共焦点顕微鏡による単細胞自然蛍光シグネチャの再構築
Summary
ここでは、3次元空間に分布する全ての個々の生細胞から自然な細胞蛍光シグネチャ(すなわち細胞自家蛍光)を光学的に抽出およびカタログするためのプロトコルが提示される。この方法は、細菌、真菌、酵母、植物、および動物からの細胞を含む単一細胞分解能で、多様な生物学的系の自然蛍光シグネチャを研究するのに適しています。
Abstract
ここで説明するのは、共焦点反射顕微鏡支援単一細胞自然蛍光分析(CRIF)であり、3次元(3D)空間に分布する集団内の各個体の生細胞からの自然な細胞蛍光シグネチャを再構築するための低侵襲的な方法である。細胞の自然蛍光シグネチャは、細胞内の様々な生体分子によって放出される蛍光シグナルの集合体です。これまでの研究では、自然蛍光シグネチャは、様々な細胞特性と生理学的状態の違いを反映し、細胞の特性評価と同定のための豊富な情報源であることを確立しました。自然蛍光シグネチャは、伝統的に母集団レベルで分析されてきたが、単細胞レベルではクローン培養を必要としない。CRIFは、個々の細胞からの蛍光シグナルの3D分解能および/または選択的抽出を必要とする研究に特に適しています。蛍光シグネチャは細胞の自然な性質であるため、CRIFは、無傷および単一細胞のタイプおよび/または生理学的状態のタグフリー予測にも適しています。この方法は、異種集団における各単一細胞の表現型を、細胞タグ付けなしで顕微鏡下で自己蛍光シグネチャによって直接評価することができる、合理化された細胞分析のための強力なツールであり得る。
Introduction
セル1内の多様な生体分子は自己蛍光シグナルを放出し、細胞の自然蛍光シグネチャはこれらのシグナルの集合体から成る。このシグネチャー蛍光は、様々な細胞特性および生理学的状態の違いを反映しています。自然な蛍光の分析は、低侵襲であり、完全な細胞破壊に軽度の代謝修飾から痕跡の範囲を残す伝統的な、より侵襲的な微生物学的プローブを補完することができます。DNAや細胞内容抽出2,3、蛍光インストハイブリゼーション4、および蛍光レポーター遺伝子のゲノムへの導入は、細胞の種類や生理学的状態の決定に有効であるが、一般的には細胞の操作または侵襲的なタグ付けのいずれかが必要である。
バルク微生物培養懸濁液5,6、活性汚泥7、哺乳動物組織8,9、および哺乳動物細胞1,10を含む様々な生きた微生物コロニーの自然な蛍光の研究は、自然な蛍光分析が細胞型および生理学的状態のタグフリー分析を促進することを示した。自然蛍光シグネチャは、従来、単細胞レベルではなく集団レベルで分析されてきたため、クローン培養が必要です。これに対し、このコンフォーカル・レンレクシス法は、コンフォーカル・レンレクシス法を支援する単細胞中華離性の分析(CRIF)技術111を、個々の生きた微生物細胞の自然な細胞蛍光シグネチャを再構成およびカタログ化する。さらに、CRIFは、3次元(3D)空間に分布する集団内の単一の微生物細胞の自然蛍光シグネチャを体系的に照合することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
再現性のある結果を得るために密接に従う必要があるこの方法の2つの重要なポイントがあります:1)励起波長と実験を通じて顕微鏡目的の下でレーザー出力を一貫して保ち、2)正確な細胞セグメンテーションを行います。
最初の点は、異なる実験間で自然蛍光シグネチャを比較する際に特に重要です。最大出力出力はレーザーライン間で大きさが大きく異なる場合がある?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、文部科学省(18K04843)からY.八幡、JST ERATO(JPMJER1502)から野村への科学研究助成によって支えられた。
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
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