Ici, un protocole est présenté pour extraire optiquement et cataloguer les signatures de fluorescence cellulaire innée (c’est-à-dire l’autofluorescence cellulaire) de chaque cellule vivante individuelle distribuée dans un espace tridimensionnel. Cette méthode convient à l’étude de la signature de fluorescence innée de divers systèmes biologiques à une résolution unicellulaire, y compris les cellules de bactéries, de champignons, de levures, de plantes et d’animaux.
L’analyse de fluorescence innée unicellulaire (CRIF) assistée par microscopie confocale assistée par microscopie à réflexion confocale est décrite ici, une méthode mini-invasive pour reconstruire la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule vivante individuelle dans une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D). La signature de fluorescence innée d’une cellule est une collection de signaux de fluorescence émis par diverses biomolécules à l’intérieur de la cellule. Des études antérieures ont établi que les signatures de fluorescence innées reflètent diverses propriétés cellulaires et différences d’état physiologique et constituent une riche source d’information pour la caractérisation et l’identification cellulaires. Les signatures de fluorescence innées ont traditionnellement été analysées au niveau de la population, nécessitant une culture clonale, mais pas au niveau de la cellule unique. CriF est particulièrement adapté aux études qui nécessitent une résolution 3D et/ou une extraction sélective des signaux de fluorescence de cellules individuelles. Parce que la signature de fluorescence est une propriété innée d’une cellule, CRIF convient également à la prédiction sans étiquette du type et / ou de l’état physiologique des cellules intactes et uniques. Cette méthode peut être un outil puissant pour l’analyse cellulaire rationalisée, où le phénotype de chaque cellule dans une population hétérogène peut être directement évalué par sa signature d’autofluorescence sous un microscope sans marquage cellulaire.
Diverses biomolécules au sein d’une cellule1 émettent des signaux d’autofluorescence, et la signature de fluorescence innée d’une cellule consiste en l’assemblage de ces signaux. Cette fluorescence caractéristique reflète diverses propriétés cellulaires ainsi que des différences d’état physiologique. L’analyse de la fluorescence innée est peu invasive et peut compléter les sondes microbiologiques traditionnelles plus invasives qui laissent une gamme de traces allant d’une légère modification métabolique à la destruction cellulaire complète. Bien que les techniques traditionnelles telles que l’extraction de l’ADN ou du contenu cellulaire2,3, l’hybridation fluorescente in situ4 et l’introduction de gènes rapporteurs fluorescents dans le génome soient efficaces pour déterminer le type de cellule ou l’état physiologique, elles nécessitent généralement une manipulation des cellules ou un marquage invasif.
Des études sur la fluorescence innée de diverses colonies microbiennes vivantes et intactes, y compris les suspensions de culture microbienne en vrac5,6, les boues actives7, les tissus de mammifères8,9 et les cellules de mammifères1,10, ont montré que l’analyse de fluorescence innée facilite l’analyse sans étiquette des types de cellules et de l’état physiologique. Les signatures de fluorescence innées ont été traditionnellement analysées au niveau de la population et non au niveau de la cellule unique, et nécessitent donc une culture clonale. En revanche, la technique d’analyse de fluorescence inéscence unicellulaire assistée par microscopie unicellulaire assistée par réflection confocale11 décrite ici reconstruit et catalogue la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule microbienne vivante individuelle. De plus, criF peut systématiquement rassembler la signature de fluorescence innée d’une seule cellule microbienne au sein d’une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D).
Il y a deux points critiques dans cette méthode qui doivent être suivis de près pour obtenir des résultats reproductibles: 1) maintenir la puissance de sortie laser sous l’objectif du microscope cohérente à travers les longueurs d’onde d’excitation et les expériences, et 2) effectuer une segmentation cellulaire précise.
Le premier point est particulièrement important lorsque l’on compare la signature de fluorescence innée entre différentes expériences. Évitez d’appliquer…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue en partie par une subvention pour la recherche scientifique du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports et de la Technologie du Japon (18K04843) à Y. Yawata, du JST ERATO (JPMJER1502) à N. Nomura.
Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |