Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering, transfection och långsiktiga kultur av vuxna mus och råtta kardiomyocyter.
Abstract
Ex vivo kultur av de vuxna däggdjur kardiomyocyter (CMs) presenterar den mest relevanta experimentella systemet för in vitro-studien av hjärt biologi. Vuxna däggdjurs-CMs är terminalt differentierade celler med minimal proliferativ kapacitet. Den post-mitotiska tillstånd av vuxna CMs inte bara begränsar kardiomyocyte cell cykel progression men också begränsar den effektiva kulturen av CMs. Dessutom är den långsiktiga kulturen hos vuxna CMs nödvändig för många studier, såsom CM spridning och analys av genuttryck.
Musen och råttan är de två mest föredragna försöksdjur som ska användas för kardiomyocyte isolering. Medan den långsiktiga kulturen av råtta-CMs är möjlig, är vuxna mus-ING mottagliga för döden och kan inte odlas mer än fem dagar under normala förhållanden. Därför finns det ett kritiskt behov av att optimera cellen isolering och långsiktiga kultur-protokollet för vuxna murine CMs. Med detta modifierade protokoll är det möjligt att framgångsrikt isolera och kultur både vuxna mus och råtta CMs i mer än 20 dagar. Dessutom är siRNA transfektion effektivitet isolerade CM betydligt ökat jämfört med tidigare rapporter. För vuxna mus CM isolering, langendorff perfusion metoden utnyttjas med en optimal enzymlösning och tillräcklig tid för fullständig extracellulär matris dissociation. För att erhålla ren Ventrikulärt CMs, var både atria dissekeras och kasseras innan du fortsätter med de disassociation och plätering. Celler var spridda på en laminin belagda plattan, vilket möjliggjed för effektiv och snabb fastsättning. CMs var tillåtet att nöja sig med 4-6 h innan siRNA transfection. Kulturmedia var utvilad var 24 h i 20 dagar, och därefter var CMs fasta och färgade för hjärt-specifika markörer som Troponin och markörer för cellcykel som KI67.
Introduction
Hjärtsjukdomar är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Nästan alla typer av hjärt skada resultera i en betydande förlust av vuxna kardiomyocyter (CMs). Vuxna däggdjurshjärtan kan inte reparera sin hjärtskada på grund av den vuxna CM1:ssenescentkaraktär . Således, någon förolämpning mot den vuxna däggdjur hjärtat resulterar i en permanent förlust av CMs, vilket leder till minskad hjärtfunktion och hjärtsvikt. Till skillnad från vuxna däggdjur, små djur som zebrafisk och newt hjärtan kan regenerera sin hjärtskada genom befintliga CM spridning2,3,4. En världsomspännande insats pågår för att hitta en ny terapeutisk intervention för hjärtskada via både proliferative och icke-proliferative metoder. Under de senaste decennierna har olika typer av genetiska musmodeller utvecklats för att studera hjärtskada och reparation. Att använda in vivo-djurmodeller fortsätter dock att vara en dyr metod med den ytterligare komplexiteten för att dechiffrera en cell-autonom mekanism från sekundära effekter. Förutom, in vivo system är utmanande att analysera CM specifika effekter av en farmakologisk intervention som inducerar hjärtskyddande signalering från CM.
Dessutom är den långsiktiga kulturen hos vuxna OEM-skivor nödvändig för att utföra CM-spridningsanalyser. CM spridningsanalyser kräver minst 4-5 dagar för att celler ska induceras i cellcykeln och för att få korrekta data efter det. Dessutom, studier som utnyttjar isolerade CMs för elektrofysiologiska studier, drogscreening, toxicitet studier, och Ca+ + homeostas studier är alla i behov av en förbättrad kultur system5,6,7. Vidare visar nyligen genomförda studier den hjärtskyddande betydelsen av cytokiner som utsöndras från CMs (kardiokiner)8,9. För att undersöka den terapeutiska roll och molekylära mekanismen av dessa kardiokiner under hjärtat reparation och regenerering, krävs en långvarig kultur.
Vuxna rat-CMs är robusta nog för encellig isolering och långsiktig kultur i ett in vitro-system10,11,12. Men vuxna mus-CMs är av stort intresse för in vitro-analyser, på grund av tillgången på en mängd olika genetiskt modifierade musmodeller, som möjliggör utformning och utförande av olika innovativa analyser som inte är möjliga med råtta CM13. I kontrast till vuxen råtta CM isolering, den er helt utmanande till få en enkel- cell upphängning från vuxen mus hjärtan, och den lång- tid kultur av vuxen mus CMs i kultur är jämn mer utmanande.
Adult CM isolering från mus och råtta hjärtan med hjälp av en Langendorff system har tidigare inrättats för att studera CM funktion5,14,15. Här har vi beskrivit i detalj protokollen för vuxna CM isolering från både råttor och möss, samt en modifierad långsiktig kultur, transfection, och CM spridning av isolerade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment bör utföras i enlighet med riktlinjerna i Vägledning för vård och användning av försöksdjur som publiceras av U.S. National Institute of Health (NIH). Alla protokoll som visas i videon godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Cincinnati, College of Medicine.
1. Beredning före hjärtutvinning från vuxna möss (och råttor)
- Bered motsvarande perfusions-, enzym- och stopplösningar, enligt recepten som ges i tabell 1 respektive tabell 2, för isolering av råtta och mus. Filtrera lösningarna genom ett 0,22 μm filter för att avlägsna eventuell kontaminering eller oupplösta partiklar.
- Rengör och sterilisera de kirurgiska instrumenten genom blötläggning dem i 70% alkohol i 15 min, och därefter tvätta med dubbel destillerat vatten. Låt verktygen lufttorka på en ren pappershandduk.
- Värm vattenbadet i förväg till 37 ºC. Kontrollera vattennivån i vattenbadet för att säkerställa en oavbruten cirkulation av varmt vatten genom perfusionsapparaten under förfarandet.
- Rengör perfusionsapparaten genom att köra med 70% alkohol i 5 min. Upprepa.
OBS: Öka flödeshastigheten, vilket hjälper till att rengöra slangen. - Efter alkoholen genom genom, rengör resterna av alkohol genom att köra dubbel destillerat vatten i 10 min.
- Ställ in 3 medelstora engångspolystyren vägning rätter för att rengöra hjärtat efter excision. Fyll disken med 20 mL myocytebuffert.
- Tillsätt 2-3 droppar heparin till varje maträtt med hjälp av Pasteur pipett och blanda väl genom pipettering flera gånger.
- Ta en 10 mL spruta med en trubbig nål kanyl.
OBS: En trubbig nål kanyl kan förberedas genom att klippa spetsen på en ren, steril nål. En 21 G nål och 14 G nål användes för att göra kanylen för musen och råttan, respektive. - Fyll sprutan med perfusionsbuffert (Tabell 1). Ta bort eventuella luftbubblor från sprutan och placera den i den tredje skålen i ett vinklat läge. Säkra den med tejp.
OBS: För råttor användes Lösning A (Tabell 2) i stället för myocyteperfusionsbuffert. - Förbered en lös knut med en kirurgisk sutur och placera den runt nålen.
- Injicera musen med heparin (100 USP-enheter/mus) genom intraperitoneal injektion, 20 min före anestesiinjektionen.
- Cirkulera myocyteperfusionsbufferten (Tabell 1) genom perfusionsapparaten. Minska flödeshastigheten till 3 mL/min.
OBS: För råttor användes Lösning A (Tabell 2) i stället för myocyteperfusionsbuffert. - Efter 5 min, byt ut perfusionsbufferten mot enzymlösningen (Tabell 1). Mätta enzymlösningen med syre under processen. Använd en flödeshastighet på 3 mL/min.
OBS: För isolering av råtta CM, använd istället lösning E (Tabell 2). - Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av anestesi. Använd lämplig dos av anestesi, rekommenderad av IACUC, för den terminala operationen.
- Bekräfta tillräckligt djup anestesi av bristen på ett svar på en tå nypa. Sedan, sätta musen på den kirurgiska plattformen.
2. Utvinning av hjärta från vuxna möss (och råttor)
- Sterilisera huden genom att torka med 70% alkohol.
- Öppna försiktigt bröstet.
- Punktskatt hjärtat. Undvik icke-hjärtvävnader under excision.
- Sätt hjärtat på den första skålen, fylld med perfusionsbuffert (Tabell 1).
OBS: Använd lösning A för råttan (Tabell 2). - Rensa blodet från hjärtat genom att försiktigt klämma.
- Överför hjärtat till den andra skålen.
- Rengör blodet från hjärtat och ta bort icke-hjärtvävnader. Därefter överför hjärtat till den tredje skålen.
- Trimma av lungor och annan omgivande vävnad och kannakula via den stigande aorta. Denna procedur bör utföras så snabbt som möjligt (<5 min) för att förbättra CM kvalitet och kvantitet.
3. Matsmältningen av hjärtat
- Matsmältning av mushjärtat
OBS: Alla lösningar/buffertar som cirkulerar genom mushjärtat ska syresättas under hela proceduren.- Ta försiktigt bort den kanulerande nålen från sprutan och anslut den till Langendorff-perfusionsapparaten.
- Undvik att luftbubblor går in i hjärtat, vilket kan påverka flödet genom enzymlösningen och matsmältningen.
- Flytta upp vattenmanteln för att ge en homogen miljö till hjärtat. Låt enzymlösningen flöda genom hjärtat med en hastighet av 2-3 mL/min.
OBS: Hastigheten på den passerande lösningen är kritisk och har en betydande inverkan på resultatet av CM kvantitet och kvalitet. - Låt enzymlösningen flöda genom hjärtat i 2 min.
- Vid 2 min, tillsätt 40 μL av 100 μM CaCl2 lösning till enzymlösningen och blanda. Låt enzymlösningen passera genom hjärtat i ytterligare 10-15 min.
OBS: När flödet blir smidigt, hjärtat blir brunaktig och mjuk, vilket indikerar jämn fördelning av kollagenas enzym och korrekt matsmältning av hjärta.
- Röt av råtthjärtat
OBS: Alla lösningar/buffertar som cirkulerar genom råtthjärtat ska syresättas under hela proceduren.- Ta försiktigt bort den kanulerande nålen från sprutan och anslut den till Langendorff-perfusionsapparaten.
- Undvik att luftbubblor går in i hjärtat, vilket kan påverka flödet genom enzymlösningen och matsmältningen.
- Flytta upp vattenmanteln för att ge en homogen miljö till hjärtat.
- Starta flödet av lösning A med en hastighet av 2-3 mL/min i 3-5 min för att avlägsna eventuellt blod från hjärtat.
OBS: Hastigheten på den passerande lösningen är kritisk och har en betydande inverkan på resultatet av CM-kvalitet. - När blodet rensats från hjärtat, växla från lösning A till lösning E (Tabell 2). Titrate lösning E med CaCl2 enligt nedan indikerad för en slutkoncentration på 0,1 mM i lösning:
- Efter 10 min perfusion, tillsätt 12,5 μL av 0,1 M CaCl2.
- Efter 15 min perfusion, tillsätt 25 μL av 0,1 M CaCl2.
- Låt enzymlösningen passera genom hjärtat i ytterligare 30-40 min, tills flödet blir snabbt och hjärtat är följsamt.
4. Beredning av CM encellig suspension
- Förberedelse av CM-encellsupphängningen (musen)
- Ta bort hjärtat från Langendorff-perfusionssystemet. Flytta den till en 60 mm Petriskål fylld med 5 mL enzymlösning och överför skålen till en biosäkerhetshuva.
OBS: Säkerställ tillräcklig hjärtspjälv matsmältning innan du tar bort hjärtat från Langendorff-perfusionssystemet. Matsmältningstiden beror på enzymaktiviteten, flödet av lösning, och storleken på hjärtat. - Utför ytterligare mekanisk disaggregation i en biosäkerhetshuv för att säkerställa sterilitet och undvika kontaminering.
- Ta försiktigt bort atria (1/4th av basala hjärtat portion) och extra fett vävnader.
- Finhacka hjärtat med tåttlangar i fina bitar.
- Ta en steril Pasteurpipett och skär dess spets i 45º vinkel.
- Använd denna Pasteurpipett för att dosera hjärtvävnaden i en encellig suspension genom mild pipettering. Optimal matsmältning ger en suspension av encelliga kardiomyocyter.
OBS: Ta bort den smala, nedre delen av överföringsrören för att minska CM-skador på grund av mekanisk brännande. - Tillsätt sedan 5 mL stopplösning för att stoppa enzymaktiviteten, vilket undviker möjligheten till översmältning.
