Her præsenteres en protokol til optisk udvinding og katalogisering af medfødte cellulære fluorescenssignaturer (dvs. cellulær autofluorescence) fra hver enkelt levende celle fordelt i et tredimensionelt rum. Denne metode er velegnet til at studere den medfødte fluorescenssignatur af forskellige biologiske systemer ved en enkeltcellet opløsning, herunder celler fra bakterier, svampe, gær, planter og dyr.
Beskrevet her er konfokal refleksion mikroskopi-assisteret single-celle medfødt fluorescens analyse (CRIF), en minimalt invasiv metode til rekonstruktion af den medfødte cellulære fluorescens signatur fra hver enkelt levende celle i en befolkning fordelt i en tre-dimensionel (3D) rum. Den medfødte fluorescens signatur af en celle er en samling af fluorescens signaler udsendes af forskellige biomolekyler i cellen. Tidligere undersøgelser fastslog, at medfødte fluorescenssignaturer afspejler forskellige cellulære egenskaber og forskelle i fysiologisk status og er en rig informationskilde til cellekarakterisering og identifikation. Medfødte fluorescenssignaturer er traditionelt blevet analyseret på befolkningsniveau, hvilket nødvendiggør en klonisk kultur, men ikke på encellet niveau. CRIF er særligt velegnet til undersøgelser, der kræver 3D-opløsning og/eller selektiv udvinding af fluorescenssignaler fra de enkelte celler. Fordi fluorescenssignaturen er en medfødt egenskab af en celle, er CRIF også velegnet til tagfri forudsigelse af typen og / eller fysiologisk status for intakte og enkelte celler. Denne metode kan være et kraftfuldt værktøj til strømlinet celleanalyse, hvor fænotypen for hver enkelt celle i en heterogen population kan vurderes direkte ved sin autofluorescence signatur under et mikroskop uden cellemærkning.
Forskellige biomolekyler i en celle1 udsender autofluorescence signaler, og den medfødte fluorescens signatur af en celle består af samlingen af disse signaler. Denne signatur fluorescens afspejler forskellige cellulære egenskaber og også forskelle i fysiologisk status. Analyse af medfødt fluorescens er minimalt invasiv og kan supplere traditionelle, mere invasive mikrobiologiske sonder, der efterlader en række spor fra mild metabolisk modifikation til fuldstændig celledestruktion. Mens traditionelle teknikker såsom DNA eller celleindhold ekstraktion2,3, fluorescerende in situ hybridisering4, og indførelsen af fluorescerende reporter gener til genomet er effektive til at bestemme celletype eller fysiologisk status, de almindeligvis kræver enten manipulation af cellerne eller invasive mærkning.
Undersøgelser af medfødt fluorescens af forskellige levende og intakte mikrobielle kolonier, herunder bulk mikrobielle kultur suspensioner5,6, aktiv slam7, pattedyr væv8,9, og pattedyr celler1,10, har vist, at medfødt fluorescens analyse letter tag-fri analyse af celletyper og fysiologisk status. Medfødte fluorescenssignaturer er traditionelt blevet analyseret på befolkningsniveau og ikke på enkeltcelleniveau og kræver dermed en klonisk kultur. I modsætning hertil rekonstruerer og katalogiserer den confokale reflection-mikroskopi-assisteret enkeltcellet innat fluorescence-teknik (CRIF), der er beskrevet her, den medfødte cellulære fluorescenssignatur for hver enkelt levende mikrobiel celle. Desuden kan CRIF systematisk samle den medfødte fluorescenssignatur for en enkelt mikrobiel celle i en population, der er fordelt i et tredimensionelt (3D) rum.
Der er to kritiske punkter i denne metode, der skal følges nøje for at opnå reproducerbare resultater: 1) holde laser effekt under mikroskop mål konsekvent gennem excitation bølgelængder og eksperimenter, og 2) udføre nøjagtige celle segmentering.
Det første punkt er særlig vigtigt, når man sammenligner den medfødte fluorescenssignatur mellem forskellige eksperimenter. Undgå blot at anvende de samme “procent output” indstillinger til excitation bølgelængder (dvs. ved hjælp af 5…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev delvist støttet af et tilskud til videnskabelig forskning fra Japans ministerium for uddannelse, kultur, sport og teknologi (18K04843) til Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) til N. Nomura.
Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |