Summary
在这里，我们提出了一个非侵入性心电图（ECG）协议，针对早期产后小鼠进行了优化，不需要使用麻醉剂。
Abstract
心电图 （ECG） 长期以来一直被视为一种有效可靠的方法，用于评估人类和动物疾病模型中的心血管（和心肺）功能。个人心率、节律和规律性，结合从心电图收集的定量参数，有助于评估心脏传导系统的完整性以及心脏周期的综合生理学。 本文全面介绍了用于在产后第一天对围产期和新生儿小鼠幼崽进行非侵入性心电图的方法和技术，无需使用麻醉剂。该协议旨在直接满足对在新生小鼠中获取心电图的标准化和可重复方法的需要。从转化的角度来看，该协议证明完全有效，可用于使用转基因小鼠线产生的先天性心肺缺陷的表征，特别是用于分析在产后第一天或产后造成致命性的缺陷。该协议还旨在直接解决科学文献中与早期产后心脏传导系统成熟相关的特征和提供规范性数据的差距。这种方法不仅限于特定的产后时间点，而是允许在新生儿小鼠幼崽从出生到产后第10天（P10）中收集心电图数据，这一窗口对于在体内模拟人类疾病至关重要，尤其侧重于先天性心脏病（CHD）。
Introduction
心脏功能可以用不同的方式测量，其中最常见的包括使用心电图（ECG）来分析电流通过心脏的传导，以及其整体心脏周期和功能1。心电图仍然是一个有用的诊断工具，用于识别和描述心脏异常在人类和动物模型的疾病1，2。心电图读数中的不规则性可发现在异常心脏发育（即先天性心脏病 （CHD））中，并且可包括心律失常，表现为心率变化（例如心动过速）和节律变化（例如"心脏块"），暗示基础心肌完整性和/或功能的缺陷。诸如此类的变化可能使患者容易出现危及生命的心脏功能障碍（例如充血性心力衰竭和/或心脏骤停），死亡率增加 3，4。鉴于严重和未经治疗的CHD死亡率很高，在产后早期制定一种标准化和可重复的收集心电图的方法至关重要。
虽然我们不是第一个解决这个问题的方法，以前收集心电图对小鼠幼崽的方法传统上包括侵入性程序（皮下针或电线电极）和/或使用麻醉剂5，6，7。执行无创心电图分析的优点包括尽量减少疼痛和消除对动物的压力。虽然实验者仍必须谨慎避免引起幼崽应力，但该装置旨在避免常见的应力，以便生成准确的数据。在评估心脏功能的背景下，将麻醉引入可能具有心肺异常的动物可能会掩盖甚至加剧基础疾病。麻醉剂通过改变细胞的去极化和/或再极化来影响电传导。最后，使用麻醉可以增加新生幼崽体温过低的风险，这可能进一步混淆任何固有的病理学。以下协议不引入任何麻醉剂，侵入性程序，或明显的不适小狗。一旦设备设置完成，设备设置和涉及动物的数据收集可以有效地完成，之后幼崽可以返回给其母亲。此外，该系统允许重复和/或连续分析，这是理想的实验需要分析随着时间的推移，引入药理疗法等。
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Protocol
以下协议遵循新英格兰大学机构动物护理和使用委员会的标准。密切观察协议应提供令人满意的心电图读取在所有检查的新生儿（n > 70）。
1. 设备准备
- 将设备插入计算机的 USB 端口，并下载 ECG 软件。测量装置将自动开始加热至 （37 °C/98.6 °F）。内部加热单元包含在测量单元中，仅加热塑料表面。银线电极未加热。
- 表面达到温度大约需要 15 分钟。利用这段时间收集和设置动物。
注：此时可能会暂停协议，平台可以长时间保持插入和加热。在没有自加热电极平台的情况下，动物安全加热垫也可以用来防止母幼体温过低。
2. 动物制剂
- 收集母亲和幼崽，并留在住房笼内，直到准备收集。
- 一旦测量单元加热到温度，从笼中取出鼠标幼崽，然后用喷洒在湿巾上的 70% 乙醇擦拭胸部。将小狗放在塑料的加热表面上。
- 让鼠标在黑暗中适应表面约2-5分钟。
3. 鼠标和电极平台设置（电极应用）
- 使用金属铲、探针或木制定位销收集一小滴胶粘剂、导电凝胶（一种快速干燥的高导电电极凝胶，通常用于啮齿动物电极的放置）。