- Ta en färsk 50 mL konisk och placera en steril 100 μm cellsil på den.
- Passera kardiomyocyte suspension genom cellen silen för att ta bort vävnaden bit. Tvätta petriskålen och silen med ytterligare 5 mL stopplösning (Tabell 1) för att samla eventuella kardiomyocyter som förblir fästa vid silen.
- Ta bort hjärtat från Langendorff-perfusionssystemet. Flytta den till en 60 mm Petriskål fylld med 5 mL enzymlösning och överför skålen till en biosäkerhetshuva.
- Beredning av CM-encellsupphängningen (råtta)
- Ta bort hjärtat från Langendorff-perfusionssystemet. Flytta hjärtat till en 100 mm Petriskål fylld med 5 mL lösning A och flytta skålen till en biosäkerhetshuv.
OBS: Säkerställ tillräcklig hjärtspjälv matsmältning innan du tar bort hjärtat från Langendorff-perfusionssystemet. Matsmältningstiden beror på enzymaktiviteten, flödet av lösning, och storleken på hjärtat. - Utför ytterligare mekanisk disaggregation i en biosäkerhetshuv för att säkerställa sterilitet och undvika kontaminering.
- Ta försiktigt bort atria (1/4th av basala hjärtat portion) och extra fett vävnader.
- Finhacka hjärtat med tåttlangar i fina bitar.
- Ta en steril Pasteurpipett och skär dess spets i 45º vinkel.
- Använd denna Pasteurpipett för att dosera hjärtvävnaden i encellig suspension genom skonsam pipettering. Optimal matsmältning ger en suspension av encelliga kardiomyocyter.
OBS: Ta bort den smala, nedre delen av överföringsrören för att minska CM-skador på grund av mekanisk brännande. - Tillsätt 5 mL lösning B (Tabell 2) till CM-suspensionen och för lösningen genom en 100 μm cellsil för att avlägsna eventuella kvarvarande fettbitar eller annan icke-smält vävnad.
- Samla filtrate i en färsk 50 mL konisk injektionsflaska.
- Använd ytterligare 5 mL lösning B för att tvätta Petri-skålen och eventuell kvarvarande CM genom cellsilen.
- Ta bort hjärtat från Langendorff-perfusionssystemet. Flytta hjärtat till en 100 mm Petriskål fylld med 5 mL lösning A och flytta skålen till en biosäkerhetshuv.
5. Borttagande av icke-CMs
- Borttagande av icke-CMs från den vuxna encelliga fjädringen (musen)
- Centrifugera cellupphängningen vid 20 x g i 3 min.
- Kassera supernatanten och respend cellerna i 10 mL stopplösning (Tabell 1).
OBS: Om du ökar koncentrationen av BSA i stopplösningen kommer dess viskositet att öka och sedimenteringsgraden för icke-CMs minskas. - Resuspend den CMs genom mild inversion av röret 3-5 gånger.
- Med 3 min intervall, tillsätt 10 μL av 100 μM CaCl2 lösning och blanda. Upprepa tre gånger.
- Efter det fjärde tillägget, centrifug den kardiomyocyte suspensionen vid 20 x g i 3 min.
- Kassera supernatanten.
- Resuspend CMs i förvärmda (37 ºC), vuxna mus CM plätering media (Tabell 3).
- Avlägsnande av icke-CMs från de vuxna encells suspensioner (råtta)
- Pelletsceller vid 20 x g i 3 min vid 25 ºC.
- Kassera supernatanten och respend cellerna i 25 mL lösning B (Tabell 2).
- Blanda cellerna genom mild inversion och placera den i ett rör stativ så att CM att bosätta sig under gravitationen.
- Kassera supernatanten försiktigt.
- Resuspend cellerna i färska 25 mL av lösning B och titrera den till 1,0 mM CaCl2 genom stegvis tillsats av 50 μL, 75 μL, och 100 μL av 0,1 M CaCl2 med 3-5 min intervall.
OBS: En högre koncentration av BSA i lösning B skulle kunna användas vid detta steg. Öka koncentrationen av BSA i lösning B ökar viskositeten och därmed, minskar sedimenteringsgraden för icke-CMs. - Pelletsceller vid 20 x g i 3 min vid 25 ºC, aspirera supernatanten, och tillsätt önskad volym av vuxna råttcellskulturmedier (Tabell 4).
