短いインキュベーション時間においてのみ安定していることを示している。
図6は、ELISAを介して検出された炎症促進サイトカインの運動を示す。CFBE41o-およびTHP-1細胞の感染共培養の利点は、炎症性サイトカインの高い分泌物で観察された。いくつかの炎症性サイトカインの分泌は、感染した共培養において類似(IL-6)以上(IL-8、TNF-α、IL-1β)、対応する単一培養物(図6A-B)と比べて高かった(図6A-B)。Figure 6C予想外に、THP-1単一培養中のサイトカイン(図6B)は、感染したサンプル(Il-8、TNFα、IL-1β)においてダウンレギュレートされている。
図7 は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して測定されたトブラマイシンによる感染および治療時の単一および共培養におけるサイトカインの放出を示す。炎症性サイトカインIL-8(図7A)と抗炎症性サイトカインIL-10(図7F)の分泌は、単一培養物と比較して上皮細胞とマクロファージの共培養において高かった。しかし、他のすべてのサイトカイン(IL-1α、IL-12p40、IL-23およびGM-CSF)(図7B-E)については、サイトカイン分泌のレベルは、それぞれの単一培養における同文化において高くはない。
図1:感染していない上皮マクロファージ共培養の断面および極論的見解 (A) 感染していない24時間の上皮マクロファージ共培養のクロスビュー。CFBE41o- 染色赤、黄色でTHP-1マクロファージ、および青色の核(DAPI)。(B) 未感染CFBE41o-ZO-1に対する免疫染色(赤色)のアプカル図。DAPI: 核.スケールバー:50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:感染した上皮マクロファージ共培養の断面および経理的見解(A) P.緑素吸葉PAO1-GFPとの感染後6時間(hpi)における上皮マクロファージ共培養の交差図および(B)の円端的な見解。CFBE41o-赤色に染色され、黄色でTHP-1マクロファージ、青(DAPI)の核(DAPI)およびP.緑で緑化した緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の緑の青い緑の青い緑の青い青い青い1-GFP。(B) CFBE41o-単層に感染した6 hのアペカルビュー。スケールバー:50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マクロファージの移動と細菌取り込みの動態を3Dモデルの断面で可視化THP-1マクロファージ(A-C)または共培養(D-F)の単一培養におけるPAO1-GFP感染動態。THP-1マクロファージは赤色、上皮細胞の核は青色(DAPI)、緑(GFP)の緑の緑緑素座の緑素座である。各図は、有端側およびバソラショナル側に分割され、その間の空間は、CFBE41o-コンフルエント層(D-F)によって空であるかまたは占有されている膜であると考えられる。-図中のインサートは、異なる時間(A-F)におけるマクロファージによる細菌取り込みを示しています。スケールバー:50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:トブラマイシン処理コカルトゥールe.(A-D)共焦点顕微鏡写真の共培養におけるPAO1-GFP生存率の特徴付け(A)感染後6時間経過後の未治療の共培養。(B) トブラマイシン6 μg/mL(トブ)で6時間処理した感染共培養(C)感染後20時間未治療の共培養、(D)トブラマイシン6 μg/mLで20時間処理した感染共培養。DDAPI(青)、マクロファージ(赤)およびP.緑で染色された核。(E)6後の付着/内在化細菌のコロニー形成単位(CFU)及びトブラマイシン6μg/mL処理による(F)20時間後。空膜挿入物を非生物的基質として使用し、PAO1-GFPを増殖させた。Tukeyの多重比較検定を用いた双方向分散分析法(コロニーなし)が使用されました。p < 0.001;p < 0.0001;ns: 重要ではありません。誤差範囲は標準偏差を示し、n = 9~27は3~9の独立した実験を反復します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:バリアの完全性とモノカルチャーと共培養の生存率の評価感染していない状態(灰色のバー)、感染した(緑色のバー)、またはトブラマイシン(青いバー)で感染して治療した。(A)6時間後の経上皮電気抵抗と(B)モノ培養における感染の20時間(CFBE41o-およびTHP-1)と共培養。-(C)LDH放出6時間感染後の単一および共培養の細胞毒性を測定する。