注：任何非纤维的固体物体都可用于应用导电凝胶，只要该物体不会将合成纤维或类似材料留在电极上，否则可能会干扰电信号的质量。 - 使用铲/定位销，轻轻触摸四个电极表面的顶部，轻轻按下并以倾斜角度将导电凝胶拉离电极结构中心。确保每个电极都完全覆盖在凝胶上。
注意：此步骤对于确保导电电极凝胶不会粘附在单个电极上非常重要。在电极之间形成粘合链可能会传导电荷，并可能干扰或短路所需的电信号。此时不应暂停协议，因为凝胶将开始凝固并成为粘附。确保在应用导电凝胶（或等效导电电极凝胶替代）后 5-10 分钟内将鼠标固定到平台上。 - 将金属铲或木制定位销与凝胶的其余部分放在一边。
- 将新生儿小鼠幼崽胸骨放下，容易与小狗的头朝向平台的外向USB边缘。确保幼崽胸部的一部分覆盖四个电极。轻轻地将幼崽的前臂侧部，同时按住约 1 分钟，让导电凝胶得到设置。
- 将橡胶硅胶保险杠放在小狗的左右两侧。保险杠应固定小狗的每一侧，并提供稳定性，以防止鼠标的过度移动，但不应该阻止鼠标的所有移动。安装后，请观察鼠标片刻，并根据需要调整保险杠放置。
注意：不要将鼠标压缩得太紧，因为这可能干扰呼吸力学和呼吸速率。 - 使用预留的定位销将剩余的导电凝胶涂抹到接地尾电极上，并放在幼崽的臀部上。在释放幼崽之前施加温和的压力，让凝胶被设置。
- 将最后的硅保险杠放在鼠标的臀部顶部，以将接地电极固定到位。
注意：放置最终保险杠时不要施加过大的力，因为这可能会导致小狗不适和/或取代接地电极。 - 抓住整个平台，轻轻地放在法拉第笼子里。
注意：小心谨慎，确保顶部硅胶保险杠不会在法拉第笼就位后被移位。 - 在录制之前，请确保鼠标幼崽不会过度移动，并确保鼠标的身体和头部看起来安全。
注意：确保老鼠幼崽的头能够在保险杠内自由移动，并且不会完全向下鼻子进入平台。凸起的平台设计为稍微抬起鼠标胸部，防止窒息，但应密切监控。
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Representative Results
理想的心电图具有清晰、突出的信号，允许以不同的时间范围分析所有波（图1）。实验室最初采用一种定制应用的肌电学仪器来产生质量不理想的心电图，这只能让我们分析心率等基本参数（图S1）。这启发了与一家公司合作开发一种新颖的原型ECG设备，专门用于分析早期产后小鼠幼崽。
质量差的读数没有明显的节拍，显示明显的干扰，并且在读数中具有波或不一致（图2）。要达到最高质量的心电图，请仔细遵循说明。使用导电凝胶时要小心，因为凝胶是中度粘合剂，可能需要额外时间让鼠标适应设备。通过这样做，它降低了鼠标移动的风险，电极短路，并正确使用设备。应将鼠标放置在设备上，以便头部朝向将设备连接到 USB 端口且处于容易位置的电源线（图 3）。鼠标应用橡胶保险杠固定，以将它们牢牢地固定到位，两个在侧面，一个在顶部（图3）。这些保险杠应固定鼠标，但不应阻止鼠标移动其头部。鼠标的布局对于读取非常重要，因为引线是静止的。将引线设置为前两个电极为引线 I（图3）。后两个电极为引线 II 和 III，接地电极位于幼崽的臀部（图3）。用这种方式设置鼠标将提供更好的结果。
使用的程序允许分析程序中的 ECG。这提供了对心率、R-R 间隔、QRS 复杂间隔、QT 间隔和 PR 间隔等关键方面的分析。鉴于这一能力，有可能为围产期小鼠建立一组规范值（表1）。这些规范性结果基于出生后一天内对小鼠进行分析。发现平均心跳为每分钟357.2次（bpm）。平均 R-R、QRS、QT 和 PR 间隔分别为 169.1、16.9、45.4 和 36.3 毫秒 （ms）， 表1）。重要的是，该设置可用于分析患有先天性心脏缺陷的新生儿小鼠的心电图模式（图S2）。
| 小狗年龄 | 大道/STDEV | 心率（bpm） | R-R 间隔（女士） | PR 持续时间（女士） | QRS 持续时间（女士） | QT 持续时间（女士） | ST 持续时间（女士） | T 持续时间（女士） | P 持续时间（女士） |