- Frö-Äs på en lamininbelagd platta.
OBS: Förplätering av CMs på en icke-belagd odlingsplatta kan användas för att minimera kontaminering av icke-CM-celler.
6. CM-plätering för vuxna
- Förplätering
- Resuspend kardiomyocyterna i kultur media.
- Förpläter cellerna i en 60 mm eller 100 mm maträtt för mus eller råtta CM, respektive.
- Inkubera CMs för 2 h i en inkubator kompletterad med 5% CO2 vid 37 ºC.
- Under inkubationen av förplattan, belägga cellodlingsplattorna med laminin (10 μg/mL i PBS) för långsiktig CM-odling.
- Efter 2 h av pre-plätering, samla in CMs i en 50 mL konisk injektionsflaska.
- Samla cellerna från skålen och re-platta dem till en laminin belagda 24 väl kultur plattan för transfection experiment.
- Odlingsceller i en inkubator vid 37 ºC kompletterad med 5% med CO2. 4-6 timmar är tillräcklig för att hålla sig till kardiomyocyterna med ytan, och därmed kan transfektion utföras 6 timmar efter plätering.
OBS: Det pläteringsmedium som innehåller FBS används vanligen och visar bättre kompatibilitet med spridningsstudier. Ett serumfritt medium kan dock användas för experiment där sekretoriska faktorer analyseras.
7. Transfektion
- Inkubera CMs till cellkultur plattorna belagda med laminin i 4-6 timmar.
- Fyra timmar efter CM-sådd på lamininbelagd platta, transfektceller med siRNAs (50 nM) av intresse med hjälp av en transfektionsreas (t.ex. Lipofectamine RNAiMAX) enligt tillverkarens protokoll.
- Byt media 24 timmar efter transfektion och var 24:e timme därefter i upp till 20 dagar.
- Efter 20 dagar, fixa celler med 4% PFA i PBS för nedströms applikationer, inklusive immunocytochemistry för hjärt-specifika markörer såsom Troponin att säkerställa levande kardiomyocyter var framgångsrikt odlade långsiktiga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det nuvarande modifierade protokollet möjliggör effektiv isolering och kultur av råtta och möss CMs in vitro. För rått CM isolering användes totalt 3 vuxna (12 veckor gamla) manliga Fischer 344 råttor i förfarandet. Bild 1 visar den kirurgiska apparaten och uppställningar isolering som krävs i förfarandet; varje del har markerats och beskrivits i figurlegenden. Kollagenas typ 2 användes för matsmältningen, som ger en hög mängd högkvalitativa CMs från framgångsrik isolering (Figur 2A). Tjugofyra timmar efter isolering, var dessa celler transfekterade med cellcykel förmå specifika siRNAs mot Rb1 och Meis2, medan, cel-miR-67 användes som transfektion kontroll iexperimentet 11. CMs bibehölls i kultur under antingen sju dagar (Figur 2B) eller upp till tjugo dagar (Figur 2C) för att observera de morfologiska förändringarna. För att poäng för cellcykelaktivitet, var CMs fast på dag 7 och färgas för hjärt-specifika markör Troponin-I, mitotiska markör KI67, och kärnan var visualiseras genom DAPI (Figur 2D-F). En signifikant ökning av KI67 positiva kardiomyocyter observerades med siRb1+siMeis2-behandling vid jämförelse med kontroll11. Dessutom var råtta kardiomyocyter slå (kontraktil funktion) i kultur på dag sju efter plätering, vilket är ett kännetecken som kännetecknar friska kardiomyocyter11.