CTukeyの多重比較テストを用いた双方向の分散分析が使用されました。*p < 0.05;p < 0.0001;ns: 重要ではありません。誤差範囲は標準偏差を示します。n = 9は3つの独立した実験を複製する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ELISAを介して評価された非感染および感染したモノおよび共培養上清のサイトカイン放出のキネティックス。ELISAはキットメーカーのプロトコルに従って行われました。(A)CFBE41o-、 (B) THP-1、および(C)共培養放出IL-8、TNF-α、IL-1β、およびIL-6。A誤差範囲は標準偏差を示します。n = 2つの独立した実験の複製を6つ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:トブラマイシン6μg/mLの有無にかかわらず、6時間の感染後にFACSを介して測定されたサイトカインパネルの上清結果。各サイトカインIL-8(A)、IL-1α(B)、IL12p40(C)、IL-23(D)、GM-CSF(E)およびCIL-10(F)Dを分析するために使用される6時間後Eのモノおよび共培養の上清F。AB誤差範囲は標準偏差を示し、n = 9は3つの独立した実験を反復する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:プロトコルの重要なステップの実験を制御する。(A, B)24ウェルプレートにおけるCFBE41o-細胞の顕微鏡写真は、2 x 105細胞/ウェルの密度で2日間増殖した。(A)PBS中のCFBE41o-細胞を30分間、ピペットで掻き取った後30分後に水処理細胞を(B)する。(C)遠心分離後の哺乳動物細胞の生存率CFBE41o-細胞は、ステップ1.1.1および1.1.2に記載されるようにT75細胞培養フラスコから除去した。得られた細胞懸濁液の100μLを10mL等張溶液で分析した。単一細胞の生存率を評価するために、自動化された細胞カウンターを使用した。次いで、各細胞懸濁液を4分間300xgでg遠心分離し、再懸濁し、再度カウントした。誤差範囲は標準偏差を示し、n=2個の個別実験の異なるフラスコが異なる。(D) 遠心分離後のPAO1-GFPの生存率PAO1-GFP細菌は、細胞培地中でOD=0.01に希釈した。CFUは、10倍希釈列およびLBプレートを介して30°Cで一晩インキュベートした。 各プラスチックチューブを21,250xgで10分間遠心g し、培地に再懸濁した。CFUは再びそれに応じて評価された。両手の学生のtテスト、 * p < 0.033.誤差範囲は標準偏差を示し、n = 2つの実験の6を示します。(E) 凍結後の細菌の生存率PAO1-GFP細菌は(D)のように調製し、CFUを分析し、次いでプラスチックチューブを-20°Cで1日凍結し、再びCFUを評価するために解凍した。両手の学生のtテスト、 *** p < 0.001。誤差範囲は標準偏差を示し、n = 2つの実験の6を示します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図S2:トブラマイシンのLDH挙動および影響を評価する制御実験(A)6 μg/mL トブラマイシンによるインキュベーションの20時間後の細胞毒性を評価するコントロール実験。単一培養および共培養は、プロトコルに記載されるように行ったが、細胞を24ウェルプレート上で2日間増殖させ、THP-1細胞をアピカルに播種した。6 μg/mLトブラマイシンまたはコントロールを有する細胞を20時間インキュベートした。一方道ANOVA、Tukeyの多重比較テスト、*** p <0.001。誤差範囲は標準偏差を示し、n= 6の2つの実験(CFBE41o-)、n=3の実験(THP-1と共培養)を示す。(B) トブラマイシンを伴う/無しのモノ培養と共培養の上清の制御-ELISA。細胞培養は、(A)全ての条件に対する対照と比較してサイトカイン放出を示さないために行った。ELISAはステップ7.1および7.2で行われ、制御として10μg/mL(LPS)を加え、THP-1を含むLPS処理制御用IL-8放出は検出可能よりも高かった。トゥーキーの多重比較テストである双方向分散分析法、ns p > 0.12;* p < 0.033;p < 0.001.誤差範囲は標準偏差を示し、n = 6の2つの実験、n = 3の実験(LPS制御)を示します。(C) 過剰な PAO1-GFP 増殖による LDH の分解。LDHは、MEM培地に1 U/mLの濃度で添加した。LDH培地または制御培地のいずれかを使用して、細胞をOD=0.01(1 x 108 CFU/mLに相当)に希釈し、20時間インキュベートした。