| P1 | 平均 | 357.2 | 169.1 | 36.3 | 16.9 | 45.4 | 16.4 | 18 | 12.8 |
| 标准偏差 | 36.3 | 20 | 10.9 | 5.8 | 16 | 7.4 | 7.2 | 3.1 | |
| P3 | 平均 | 412.4 | 149.2 | 46.4 | 14.5 | 53 | 22.3 | 16.2 | 14.8 |
| 标准偏差 | 55.4 | 21.4 | 6.8 | 11 | 12.2 | 6.9 | 4.6 | 3.1 | |
| P5 | 平均 | 505.5 | 119.2 | 46.7 | 11.7 | 51.3 | 20.8 | 18.8 | 14.2 |
| 标准偏差 | 19.2 | 4.6 | 13.3 | 5.8 | 8.1 | 11.4 | 4.6 | 2.3 | |
| P7 | 平均 | 555.3 | 108.7 | 40 | 9.5 | 43.6 | 20.3 | 13.7 | 14 |
| 标准偏差 | 34.2 | 7 | 2.5 | 0.6 | 6 | 7.1 | 3.2 | 2.7 |
表1：平均围产期小鼠P1、P3、P5和P7的ECG测量结果。
图1：在产后第一天（A、P1.0）、第三（B、P3.0）和第七（C、P7.0）的新生儿小鼠身上，有代表性的心电图读取。
（A-C）图像表示使用 2 铅非侵入性设备进行高质量 ECG 跟踪的示例，该设备在 1.5 s 的读数帧中捕获。良好的心电图读取的显著特征包括清晰、可辨的节拍，如存在一致的 P 波，然后是 QRS 复合物和随后的 T 波，在每个产后时间点的两个引线 I-II 中可见。示例还包括低信噪比（最小伪影）和可辨别的等电线。顶部心电图条（红色）：铅 I;底部心电图条（绿色）：铅II。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：代表性心电图读与并发症。
此图像代表在产后第一天使用 2 铅无创设备（P1.0）的劣质心电图读数。以上图像是在 1.5 s 的阅读帧中拍摄的。低质量的心电图追踪的特点是没有明显的节拍（和特定的心脏循环波形），以及明显的伪影（高信号：噪声比），以及给定小鼠幼崽的引线一和II之间明显不一致。为了改进这种心电图，装置和硅胶保险杠都固定幼崽，需要在法拉第笼子里重新定位。为了尽量减少电磁干扰，需要拆除设备附近的所有移动设备。最后的故障排除措施将涉及在设备电极上重新定位小鼠幼崽，并且/或需要（重新）应用更多的导电凝胶。顶部心电图条（红色）：铅 I;底部心电图条（绿色）：铅II。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：放置小鼠幼崽和肢体铅电极，用于收集产后早期心电图。
（A ） 左： 鼠标在法拉第笼（黑色）电极平台上放置的前部透视。 右侧： 横向视图，说明在凸起的电极/平台上正确放置鼠标;支持硅胶保险杠（无图）被放置在法拉第笼子里的老鼠幼崽的两侧和顶部。（B） 双极肢体引线和电极放置在新生儿小鼠上。插图描绘了小鼠幼崽腹腔表面每个凸起电极的接触点。（B，C）电极放置、胸部铅定向度和 （ C ）对应、有代表性的 ECG 追踪，从 P1.0 的新生儿小鼠幼崽（铅 I（红色）;二号铅（绿色）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在多产后时间点对新生儿小鼠进行代表性心电图追踪。
代表性心电图读取（前2个痕迹）和图示的心脏周期（下排）从新生儿小鼠幼崽的第一个（A，P1.0），第三（B，P3.0）和第七（C，P7.0）产后一天。每个图像代表一个模范的ECG跟踪使用2铅，非侵入性设备，捕获在1.5秒的读数帧（A-C，铅一（顶部/红色）;铅 II（底部/绿色）。虽然单个波形看起来确实随着年龄的增加而发生形态变化，但显著且一致的特征包括清晰、可辨别的节拍，如一致 P 波的存在，然后是 QRS 复合物和随后的 T 波，在每个产后时间点的线索 I-II 中可见。请单击此处查看此图的较大版本。