För CM-isolering hos möss användes totalt 3 han- och 3 kvinnliga vuxna (12 veckor gamla) C57BL/6-möss i förfarandet. I likhet med råttstudien användes kollagenastyp 2 för att smälta kollagenet och den extracellulära matrisen hos de vuxna mössens hjärta. Vuxna möss CM är jämförelsevis bräcklig för isolering och kultur in vitro; således använder detta protokoll blebbistatin för att förbättra livskraften hos den vuxna musen CM. Framgångsrik isolering avkastning >70-80% frisk stav form CMs, som kan odlas i upp till 20 dagar (Figur 3A-C) och behålla sin hjärt Troponin-I färgning och kontraktilitet (Figur 3C). I separata experiment, fyra timmar efter isolering, mus-LEM var transfected med en cell cykel förmå siRNA cocktail som beskrivs för råttan CM. Kort, möss CM var samtidigt transfected med de specifika siRNAs mot Rb1 och Meis2, och kontroll (cel-miR-67). Post-transfection CMs var föremål för tid kurs bildbehandling för 10 dagar som visar de morfologiska förändringar (Figur 4) som följs av en spridning assay (Figur 5). Dag 10 utfördes immun-fluorescerande färgning för Troponin-I, KI67 och DAPI som tidigare beskrivits. En signifikant ökning av KI67 positiva kardiomyocyter observerades med siRb1+siMeis2-behandling vid jämförelse med kontroll (Figur 5A-C).
Det föreliggande protokollet visar att vuxna råttor och möss CMs kan odlas långsiktiga in vitro i upp till 20 dagar och potentiellt längre. Efter 20 dagar, CMs behålla sin Troponin-I färgning samt kontraktilitet om hämmare tas bort från media.
| Myocyte buffertkomposition, pH 7.4 (Förbered och kan förvaras vid 4 °C ) | |||
| Reagens | Koncentration, mM | Molekylär wt. | För 1 Liter |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6,6037 g |
| KCl | 4.7 | 74.5513 | 350,3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144,4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81,6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71,988 mg |
| Perfusionsbuffert, pH 7.4 (Förbered färsk för varje isolering) | |||
| Koncentration, mM | Molekylär wt. | Belopp som krävs | |
| Myocyte buffert | 250 mL | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595,75 mg |
| 2,3-butanedione monoximine | 10 | 101.105 | 252,775 mg |
| NaHCO3 Färska | 1.6 | 84.007 | 33,6028 mg |
| Taurin Färsk | 30 | 125.15 | 938,625 mg |
| Glukos Färska | 20 | 180.156 | 900,775 mg |
| Enzymlösning | |||
| Lager Conc. | Fungerande Conc. | Krävs | |
| Myocyte buffert | 50 mL | 50 mL | |
| Kollagenas typ 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 mg |
| Proteas XIV | >3,5 U/mg | 0,104 U/mL | 1,48 mg |
| DNase I årskurs 2 | 0,015 mg/mL | ||
| Stoppa buffert A | |||
| Lager Conc. | Fungerande Conc. | Krävs | |
| Myocyte buffert | 30 mL | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
| Stoppa buffert B | |||
| Lager Conc. | Fungerande Conc. | Krävs | |
| Myocyte buffert | 30 mL | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
Tabell 1: Lösningar som krävs för isolering av adult mus kardiomyocyte.
| 10x KHB Lager Lösning (Total volym= 1L) |
Reagens | Molaritet (mM) | Belopp (g) |
| Nacl | 1180 | 68,9 g | |
| KCl | 48 | 3,5 g | |
| HEPES | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1,4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 g | |
| Justera pH till 7,4 med 4 M NaOH (~20 mL), förvara vid 4 °C | |||
| KHB-lösning, 500 mL | Reagens | Belopp | |
| 10x KHB | 50 mL | ||
| Glukos | 0,99 g | ||
| Taurin | 0,31 g | ||
| Lägg H2O för att få volym till 500 mL, och pH bör vara ~ 7,35 | |||
| Lösning A | Reagens | Belopp | |
| KHB-lösning | 500 mL (10 mM) | ||
| Bdm | 0,5 g | ||
| Syresätta med 100% O2 och varm till 37 °C | |||
| Lösning B, 50 mL | Reagens | Belopp | |
| Lösning A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 μL | ||
| Lösning E, 50mL | Reagens | Belopp | |
| Lösning A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Kollagenastyp II (263 enheter/mg) | 35 mg | ||
| Hyaluronidase (Typ I-S) | 10 mg | ||
| 0,1 M CaCl2 lager | 12,5 μL | ||
| Blanda väl | |||
| CaCl2 Lager, 0.1M | Reagens | Belopp | |
| CaCl2 | 7,35 g | ||
| H2O | 500 mL | ||
| Förvaras vid 4 °C | |||
Tabell 2: Lösningar som krävs för isolering av råttadiomycyt för vuxna.