一方向の分散分析、Tukeyの多重比較テスト、ns p > 0.12;p < 0.001.誤差範囲は標準偏差を示し、3つの個別の実験のn = 8~9を示します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本論文は、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41o-およびヒト単球由来マクロファージ細胞株THP-1によって構成される、感染した気道の3D共培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症の評価を可能にし、薬物の有効性と宿主応答を同時に検査する際の重要なパラメータである。モデルにおける新規性は、急性細菌感染(すなわちP.Eeruginoa)を有する上皮細胞(すなわちヒトCF細胞株およびマクロファージ)の組み込み内にある。上皮細胞における急性感染は、抗生物質(すなわちトブラマイシン)によって制御することが実証される。ヒトCF細胞株の使用に加えて、モデル全体がALI条件で設定され、CFの生理学的条件にかなり近い。CF細胞株の使用は、モデルにおける疾患の特徴の一部を実装する。嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節器(CFTR)の変異は、肺における上皮液輸送の調節不変に直接関係する。さらに、ΔF508のようなCF遺伝子の変異は、P.緑素吸いによる4感染時に炎症および重度の肺損傷を伴う、厚い粘液をもたらす。機能不全CFTRによって引き起こされるこれらの病理学的症状は、CF肺疾患18の病因に関連する重要な細胞機構としてオートファジー障害を伴う可能性がある。しかし、CFBE41o--この細胞株の制限である秘密の粘液に失敗する。粘液の役割をより具体的に研究することを意図している場合、プロトコルは、他の気管支細胞株(例えば、Calu-3)を用いて適応することができる。
このプロトコルを設定するための重要なステップの1つは、上皮細胞と免疫細胞の組み合わせと、その後のALIの緑化細胞との感染である。CFBE41oの感染−インビトロのP.緑素吸盤は既に記載されており、主にフロー細胞室を用いて、培養培地中でアルギニンを補い、上皮細胞の生存を改善し、バイオフィルム形成19を支持する。本プロトコルはヒト細胞のみを用いた新しいモデルを目指し、さらに、より高いサンプルスループットのために透過性ウェルプレート挿入物上のALIで増殖させることができた。THP-1分化マクロファージをヒト不死化細胞株として含めることは、ドナーから再現可能な初代細胞を得えることに依存するのではなく、我々のモデルのもう一つの利点である。これらのマクロファージを透過性膜支持体のバソラテラ側側に添加することにより、マクロファージが突き出て、最終的にフィルター成長した上皮バリアの有端側に移行することが観察された。このプロトコルのバリエーションとして、上皮細胞の上に直接マクロファージを追加することが可能です。14.非ヒト免疫細胞と肺細胞の共培養は、すでに前に説明されている。ディンら10使用マウスルイス肺癌細胞を透過性挿入物に、そば側側のマクロファージと組み合わせてサポートし、CF患者における慢性感染のもう一つの重要な病原体であるS.アウレウスに感染した。しかし、本研究では、嚢胞性線維症に焦点を当てず、薬物有効性の評価のためのプラットフォームとして共培養を使用することではなかった。このプロトコルは、黄色ブドウ球菌、膿瘍菌、バークホルデリア・セパシアなど、CF肺の重要な病原体などの他の細菌感染に適応することができます。
もう一つの重要なステップは、透過性の挿入物を逆さまに反転させることによって細胞にTHP-1マクロファージを加える(セクション2)。これは、感染の側に井戸を介してマクロファージトランスマイグレーションを評価するために重要です.Zスタックを備えた3Dモデルからの後のイメージングプロセス、および断面図は、マクロファージの内部を観察し、細菌の取り込みを検出するために行うことができる(図3)。1 hpiでは、尖体側に適用された細菌が膜を通過し、マクロファージの移動と取り込みは3hpiでのみ行われます。従って1時間の感染後、トブラマイシンによる治療を開始し、長期間生存する宿主細胞と細菌の両方に対処する可能性を有することが適切であった(20時間)。プロトコルの過程で、無菌性を維持することは、それぞれが汚染のリスクを運ぶ多数のステップに重大な問題です。それにもかかわらず、経験豊富な細胞培養の担当者は、適切な準備と訓練の後にこのプロトコルに従うことができるでしょう。細胞培地は、汚染について定期的にチェックする必要があります, 好ましくはすべての重要なステップの後.