图S1：传统肢体铅电极图解，用于产前早期心电图的非侵入性采集。 （A， 左）在法拉第笼（盒子）内放置鼠标和电极的横向视图。（B） 传统的自棒皮肤电极位于幼崽的后面。（A， 右）使用传统的肌电图传感器来解释ECG样信号，以产生仅在铅II（C、底部）中可辨别的极简式心电图跟踪。（B-C）电极放置、胸部铅定向，以及从P1.0（铅II;紫色）从新生儿小鼠幼崽进行相应的、有代表性的心电图追踪。 请点击这里下载此图。
图S2：比较心电图读取从垃圾伴侣控制幼崽和突变幼崽与先天性心脏病在产后的第一天（P1.0）。（A，B）图像代表从健康的新生儿幼崽（A， CONTROL） 与在P1.0出生时的 CHD （B， CHD MUT） 幼崽相比的高质量心电图追踪的例子。2 引线，非侵入性设备用于捕获心电图跟踪在10.0（A，B，顶部）和1.5秒的间隔（A，B，底部）。在CHDMUT（B）中，心率的明显差异是显而易见的，如在给定时间范围内可见的心脏周期（复合体）数量减少所表示的。与对照（A）相比，比较亦显示CHDMUT（B）中QRS波形、频率及心脏周期的整体形态不规则。铅一（红色）;二号铅（绿色）。请点击这里下载此图。
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Discussion
围产期第1天收集的数据点略低于成年小鼠的平均预期值（每分钟500-700次）。8随着鼠标年龄的增长，心率会增加，这更符合预期值（表1）。然而，必须强调，新生儿价值观是这一范围的较低端，支持规范性价值观应以特定年龄的方式记录的想法。此方法不同于其他心电图方案，因为小鼠没有身体创伤。该协议是完全无创的，不需要使用麻醉，是最佳小鼠在出生后立即。没有其他心电图设备允许幼崽以这种方式分析9，10，11。该协议旨在建立可靠的参考方法，以生成针对新生儿小鼠种群但适用于人类儿科人群的规范数据。
当对这么小的动物进行心电图检查时，所有步骤都要小心。但是，有几个关键步骤可以改变结果的质量。第一种是应用导电凝胶。如果凝胶太多，电极连接和短路的机会将更高。如果凝胶不足，将没有安全连接。应用凝胶的最佳方法是从外角接近电极，将凝胶滚动到电极顶部。非常重要的是，要格外小心，确保电极之间没有螺纹，这会干扰电气活动的存在和/或质量。取一个薄工具（例如钳子），并在电极之间运行，以收集任何可能明显不可见的杂散螺纹，可能很有用。虽然不是协议中正式要求的一部分，但此额外步骤可以作为额外的预防措施，以确保最佳传导和最小噪音。
如果存在静电导致心电图不可读（图2），则从立即（桌面）附近移除所有电子设备可能很有用。如果附近的任何电子设备都在移动，这尤其有用，因为ECG记录设备12可以拾取这种移动。在数据收集过程中不要引入任何外部移动也很重要。可能干扰 ECG 质量的外部运动可能包括将物体放在附近的同一表面上，并且必须避免，直到读数完成。除了外部设备外，非常活跃的小鼠幼崽还可能导致与身体过度运动相关的电气干扰。随着幼崽的成熟，这种类型的肌肉骨骼干扰的可能性增加，在选择数据收集年龄时应考虑这一点。如果幼崽从电极上移出，从而显著损害ECG读数的质量，则应考虑重新定位幼崽。在选择重新应用电极凝胶之前重新定位鼠标在大多数情况下可以提供更好的结果，并节省额外的时间和试剂。在重新定位小狗之前，请在软件中选择暂停按钮。暂停运行将停止 ECG 的活动录制，但将继续跟踪时间。请注意，恢复录制时，ECG 将在比暂停的时间晚出现。将设备平台从法拉第时代滑出，鼠标仍位于保险杠之间。拆下鼠标周围的保险杠，轻轻将小狗从电极上提起。按照轻轻握住鼠标的相同协议，将小狗重新定位到电极上，让凝胶粘附 1 分钟（步骤 3.4-3.5）。尝试重新定位鼠标，使电极位于上肢之间的胸部（图3）。虽然设计为在新生儿小鼠中收集心电图的理想、非侵入性方法，但与此协议相关的一个限制是，与未麻醉小鼠的数据收集相关的移动性增强，因为小鼠也可能在设备上移动和移动，这将影响读取质量。虽然使用硅胶保险杠的定位可能会限制运动，但如果不使用静静或麻醉，就无法防止这种活动。