| Pläteringsmediets sammansättning, pH 7,4 | |||
| Fungerande koncentration | Molekylära Wt. | Obligatoriskt belopp | |
| Kulturmedier utan Blebbistatin | 50 mL | ||
| Bdm | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mg |
| Fbs | 5% | 2,5 g | |
| Kulturmedier sammansättning, pH 7,4 | |||
| Reagens | Fungerande koncentration | Molekylära Wt. | Obligatoriskt belopp |
| DMEM | 1X | 250 mL | |
| Insulin | 1 μg/mL | 0,25 mg | |
| Transferrin | 0,55 μg/mL | 0,138 mg | |
| Selen | 0,5 ng/mL | 0,125 μg | |
| Penicillin (U/mL)-streptomycin (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595,753 mg |
| *FBS | 10% | 25 mL | |
| *BSA | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292,338 g/mol | 1,8271 mg |
| *Använd någondera av dem, enligt försökskravet. # Aliquot kulturen media för att förbereda plätering media innan du lägger Till Blebbistatin. OBS: Förbered 200 mL odlingsmedia. OBS: Förbered 50 mL pläteringsmedia. |
|||
Tabell 3: Mediesammansättning för vuxenmus cardiomyocyte plätering och kultur.
| Kulturmedier sammansättning, pH 7,4 | ||
| Reagens | Fungerande koncentration | Obligatoriskt belopp |
| DMEM | 1x | 250 mL |
| Penicillin (U/mL)-streptomycin (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL |
| *FBS | 10% | 25 mL |
Tabell 4: Mediesammansättning för vuxen råtta kardiomycytplätering och kultur.
Bild 1: Procedurinställning och utrustning. (I) Schematisk representation av perfusionen. (II) Kirurgiska instrument och kanylnål. (III) Hjärtperfusionsmontering: A) Värmejacka. B) Dubbel vägg vatten jacka kärl. C) Cirkulerande uppvärmt vatteninlopp. D) Cirkulerande uppvärmt vattenutlopp. E) Hjärtperfusionslösning. F) Cirkulerande pump G) Perfusionslösningsrör. H) Syretillförselrör. I) Cirkulerande vattenbad. J) Kanylnål med hjärta, fäst vid perfusionsuttagsporten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Adult rat CM isolering, transfection, och långsiktig kultur. A) Vuxen råtta CM, omedelbart efter isolering. B) Vuxen råtta CM dag 7 efter isolering. C) Vuxen råtta CM dag 20. D-F) KI67 positiv råtta CM på dag 7 efter siRb1+siMeis2 transfection. Troponin-I = grön; DAPI = blå; KI67 = röd. Alla experimenten utfördes i två exemplar och upprepades minst tre gånger. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Vuxen mus CM isolering och långsiktig kultur. A) Vuxna möss CM, omedelbart efter isolering. B) Vuxna möss CM dag 7 efter isolering. C) Vuxna möss CM färgat med Hjärt Troponin-I = grönt på dag 20. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Vuxen mus CM de-differentiering. Vuxna möss CM som visar morfologiska förändringar under långtidskultur (dag 0 till dag 10) i DMEM-HG-media, kompletterat med 10%FBS. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Vuxen mus CM transfection och spridning. A-C) KI67 positiv mus CM på dag 10 efter siRb1+siMeis2 transfection. Troponin-I = grön; DAPI = blå; KI67 = röd. D) Bar graf visar en betydande ökning av KI67 positiva vuxna mus CMs i siRNA-cocktail transfected grupp kontra kontroll. Resultat presenteras som medelvärde±SEM; * = p-värde ≤0,05. p-värde ≤0,05 ansågs statistiskt signifikant. Alla experimenten utfördes i tre exemplar (n=3 Man,3 Kvinna). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett kritiskt behov av att upprätta ett protokoll för vuxna kardiomyocyte isolering och långsiktig kultur att utföra cell-specifika mekanistiska studier. Det finns bara ett fåtal rapporter diskuterar vuxna CM isolering protokoll, och ännu färre av dem används för långsiktig kultur av vuxna möss CM15,16,17. Det visas att den vuxna råttan CM har en högre tolerans mot in vitro-kulturen än de vuxna mössen CM10,11,12. I denna rapport upprättar vi ett protokoll för vuxna råtta och möss CM isolering, siRNA transfection, långsiktiga kultur och nedströms analys av inducerad spridning, med minimala ändringar i de regelbundet använda protokollen.