他のモデルと同様に、感染した共培養にもいくつかの制限があります。例えば、マクロファージ様細胞の集積。ここでは、バソアテラテラル側にマクロファージを持つことは重要でした。しかし、以前に成長した上皮層を用いた挿入物の操作は、共同培養に早期の損傷および妨害を提供している可能性がある。しかし、透過性支持モデルは高スループット特性を提供したが、これはCF感染肺20,21,21の以前の共培養では観察されていない。それで、さらなる実験は、マクロファージの代用品としてTHP-1を使用することの限界を評価する必要があります。この細胞株は広く用いられているが、LPS22に対する応答性が低く、完全な活性化を欠き、母集団全体が単球からマクロファージ様細胞23に分化していない。もう一つの制限は、CF感染および薬物送達における他の主要な構成要素の欠如である。CFBE41o-細胞株は繊毛を有しておらず、粘液を産生することもせず、通常はALIで20〜30日間の細胞培養が起こる。これはCFBE41o細胞株には当てはまらなかったので、タイトな上皮バリアが形成された7日後に細胞を使用した。粘液性クリアランスは、微生物24または薬物粒子99、2525のいずれかのための滞留条件を変更し、肺堆積を評価するインビトロモデルはこれを考慮に入れるべきである。他の細胞で観察されるものとは異なり、組織培養は細胞外マトリックス材料(フィブロネクチンまたはコラーゲンIのような)でコーティングを挿入し、CFBE41o-、例えば-TEER26において有意な差を示さない。したがって、透過性フィルタは、このプロトコルにおいて細胞外マトリックス材料でコーティングされなかった。
ここで説明するプロトコルを用いて、モノおよび共培養は6時間感染後、将来の薬物検査での測定として使用するのに十分なサイトカイン放出を提供する。共培養は、免疫応答のモデリングにおける細胞協調の利点をもたらします。治療中にすべての細菌が排除されなかったため、炎症を軽減する際のトブラマイシンの効果が期待された(図4E,F)。それにもかかわらず、CFモデルにおけるトブラマイシンに対する応答をモデル化することは極めて重要であり、トブラマイシン(高濃度)としては、バイオフィルム19,27,27であっても、P.緑化素吸OA阻害に有効であり得る。このプロトコルをさらに使用する可能性の1つは、治療に抗炎症薬を統合することです。炎症反応に関する全体的な勧告は、宿主細胞および細菌がまだ存在する短い期間の治療(6時間)を使用することであろう。この時点以降、宿主細胞は未処理のサンプルで破壊される。ELISAとFACSの両方を使用してサイトカインの放出を測定することができた。最後に、サンプルが−80°Cで15日より長く保存される場合、例えば、新鮮なサンプル(例えばLPSで刺激される細胞)の正の制御を用いてサイトカインの信頼性をチェックすることが推奨される。
プロトコルのいくつかの変更が可能です。例えば、現在のプロトコルは、ネビュライズド薬の適用に拡大することができる(ステップ3.6)。これは、経口吸入による肺薬物送達をモデル化するために必要です。水溶性薬物のネビュライゼーションは、トブラマイシン、またはリポソームコリスチンなどのナノキャリアなど、診療所で日常的に使用される市販のデバイスによって比較的まっすぐ進む。また、細胞培養用インサートにエアロゾルを堆積させるために市販されている装置もいくつか存在する。また、ここで説明するモデルは透過性膜支持体に基づいているため、呼吸の影響や関連する機械的ストレッチや気流の変化などを調べるなど、一部の現代マイクロ流体(例えば「チップ上の肺」)デバイスにも採用できます。さらに、このプロトコルは、対処されるべき科学的な質問に応じて、一次細胞による粘液または置換の追加によって変更することができる。もう一つの興味深い次のステップは、ナノ医薬品のテストであろう, 特にナノテクノロジーは、新しい抗感染薬の開発を進めているとして28,CF矯正器29 と抗生物質と病態遮断薬の共同配信30.全体として、現在のプロトコルは、細胞毒性、上皮バリア完全性、マクロファージトランスマイグレーションおよび炎症反応など、複雑な系における抗生物質治療時の細菌生存率を評価するのに有用であると認識され得る。これらは医薬品開発に不可欠なパラメータです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、欧州連合(EU)のHORIZON 2020プログラムから、補助金契約第642028 H2028-MSCA-ITN-2014、NABBA - 生物学的障壁を克服し、重篤な疾患を治療するための高度なナノ医薬品の設計と開発に基づく研究、技術開発、デモンストレーションのための資金を受け取りました。アナ・コスタ博士とジェニー・ユントケ博士は、ELISAアッセイ、ペトラ・ケーニッヒ、ジャナ・ウェストヒュース、キアラ・デ・ロッシ博士の細胞培養、分析、顕微鏡コピーに関するサポートに対する科学的イラスト「アンジャ・ホーネッカー」に対する共文化の発展に大きな支援をしてくれたことに感謝します。また、原稿を校正してくれたチェルシー・ソーンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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