在ECG记录具有严重干扰的情况下（图2），尽管已经尽量减少了所有电气干扰，但下一步应该采取的是将连接记录平台的外部线路重新定位到法拉第笼。在数据采集过程中，外部布线保持与记录平台正确连接非常重要。如果重新定位外部布线，请务必在两端小心地重新连接此接线，直到获得更清晰的记录。如果使用与设备一起提供的法拉第笼不合适，该设备可用于其他法拉第笼。
如果记录不清晰或鼠标从电极上移出，请将鼠标从设备中取下，然后通过钳子并取出所有导电凝胶来清洁电极。由于导电凝胶是水溶性的，人们也可以使用温水轻轻地去除幼崽皮肤上多余的凝胶。重新应用凝胶并重新定位小狗。
要获得最佳效果，请确保每次使用前和之后都正确清洁设备。凝胶确实干燥，可以使用钳子将其从设备中拔出，但凝胶是水溶性的，因此可以使用湿布清洁记录平台的电极。
年龄较大的小鼠在记录过程中更加活跃，因此密切监视它们非常重要，因为它们经常从电极中移动，甚至可以离开设备平台。虽然清晰读取可能不会马上发生，但通过故障排除和重新定位，已成功地获得此设备的可用录制（图 1）。活跃的小鼠可能需要返回给母亲，并在休息后重新分析。它们也可以放在手掌上，轻轻盖住，以提供热量和黑暗，直到小狗安顿下来。
该装置旨在收集从出生到P10的小鼠幼崽的ECG数据（图4）。比P10还老的小狗可能无法与法拉第笼配合使用，而法拉第笼是最大限度地提高信号与噪声比的基本组成部分。即使在 P10，也可能需要进行定位调整，以适应更大的机身尺寸。将设备移动至法拉第笼时，请格外小心。拆卸顶部保险杠将允许鼠标躺在电极平台上与周围的法拉第笼。鉴于这个年龄的小鼠更活跃，它们更容易在没有顶部保险杠稳定的情况下离开电极。顶部保险杠也可以放置在小狗前面，以帮助阻止小狗离开设备。
该装置和相应协议的新颖性包括出生后立即使用的优化、系统适应更宽年龄范围（P1-P10）的能力，以及此方法扩展体内研究方法在心血管生理学及以后领域的转化应用的需求。虽然利用超声心动图来量化新生儿小鼠心脏周期的精密设备13，但该协议的一大优点是，它允许一种相对简单和负担得起的方法，以解决基本的电生理参数，这是非常有吸引力的，在目前的科学资助环境。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢拯救小红心协会（KLT），UNE COBRE计划的慷慨支持（NIGMS赠款编号P20GM103643;LAF），和新英格兰大学（VLB）的S SURE研究金计划，以及阿希什莫尔（iWorx，Dover，NH）的患者技术支持。图 3、图 4 和图 S1 是使用 Biorender 软件创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabScribe4 | iWorx | LabScribe4 | Software used to record ECG |
| Neonatal Mouse ECG & Respiration System | iWorx | RS-NMECG : Neonatal Mouse ECG | ECG device |
| Tensive Conductive Adhesive Gel | Parker Laboratories, Inc | 22-60 | Tac-gel used as conductive gel for ECG |
References
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