Tillgängliga protokoll för isolering av adult CM baseras på användning av två välkända enzymer, kollagenas och liberas, för extracellulärmatrisen (ECM) matsmältning18,19. Kollagenas är ett vanligt förekommande enzym i de vuxna CM-isoleringsprotokollen. Kollagenasen smälter kollagenfibrerna i ECM, vilket resulterar i dissociationen av hjärtvävnaden i singel-cell CM. På samma sätt smälter liberase ECM. Liberase är det renade alternativet för kollagenas, som visar högre aktivitet och därmed kräver högre precision under CM-isolering för att uppnå framgångsrik isolering i jämförelse med kollagenas. Dessutom, i förfarandet, märkte vi att CM isolerade med liberase inte överlever i den långsiktiga kulturen. Cm isolerade med kollagenas förbättrar dock livslängden för CM i kulturen villkor.
Dessutom använde vi en specifik myosin II-hämmare som kallas blebbistatin i kulturmedierna för den långsiktiga kulturen av vuxenmus CM20,21. Tidigare har 2,3-butanedione monoximine (BDM) använts för den vuxna CM-kulturen. BDM är en ATPase-hämmare som hämmar kontraktilfunktionen genom en dåligt definierad mekanism som inkluderar hämning av ATPase och nedsatt Ca++ övergång22. I jämförelse med BDM är blebbistatin en specifik hämmare av myosin II och visar mer signifikant hämning av kontraktil funktion vid lägre koncentrationer än BDM. En pre-plating av den vuxna musen CM i en kultur media, kompletteras med 10 mM av BDM och efterföljande kulturer av CM i 25 μM blebbistatin-kompletteras och låg serum media förbättrar överlevnadsförmåga och stav form struktur CM i långsiktig kultur. En direktplätering av den vuxna musen CM i media, kompletterad med 25 μM blebbistatin och 10% FBS är dock bättre för proliferativa studier. I likhet med den vuxna råttan CM, som visar en stor grad av de-differentiering i in vitro-kulturen, observerade vi också de-differentiering i den vuxna musen CM i viss utsträckning (Figur 5). Morfologiska förändringar är det nödvändiga steget för spridningen. Att tillhandahålla en miljö till vuxna CM som underlättar deras de-differentiering är således en kritisk faktor att beakta i sådana studier. Även om det vid denna tid, är det inte klart vilken av de exakta steg eller komponenter som används i detta protokoll är ansvarig för den förbättrade livslängden för vuxna CMs, vi tror att det är en kombinationseffekt av de reagenser som används, de ändringar som gjorts i isoleringsförfarandet, och kanske viktigast av allt de utbildade händerna.
I likhet med de tidigare rapporterna som visar viral transduktion av vuxna CM i blebbistatin-kompletterade media, observerade vi också en effektiv transfektion av dessa celler med siRNAs. Vi använde specifika siRNAs mot två senescence-associerade gener, Rb1 och Meis2, att inducera CM spridning. För råttan CM utförde vi KI67-analys för att bedöma proliferationen dag sju efter transfection; dock, spridningen i musen vuxen CM analyserades på dag tio efter transfection. En artspecifik biologisk variabilitet skulle kunna vara en möjlig orsak till den observerade tidsskillnaden i den inducerade cellcykeln återinträde av vuxen råtta och mus CM.
Sammantaget, protokollet som beskrivs här ger en förbättrad, tillförlitlig, och jämförande förfarande för att isolera vuxna råtta och mus CM, och följaktligen kultur dem enligt experimentella behov. Dessutom tillåter detta protokoll en långsiktig kultur av den vuxna CM, som ger ett in vitro-system för att utföra olika långsiktiga analyser såsom spridning, paracrine faktor, stressrespons, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från institutionen för patologi och laboratoriemedicin, University of Cincinnati, College of Medicine, till Dr Onur Kanisicak; ett anslag från National Institutes of Health (R01HL148598) till Dr Onur Kanisicak. Dr Onur Kanisicak stöds av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr Perwez Alam stöds av American Heart Association postdoktoralt bidrag (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey stöds av ett NIH T32-bidrag (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
